草甘膦抗性提高的葡萄epsps突變體的制備及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種采用DNA分子重排（DNAShuffling）技術獲得了草甘膦抗性增強的來源于葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼基因與應用。所述突變體含有7個突變位點，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其編碼的堿基序列如SEQIDNo.2所示。試驗表明，本發明的來源于葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼的基因，同時具有較高的草甘膦抗性和較強的與PEP親和性，這些特性將為該基因用于抗草甘膦轉基因作物的培育提供了可能。
【專利說明】草甘滕抗性提高的葡萄EPSPS突變體的制備及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬微生物領域，涉及一種來源于葡萄（Kiiis rifli/era)的5-烯醇丙酮莽 草酸-3-磷酸合成酶（EPSP合酶/EPSPS)多位點突變體制備及其編碼基因與應用，具體涉 及一種利用DNA分子重排（DNA Shuffling)和功能互補法對來源于葡萄EPSP合酶基因進 行改造獲得多位點突變體，然后將其編碼的基因應用于草甘膦的抗性研究以及水稻轉化、 轉基因作物培育中。
【背景技術】
[0002] 莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。EPSP合酶是莽草酸途 徑的關鍵酶，催化3-磷酸莽草酸（S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)生成5-烯醇丙酮酰-莽 草酸-3-憐酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)。除草劑 草甘膦是PEP的結構類似物，能與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的 生物合成，最終導致植物死亡。迄今為止，成功用于商業化的抗草甘膦轉基因作物的基因只 有II型的農桿菌CP4的EPSPS基因。然而由于該基因來源于細菌，因而容易引起普通消 費者的心理顧忌。最近有學者報道了來源于可食性植物的EPSPS基因在轉基因作物中表現 出了良好的草甘膦抗性（Plant Physiol 140:184-195)，這就為發展抗草甘膦轉基因作物 提供了一種新的途徑即以植物源的EPSPS基因來為基礎來發展抗草甘膦轉基因作物。但是 來源于植物的野生型EPSPS基因往往對草甘膦很敏感，因而不能直接用于轉基因作物的培 育。這就需要通過基因工程手段對其進行改造，從而獲得新型的來源于植物的功能良好的 可用于轉基因作物培育的新型基因。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題在于提供一種來源于葡萄的EPSP合酶多位點突變體 及其編碼基因與應用。通過采用DNA分子重排（DNA Shuffling)獲得該EPSP合酶多位點 突變體文庫，然后利用大腸桿菌aroA突變株（ER2799)的功能互補對來源于葡萄的EPSP合 酶突變體文庫進行篩選，獲得了一個含有7個氨基酸突變的多位點突變體，其氨基酸序列 如SEQ ID No. 1所示。經試驗驗證，該突變體不但在大腸桿菌中表現出顯著地高草甘膦抗 性，而且在轉基因植物中也表現出了穩定的草甘膦抗性。
[0004] 為了達到以上目的，本發明采用以下技術方案來實現： 首先， 申請人:在 NCBI 網站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov)輸入 5-enolpyruvylshi kimate-3-phosphate synthase and Vitis vinifera,得到序列號為 NM_001281247 的編 碼葡萄5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的mRNA序列。根據此序列設計一對 PCR引物（VvEPSPSZ和VvEPSPSF)，以本試驗保存的巨峰葡萄cDNA文庫(西北植物學報， 2009, 29:1723-1729)為模板，RT-PCR擴增獲得葡萄EPSP合酶基因（K成P575)的全長cDNA 序列。
[0005] 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收基因片段，以DNase I緩沖液（50mmol/ L Tris-Cl ρΗ7·4 + lmmol/L MgCl2)100yl 溶解；加入 0.1U DNase I，25°C處理 15 分 鐘。70°C處理10分鐘。10%丙烯酰胺凝膠電泳，透吸袋法回收l(T50bp的DNA小片段。進 行 Primerless PCR擴增，反應體系：5μ 1 小片段 DNA + 4μ 1 2. 5mmol/L dNTPs + 4. 5μ 1 25mmol/L MgCl2 + Taq2U + ddH20 至 50μ 1 ;反應程序為：94°C 30s，40°C 30s，72°C 30s，共 45個循環。
[0006] 以無引物PCR擴增產物為模板，以VvEPSPSZ和VvEPSPSF為引物進行PCR擴增。 反應體系：5μ1 Primerless PCR 產物 + VvEPSPSZ 0.2ng + VvEPSPSF 0.2ng + 10XPCR Buffer 5μ 1 + 2. 5mmol/L dNTPs 4μ 1 + Taq2U + ddH20至50μ 1。反應程序為：94°C30s， 70°C 30s，72°C 2. 0 min，共35個循環，回收重排的基因片段。
[0007] 將上述回收的重排K成基因片段，經BamH I和Sac I雙酶切后，構建入原核 表達載體PG251 (CN1338515)啟動子和tlt2終止子之間，該載體帶有氨芐青霉素抗性基 因。電擊法轉化大腸桿菌菌株DH5 α獲得突變體表達文庫，庫容達到108,而后用質粒大量提 取試劑盒(美國Omega公司）進行質粒提取。取1 μ 1大量提取的質粒轉入大腸桿菌ER2799 (ΝΕΒ公司）涂布與含有200mM草甘瞵的Μ9平板上培養48h，將生長良好菌落接種到含有 200mM草甘瞵的M9平板上培養，發現只有1個克隆能在含200mM草甘瞵的M9平板上生長， 其所含的質粒命名為pVvEPSPS mutant。
[0008] 利用逐步序列測定法對上述篩選獲得的高耐受草甘膦質粒pVvEPSPSmutant全序列 進行DNA測序。測序結果顯示該突變體在同一分子上含有下述7個突變位點，分別是：突變 位點1 (Q93R)，即EPSP合酶氨基酸序列中第93位上的谷氨酰胺被替換為精氨酸；突變位 點2 (T113A)，即第113位上的蘇氨酸被替換為丙氨酸；突變位點3 (P117L)，即第117位的 脯氨酸替換為亮氨酸；突變位點4 (G126A)，即第126位上的甘氨酸被替換為丙氨酸；突變 位點5 (C160Y)，即第160位上的半胱氨酸被替換為酪氨酸；突變位點6 (N239H)，即第239 位上的天冬酰胺被替換為組氨酸；突變位點7 (V343A)，即第343位上的纈氨酸被替換為丙 氨酸。上述所獲得的突變體其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，編碼的堿基序列如SEQ ID No. 2所示。
[0009] 將上述得到的高耐受草甘膦質粒pVvEPSPSmutant轉入水稻，通過水稻種子萌發試驗 以及草甘膦噴灑試驗說明本發明的來源于葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼的基因 (K成不僅具有較高的草甘膦抗性而且還保持著與PEP較強的親和性，這些特性 將為該基因用于轉基因作物的培育提供了可能。
[0010] 本發明所述的術語與其一般概念相同。
[0011] 所述的"核苷酸"和"引物"序列均為5'端至3'端。
[0012] 所述的"生物細胞"指微生物、植物細胞或組織。
[0013] 所述的"微生物"指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要為細菌。
[0014]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1為高草甘膦抗性EPSP合酶突變體的體外草甘膦抗性試驗。汁EPSPS"_為本 發明所獲得的高草甘膦抗性EPSP合酶突變體，汁EPSPS為葡萄野生型EPSP合酶。
[0016] 圖2為轉本發明的編碼EPSP合酶多位點突變體（汁EPSPSmutant)基因的水稻在含有 不同濃度草甘膦平板上的萌發實驗圖，其中Mur為轉本發明的編碼EPSP合酶多位點突變體 基因的不同水稻株系，WTr為轉野生型來源于葡萄的EPSP合酶基因的水稻，CK為對照。
[0017] 圖3為轉本發明的編碼EPSP合酶突變體（汁EPSPSmutant)基因的水稻用1. 0 % (v/ v) Roundup噴灑處理表型圖，其中Murl為轉本發明的編碼EPSP合酶多位點突變體基因的 水稻株系，WTrl為轉野生型來源于葡萄的EPSP合酶基因的水稻，CK為對照。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1 EPSP合酶基因的DNA分子重排（DNA Shuffling) 1. 1來源于葡萄的抗草甘膦除草劑基因的合成 申請人:在 NCBI 網站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov)輸入 5-enolpyruvylshikimate -3-phosphate synthase and Vitis vinifera,得到序列號為 NM_001281247 的編碼葡萄 5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的mRNA序列。根據此序列設計一對PCR引物 (VvEPSPSZ ：5'-AAGGATCCATGGCCTCTGTCGCCACTAAG -3' 和 VvEPSPSF: 5'-AAGAGCTCTCAATGTTTGGTAAAACGCTGG-3'），以本試驗保存的巨峰 葡萄cDNA文庫(西北植物學報，2009, 29:1723-1729)為模板，RT-PCR擴增獲得葡萄EPSP 合酶基因（KrEPSPS)的全長 cDNA 序列。反應體系：1 μ lcDNA + 4μ 1 2. 5mmol/L dNTPs + 25μ 1 Buffer + KOD Plus (Toyobo 日本）聚合酶 1U + 1μ 1 VvEPSPSZ + 1μ 1 VvEPSPSF +ddH20 至 50 μ 1 ;反應程序為：94°C 30s，54°C 30s，72°C 120s，共 45 個循環），2% Agrose 電 泳檢測PCR擴增結果。
[0019] PCR結束后，1% (w/v)瓊脂糖膠回收，采用TArget Clone -Plus-試劑盒（Toyobo 日本）連接。轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，獲得含有基因的陽性克隆，抽提 質粒，測序。即得到野生型葡萄EPSP合酶基因 （Κ成Ρ575)。
[0020] 1. 2 PCR擴增EPSP合酶基因及回收 以上述所獲得的含有K基因的陽性質粒為模板，VvEPSPSZ和VvEPSPSF為引物擴 增EPSP合酶基因，反應條件為：94°C 10min預變性，94°C變性30s，72°C退火和延伸1. 5min， 共30個循環，1% Agrose電泳，透吸袋法回收得1368bp的EPSP合酶基因片段。
[0021] 1) DNase I降解DNA及回收小片段 上述回收的EPSP合酶基因片段以DNase I緩沖液（50mmol/L Tris-Cl pH7. 4 + lmmol/ L MgCl2)100yl溶解；加入0.1U DNase I，25°C處理15分鐘。70°C處理10分鐘。10%丙烯 酰胺電泳，透吸袋法回收l(T5〇bp的小片段。用10 μ 1 10X無引物PCR緩沖液（Primerless PCR Buffer) (50mmol/L KC1 + lOmmol/L Tris-Cl pH9. 0 + 1% Triton)溶解沉淀。
[0022] 2)無引物 PCR (Primerless PCR) 進行 Primerless PCR 擴增。反應體系：5μ1 小片段 DNA + 4μ1 2.5mmol/L dNTPs + 4· 5μ 1 25mmol/L MgCl2 + Taq2U + ddH20 至 50μ 1 ;反應程序為：94°C 30s，40°C 30s， 72°C 30s，共45個循環)，2% Agrose電泳檢測PCR擴增結果。
[0023] 3)有引物 PCR (Primer PCR) 以上述無引物PCR擴增產物為模板，以VvEPSPSZ和VvEPSPSF為引物進行PrimerPCR 擴增反應。反應體系：5 μ 1 Primerless PCR 產物 + VvEPSPSZ 0.2ng + VvEPSPSF 0.2ng + 10XPCR Buffer 5μ 1 + 2.5mmol/L dNTPs 4μ 1 + Taq2U + ddH20 至 50μ 1。反應程序 為：94°C 30s，70°C 30s，72°C 2. Omin，共 35 個循環，l%Agrose 電泳檢測，回收得 1368bp 重排 的EPSP合酶基因片段。
[0024] 實施例2高草甘膦抗性EPSP合酶突變體篩選及序列分析 2. 1高草甘膦抗性EPSP合酶突變體的篩選 將上述回收重排的EPSP合酶基因片段經BamH I和Sac I雙酶切后，構建入原核表達 載體pG251 (CN1338515)啟動子和tlt2終止子之間，該載體帶有氨芐青霉素抗性基因。電 擊法轉化大腸桿菌菌株DH5ci獲得突變體表達文庫，庫容達到10 8,而后用質粒大量提取試 劑盒(美國Omega公司）進行質粒提取。
[0025] 取1 μ 1大量提取的質粒轉入大腸桿菌ER2799 (NEB公司)涂布與含有200mM草甘 瞵的M9平板上培養48h，發現有一個菌落生長良好。將該克隆抽提的質粒（pVvEPSPS mutant) 再次轉入大腸桿菌ER2799 (NEB公司）中，將轉化子用無菌牙簽點與含200mM草甘瞵的M9 固體培養基上檢驗抗性，結果證明這個克隆所產生的轉化子具有抗草甘膦特性，表明抗草 甘膦特性確實是由于轉入了該pVvEPSPS mutant質粒引起的。
[0026] 2. 2高耐受草甘膦的EPSP合酶突變體的序列分析 利用逐步序列測定方法對2. 1篩選所獲得的1?耐受:草甘勝質粒pVvEPSPSmutant全序列 進行DNA測序。分析結果表明，該高抗草甘膦突變體在同一分子上含有下述7個突變位點， 具體是：突變位點1(Q93R)，即EPSP合酶氨基酸序列中第93位上的谷氨酰胺被替換為精氨 酸；突變位點2 (T113A)，即第113位上的蘇氨酸被替換為丙氨酸；突變位點3 (P117L)，即 第117位的脯氨酸替換為亮氨酸；突變位點4 (G126A)，即第126位上的甘氨酸被替換為丙 氨酸；突變位點5(C160Y)，即第160位上的半胱氨酸被替換為酪氨酸；突變位點6(N239H)， 即第239位上的天冬酰胺被替換為組氨酸；突變位點7 (V343A)，即第343位上的纈氨酸被 替換為丙氨酸。上述所獲得的突變體其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，編碼的堿基序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
[0027] 實施例3體外草甘膦抗性試驗 將實施例1所獲得的野生型基因用BamH I和Sac I雙酶切后，構建入原核表 達載體PG251得到質粒pVvEPSPS。用大腸桿菌ER2799菌株分別轉化pVvEPSPS質粒和實施 例2所獲得的pVvEPSPS mutant質粒，涂布于M9平板上培養48h，用牙簽挑取各自轉化子接種 于LB液體培養基中培養，待濃度達到5 X Kfcells/yL時，分別取2yL各自細胞液以及 1/5和1/25稀釋后的細胞液點樣于含有不同濃度草甘膦（0, 50mM，200mM)的M9平板上，培 養48h后觀察到50mM草甘膦已經基本抑制了野生型K成細胞的生長。然而在草甘膦 濃度為200mM時，突變體VvEPSPS mutant細胞則仍然可以增殖。由此可見突變體VvEPSPSmutant 相對于野生型VvEPSPS來說具有較高的體外草甘膦耐受性，結果參看圖1。
[0028] 實施例3高草甘膦抗性的EPSP合酶突變體的原核表達 3. 1 EPSP合酶多位點突變體基因在大腸桿菌中的表達 以上述篩選獲得的EPSP合酶多位點突變體基因為模版，用引物VvEPSPSZ和VvEPSPSF 進行PCR擴增，以KOD Plus (Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，擴增條件依次為：94°C 30s， 55°C 30s，72°C 90s，擴增30個循環。循環結束后，加入2U的rtaq酶(大連寶生物工程公 司），72°C延伸90s，擴增片段長1368bp。PCR產物用BamH I和Sac I酶切后，連入相同酶 切的載體pET-28a (NEB公司）得到重組質粒pET-VvEPSPSmutant并將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司），將轉化子涂布在LB固體培養基中培養24h。用凝膠-蛋白純化試 劑盒HisTrap HP (Amersham Biosciences公司）對其進行蛋白表達純化，SDS-PAGE電泳檢 測。經SDS-PAGE電泳檢測，本發明的EPSP合酶多位點突變體基因 （VvEPSPS mutant)編碼的 EPSP合酶突變體（VvEPSPSmutant)蛋白大小約50kDa，與預測值相符。
[0029] 實施例4 VvEPSPS mutant的酶活測定和動力學參數測定 4. 1測定方法 無機磷標準曲線：10mM無機磷按1 : 10稀釋，分別取〇、1、2、3…20μ1與1.5ml Eppendorf離心管中，加入純水至100 μ 1混勻，加入MAT溶液（0· 045%孔雀石綠：4· 2%鑰酸 銨=3:1，V/V) 0.8ml混勻，計時三分鐘后加入SC溶液（34%檸檬酸三鈉）100 μ 1迅速混勻， 室溫靜置20min后測定00_值。重復三次。以無機磷濃度為橫坐標，0066。值為縱坐標作圖 得到無機磷標準曲線。
[0030] 1、酶活測定：蛋白定量采用考馬斯亮藍G-250染色法（Bradford，1976)。在冰上與 1.5ml Eppendorf離心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μ1、10 mM S3P溶液2μ1、0·5Μ HEPES 溶液 2 μ 1、ImM (ΝΗ4) 6Μ07024·4Η20 溶液 2 μ 1 和雙蒸水 12 μ 1 混勻，與 28°C溫浴 5min 后各管樣品間隔2s加入5 μ 1純化蛋白并計時，2min后再間隔2s依次加入200 μ 1 MAT溶 液，顯色3min后再間隔2s依次加入20 μ 1 34% SC溶液迅速混勻，室溫顯色20min后測定 〇〇_值。對照除不加純化蛋白外，其余同樣品管。樣品管與對照管的00_值相減后，對照 無機磷標準曲線即可求得反應釋放出的無機磷摩爾量，再除以反應時間和酶蛋白量就得到 酶的酶活力。
[0031] 2、半抑制量（IC5Q)測定：上述反應液中添加 0、10-3、10-2、10-1、1、10、100、5001111草 甘膦，所得酶比活力數據以草甘膦濃度為X軸，采用對數坐標，以反應速度（nkat/mg)為Y軸 作圖。
[0032] 3、Km(PEP)測定：將S3P溶液濃度恒定于lmM，在不同PEP濃度（0·05、0·067、0·l、 0. 2、0. 5、1. OmM)下按上述反應體系測定酶反應速度，所測數值按V-v/[S] (Eadic-Hofstee) 法作圖。
[0033] 4、Ki (glyphosate)測定：在不同草甘膦濃度（0、10、50、100 μ M)下測定PEP濃度 為0. 05、0. 067、0. 1、0. 2、0. 5、1. OmM時EPSP的酶反應速度。采取雙倒數作圖，得到1/V-1/ [S]直線，再將各直線的斜率作為縱坐標，草甘膦的濃度作為橫坐標得到一條新的直線，該 直線與X軸的交點即為Ki (glyphosate)值。
[0034] 4. 2測定結果 本發明的VvEPSPS mutant的酶動力學參數如下表1所示。
[0035] 表1 EPSP合酶多位點突變體的動力學參數
【權利要求】
1. 一種來源于葡萄（Kz'iis n'fli/era )的EPSP合酶多位點突變體，其特征在于，所述多 位點突變體含有下述7個突變位點： 突變位點1 :Q93R，即EPSP合酶氨基酸序列中第93位上的谷氨酰胺被替換為精氨酸； 突變位點2 :T113A，即第113位上的蘇氨酸被替換為丙氨酸； 突變位點3 :P117L，即第117位的脯氨酸替換為亮氨酸； 突變位點4 :G126A，即第126位上的甘氨酸被替換為丙氨酸； 突變位點5 :C160Y，即第160位上的半胱氨酸被替換為酪氨酸； 突變位點6 :N239H，即第239位上的天冬酰胺被替換為組氨酸； 突變位點7 :V343A，即第343位上的纈氨酸被替換為丙氨酸。
2. 編碼權利要求1所述的來源于葡萄（Kiiis )的EPSP合酶多位點突變體， 其特征在于，所述多位點突變體的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
3. 編碼權利要求1所述的來源于葡萄（Kiiis rifli/era)的EPSP合酶多位點突變體， 其特征在于，所述多位點突變體的堿基序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 權利要求2或3所述的編碼來源于葡萄（Kiiis 的EPSP合酶多位點突變 體的基因在抗草甘膦轉基因水稻培育中的應用。
【文檔編號】C12N15/54GK104232600SQ201410371996
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】田永生, 許晶, 姚泉洪, 彭日荷, 趙偉, 付曉燕, 王麗娟, 韓紅娟, 王波 申請人:上海市農業科學院