一種制備bmp-2蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備BMP-2蛋白的方法。本發明提供的制備BMP-2蛋白的方法，包括如下步驟：將種子液接種至發酵培養基，然后按照如下參數進行發酵：37.0℃；溶氧>40％；pH7.0-7.3；起始溶氧>90％；200rpm；起始通氣量3.0SLPM；采用補料培養基進行補料；待發酵體系的OD600nm值為9時加入IPTG并使其濃度為1.0mM，然后按如下參數進行誘導發酵4-6小時：37.0℃；溶氧>40％；pH7.20-7.40；BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；所述重組菌的制備方法如下：將具有所述BMP-2蛋白的編碼基因的重組質粒導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。本發明提供的方法具備產業化價值。
【專利說明】-種制備BMP-2蛋白的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種制備BMP-2蛋白的方法。
【背景技術】
[0002] 骨形態發生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP)是由骨基質分泌的一種疏 水性蛋白，屬于轉化生長因子（TGF-β)超家族成員，由Urist等人于1965年首次提出， 1972年定義，并于1982年首次從脫鈣骨基質提取物中分離得到。BMP家族包括BMP-1、 BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12 和BMP-14 等，其中BMP-2 具有明顯誘導未分化 的成纖維細胞定向分化為成骨細胞的作用并能調節成骨細胞和成軟骨細胞的分化，誘導異 位骨形成和促進骨折愈合。BMP-2是骨生成的啟動因子，可以加速骨的重建，是骨修復基因 治療的理想目的基因，是目前唯一能誘導異位成骨的細胞因子，因而成為骨組織工程學研 究中最重要的生長因子。目前，BMP-2已成功地用于治療骨不連和骨缺損的修復。
[0003]BMP-2的活性形式是二聚體，在成熟肽單鏈中有七個半胱氨酸殘基，形成三個肽鏈 內二硫鍵，兩條肽鏈間再通過一個二硫鍵連接后才具有活性。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種制備BMP-2蛋白的方法。
[0005] 本發明提供的制備BMP-2蛋白的方法，包括如下步驟：
[0006] 將種子液按10%的體積比接種至裝有發酵培養基的發酵罐，然后按照如下參數進 行第一階段發酵：
[0007]培養溫度：37.(TC;
[0008] 培養階段溶氧：MO%;
[0009]培養pH:7. 0-7. 3;
[0010] 接種種子液后的起始溶氧：〉90%;
[0011] 接種種子液后的起始轉速：200rpm;
[0012] 接種種子液后的起始通氣量：3.OSLPM;
[0013] 待發酵體系的OD6tltol值為9時加入IPTG并使其濃度為I. OmM，然后按如下參數進 行第二階段發酵，第二階段發酵即誘導發酵：
[0014]誘導溫度：37. (TC;
[0015] 誘導發酵階段溶氧：>40%;
[0016]誘導發酵階段pH:7. 20-7. 40;
[0017] 誘導發酵時間：4_6小時；
[0018] 包括第一階段發酵和第二階段發酵在內的發酵過程中，采用補料培養基進行補 料；
[0019] 所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；
[0020] 所述種子液為(》6_"值=3. 0-5. 0的重組菌菌液；所述重組菌的制備方法如下：將 具有所述BMP-2蛋白的編碼基因的重組質粒導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌；
[0021] 所述發酵培養基由溶劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如 下：1. 0g/100mL胰蛋白胨、0· 5g/100mL酵母粉、0· 5g/100mLNaCl、0.lg/100mLMgS04、 0· 05g/100mLCaCl2、0. 5g/100mLNa2HPO4 和 0· 25g/100mLKH2PO4 ;
[0022] 所述補料培養基由溶劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下： 40g/L甘油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。
[0023] 所述BMP-2蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列2所示。
[0024] 所述重組質粒的制備方法具體如下：將序列表的序列2自5'末端第64-477位核 苷酸所示的雙鏈DNA分子插入載體pET-28a(+)的NdeI和XhoI酶切位點之間，得到重組 質粒。
[0025] 所述方法中，"采用補料培養基進行補料"的方案如下：對于裝有3L所述發酵培養 基的5L發酵罐來說，從發酵體系OD6tltlmi = 1. 5開始補料，初始補料速度為2ml/min，每半小 時增加0. 4ml/min，增加至6ml/min后再每半小時減少0. 4ml/min，直至補料速度為0。
[0026] 所述方法中，"采用補料培養基進行補料"的方案如下：對于裝有30L所述發酵培 養基的50L發酵罐來說，從發酵體系OD6tltlmi = 1. 5開始補料，初始補料速度為12ml/min，每 半小時增加2. 4ml/min，增加至36ml/min后再每半小時減少2. 4ml/min，直至補料速度為0。
[0027] 所述種子液的制備方法具體如下：挑取所述重組菌的單克隆，接種至種子培養基 中，37°C、220rpm振蕩培養至0D600nm值=3. 0-5. 0,即為種子液。
[0028] 所述種子培養基由溶劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下： 1.0g/100mLTyptone、0.5g/100mLYeast和 0.5g/100mLNaCl。
[0029] 所述種子液的OD6cicinm值=4· 0。
[0030] 所述誘導發酵的時間為5小時。
[0031] 所述方法還包括如下步驟：
[0032] (1)完成所述誘導發酵后，收集菌體，用ρΗ8· 0、IM的PBS緩沖液懸浮，加入MgCl2并 使其濃度為1Μ，加入菌體質量的0. 5%的溶菌酶，攪拌30min;然后在4°C下用高壓均質機破 壁處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min， 收集沉淀；
[0033] (2)用包涵體溶解液溶解步驟（1)得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均質機破壁處 理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min，收集 沉淀；
[0034] 所述包涵體溶解液由溶劑和溶質組成；所述溶劑為pH8. 5、150mmol/L的Tris-HCl 緩沖液；所述溶質及其濃度如下：5mmol/LEDTA、體積比為2 %的TritonX-100和 2. 5MUera；
[0035] (3)用pH8. 0、IM的PBS緩沖液溶解步驟⑵得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均 質機破壁處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心 30min，收集沉淀。
[0036] 所述步驟（1)中：用高壓均質機破壁處理3_5(具體可為4次），每次的參數均 為：工作壓力為760bar;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5 (具體可為4次），每次的參數均為： 800W，超聲5s，停5s，總時間30min;
[0037] 所述步驟（2)中：用高壓均質機破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數均 為：工作壓力為760bar;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5 (具體可為4次），每次的參數均為： 800W，超聲5s，停5s，總時間30min;
[0038] 所述步驟（3)中：用高壓均質機破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數均 為：工作壓力為760bar;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5 (具體可為4次），每次的參數均為： 800W，超聲5s，停5s，總時間30min。
[0039] 本發明的發明人首先通過搖瓶發酵，初步摸索通過發酵所述重組菌制備BMP-2蛋 白的方法中的各個參數，最佳參數如下：在培養體系的OD6tltlmi值為0. 9時加入IPTG進行誘 導，IPTG濃度為ImM時誘導效果最佳，采用37°C的誘導溫度最佳。
[0040] 在搖瓶發酵的基礎上，本發明的發明人建立了制備BMP-2蛋白的方法，可以應用 于工業生產，具有遺傳背景清楚、使用安全、操作簡單、產量高、生產周期短和成本低的優 點，經過連續三批中試規模（5L體積）和三批50L發酵罐的生產，證實本發明提供的方法具 備產業化價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041] 圖1為實施例3的步驟一的結果。
[0042] 圖2為實施例3的步驟二的結果。
[0043] 圖3為實施例3的步驟三的結果。
[0044] 圖4為實施例4的結果（方案一）。
[0045] 圖5為實施例4的結果（方案二）。
[0046] 圖6為實施例4的結果（方案三）。
[0047] 圖7為實施例6的結果。
【具體實施方式】
[0048] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0049] 實施例1、重組菌的構建
[0050] 1、將序列表的序列2自5'末端第64-477位核苷酸所不的雙鏈DNA分子插入載體 pET-28a(+)的NdeI和XhoI酶切位點之間，得到重組質粒。重組質粒中，插入的雙鏈DNA 分子與質粒本身的部分DNA融合，形成序列表的序列2所示的融合基因，表達序列表的序列 1所示的融合蛋白。
[0051]2、將步驟1得到的重組質粒導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。
[0052] 實施例2、種子培養參數的優化（種子培養基的優化）
[0053] 挑取實施例1得到的重組菌的單克隆，接種至種子培養基（分別采用1#培養基、 2#培養基或3#培養基作為種子培養基）中，37°C、220rpm振蕩培養，每2小時無菌取樣檢 測OD6tltlmi 值。
[0054] 1# 培養基：溶劑為水，含I. 0g/100mLTyptone、0. 5g/100mLYeast和 0· 5g/100mL NaCl。
[0055] 2# 培養基：溶劑為水，含I. 0g/100mLTyptone、0. 5g/100mLYeast和I. 0g/100mL NaCl。
[0056] 3# 培養基：溶劑為水，含I.Og/lOOmLTyptoneU.Og/lOOmLYeast、0. 5g/100mL NaCl、0·lg/lOOmLMgSO4 和 0· 05g/100mLCaCl2。
[0057] 米用各個種子培養基進行培養2h、4h或6h后的OD6tltlmi值見表1。
[0058] 表1米用各個種子培養基進行培養2h、4h或6h后的OD6tltlmi值
[0059]
【權利要求】
1. 一種制備BMP-2蛋白的方法，包括如下步驟： 將種子液按10 %的體積比接種至裝有發酵培養基的發酵罐，然后按照如下參數進行第 一階段發酵： 培養溫度：37. 0°C ; 培養階段溶氧：>40% ; 培養 pH :7. 0-7. 3 ; 接種種子液后的起始溶氧：〉90*% ; 接種種子液后的起始轉速：200rpm ; 接種種子液后的起始通氣量：3. 0SLPM ; 待發酵體系的〇D6(l(lmi值為9時加入IPTG并使其濃度為1. OmM，然后按如下參數進行第 二階段發酵，第二階段發酵即誘導發酵： 誘導溫度：37. 0°C ; 誘導發酵階段溶氧：>40 % ; 誘導發酵階段pH :7. 20-7. 40 ; 誘導發酵時間：4-6小時； 包括第一階段發酵和第二階段發酵在內的發酵過程中，采用補料培養基進行補料； 所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所不； 所述種子液為(?^^值二3. 0-5. 0的重組菌菌液；所述重組菌的制備方法如下：將具有 所述BMP-2蛋白的編碼基因的重組質粒導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌； 所述發酵培養基由溶劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下： l.Og/lOOmL 胰蛋白胨、0.5g/100mL 酵母粉、0.5g/100mL NaCl、0.1g/100mL MgS04、 0? 05g/100mL CaCl2、0. 5g/100mL Na2HP04 和 0? 25g/100mL KH2P04 ; 所述補料培養基由溶劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下：40g/L甘 油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述BMP-2蛋白的編碼基因如序列表的序 列2所示。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述重組質粒的制備方法如下：將序列表的 序列2自5'末端第64-477位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入載體pET-28a(+)的Nde I 和Xho I酶切位點之間，得到重組質粒。
4. 如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，"采用補料培養基 進行補料"的方案如下：對于裝有3L所述發酵培養基的5L發酵罐來說，從發酵體系0D6(l(lnm=1. 5開始補料，初始補料速度為2ml/min，每半小時增加0. 4ml/min，增加至6ml/min后再 每半小時減少〇. 4ml/min，直至補料速度為0。
5. 如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，"采用補料培養基進 行補料"的方案如下：對于裝有30L所述發酵培養基的50L發酵罐來說，從發酵體系0D6(l(lnm=1. 5開始補料，初始補料速度為12ml/min，每半小時增加2. 4ml/min，增加至36ml/min后 再每半小時減少2. 4ml/min，直至補料速度為0。
6. 如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述種子液的0D6(l(lmi值=4. 0。
7. 如權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述誘導發酵的時間為5小時。
8. 如權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法還包括如下步驟： (1) 完成所述誘導發酵后，收集菌體，用PH8. 0、1M的PBS緩沖液懸浮，加入MgCl2并使 其濃度為1M，加入菌體質量的0. 5%的溶菌酶，攪拌30min ;然后在4°C下用高壓均質機破壁 處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min，收 集沉淀； (2) 用包涵體溶解液溶解步驟（1)得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均質機破壁處理， 然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min，收集沉 淀； 所述包涵體溶解液由溶劑和溶質組成；所述溶劑為pH8. 5、150mmol/L的Tris-HCl緩沖 液；所述溶質及其濃度如下：5mmol/L EDTA、體積比為2%的Triton X-100和2. 5MUera ; (3) 用pH8. 0、1M的PBS緩沖液溶解步驟（2)得到的沉淀，然后在4°C下用高壓均質機破 壁處理，然后在4°C冰浴條件下用超聲波破碎儀超聲破碎，然后4°C、12000rpm離心30min， 收集沉淀。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于： 所述步驟（1)中：用高壓均質機破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數均為：工作 壓力為760bar ;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5(具體可為4次），每次的參數均為：800W，超 聲5s，停5s，總時間30min ; 所述步驟（2)中：用高壓均質機破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數均為：工作 壓力為760bar ;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5(具體可為4次），每次的參數均為：800W，超 聲5s，停5s，總時間30min ; 所述步驟（3)中：用高壓均質機破壁處理3-5(具體可為4次），每次的參數均為：工作 壓力為760bar ;用超聲波破碎儀超聲破碎3-5(具體可為4次），每次的參數均為：800W，超 聲5s，停5s，總時間30min。
【文檔編號】C12N15/70GK104357519SQ201410541699
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】張東剛, 楊建軍, 彭繼學 申請人:煙臺正海生物技術有限公司