使用擴增后培養步驟擴增和檢測靶核酸的制作方法

專利名稱：使用擴增后培養步驟擴增和檢測靶核酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及擴增和檢測靶核酸的方法。尤其涉及檢測擴增的核酸產品的方法。本發明能用在各種醫學和調查研究，法庭調查，和診斷方法中，如用于遺傳疾病或傳染性疾病的檢測。
檢測微量核酸的技術在過去的二十年中很快地發展著，其包括在擴增技術中如聚合酶鏈反應(PCR)中使用探針的高精尖雜化測定的發展。研究人員已經認識到這些技術對人類和動物試驗樣品測定疾病和遺傳性特征的價值。在核酸的擴增和測定中使用引物和探針基于互補的概念，即，互補的核苷酸(已知為核苷酸對)之間通過氫鍵結合兩股核酸鏈。
為發現擴增和測定小量DNA的方法已開展了許多研究。許多方法是已知的，并已用來擴增或大量地增殖樣品中的核酸數量以備測定。這些擴增技術包括PCR，連接酶鏈反應(LCR)，和分支的DNA。
PCR是這些擴增方法中最為人所知的。PCR的詳細說明在現有技術中很好地被描述，包括，如，U.S.專利4638195(Mullis等)，4683202(Mullis等)，和4965188(Mullis等)。不需要了解深入的細節，PCR涉及在合適條件下聚合劑(如DNA聚合酶)和脫氧核苷三磷酸鹽的存在下雜化對靶核酸鏈的引物。結果是沿著模板的引物延伸產物的產生，產物要加入到對模板互補的核苷酸中。
一旦引物延伸產物變性并已制得模板的復制件，就可以將引發，伸展和變性循環進行所期望的次數，以提供與靶核酸有相同序列的核酸量指數增加。實際上，將靶核酸復制(或“擴增”)多次，使其更容易被檢測。一旦靶核酸被充分放大，則可以使用多種檢測方法定性和/或定量檢測靶物的存在。
一旦靶核酸有效地被擴增，能使用各種測定方法測定它的存在。用來測定PCR產品的標準測定方法是溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶著色的瓊脂糖凝膠。可是，使用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶著色的凝膠有幾個缺點，包括，例如，相對小的敏感性和特異性。
免去放射性同位素標記和電泳的使用的測定PCR產品的改良的方法已經開發了。這些非同位素的寡核苷酸捕捉測定方法依靠對探針的特異雜化和酶促信號的產生。這些非同位素的寡核苷酸捕捉測定方法，已知也為反向斑點印跡檢測(reverse dot blot detection)，在美國專利5229297(Schnepilsky等)，5328825(Warren等)，和5422271(Chen等)中描述。該方法也在Findlay等的《臨床化學》(Clinical Chemistry)391927-1933(1933)中被描述。
這些非同位素測定方法比溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶著色測定有較高的敏感性和特異性，并能避免使用放射性。通過用生物素酰化引物或用生物素酰化探針測定擴增的核酸操作這些方法。生物素酰化產物或探針接著與抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素綴合酶反應，所述的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素綴合酶如辣根過氧化物酶(HRP)。然后染料前體(或光產生信號劑)能與酶接觸并因而轉化為產生可測信號的染料(發光)。
非同位素的寡核苷酸捕捉測定方法不是沒有它們本身的缺點。如果通過使用標準PCR去活條件(95℃)以去活濃縮或極微稀釋的擴增的核酸產物來操作非同位素的寡核苷酸捕捉測定，為進行擴增反應而使用的酶，如耐熱性的聚合酶或DNA連接酶將仍存在并是有活性的。這些活性酶在測定期間的存在導致在酶和探針之間對擴增產物的連接競爭。此競爭能減少連接到探針的擴增的核酸產物的量，并因此減弱測定信號。
這個問題的一個解決方法是在進行擴增之后但在測定之前將高含量的二乙胺四乙酸(EDTA)，Mg++的軛合劑，加入到PCR擴增混合物中。EDTA能抑制許多需要Mg++激活的酶包括DNA聚合酶和DNA連接酶。但使用EDTA對PCR擴增和測定方法加入了一個額外的步驟。另外，使用EDTA需要打開反應容器加入EDTA。如本領域熟練技術人員所知的，因為擔心污染，所以一定要避免打開反應容器。
因此，在測定中因為EDTA或別的這樣的酶抑制劑的加入而中斷擴增過程是不令人期望的。而且，希望找到不增加感染的危險而在測定之前使擴增酶失活的方法。
本發明的目的是通過在測定之前使用擴增后培養步驟使擴增酶失活來克服上述的問題。
在一個實施方案中，本發明涉及擴增并測定靶核酸的方法，包括(i)將懷疑含靶核酸的樣本與至少二個寡核苷酸和一個耐熱性的擴增酶接觸，其中寡核苷酸在靶核酸擴增的條件下大體上是與靶核酸的一部分互補；(ii)使擴增的靶核酸失活以形成單鏈核酸；(iii)在1秒和30分鐘之間和95℃和120℃之間培養樣本，作為擴增后培養步驟使耐熱性的擴增酶失活；和(iv)測定是否存在擴增的靶核酸。
在另一個實施方案中，本發明涉及擴增并測定靶核酸的方法，包括(i)在靶核酸擴增條件下，將懷疑含靶核酸的樣本與四種不同的核苷三磷酸，一種耐熱性的DNA聚合酶，和至少兩個引物接觸，其中探針大體上與靶核酸互補；(ii)使擴增的靶核酸變性以形成單鏈核酸；(iii)在1秒和30分鐘之間和95℃和120℃之間培養樣本，做為擴增后培養步驟使聚合劑失活；和(iv)測定是否存在擴增的靶核酸。
在另一個實施方案中，本發明涉及擴增并測定核酸的方法，包括(i)將懷疑含靶核酸的樣本與四種不同的核苷三磷酸，一種耐熱性的DNA聚合酶，和至少兩個引物接觸，其中至少一個引物用生物素標記，所有的引物大體上與靶核酸互補，在此條件下使靶核酸擴增；(ii)在0.5分鐘和5分鐘之間和約105℃培養樣本，做為擴增后培養步驟使聚合酶失活；和(iv)通過將生物素酰化的擴增的靶核酸與抗生蛋白鏈菌素-酶綴合物反應，接著將酶與底物試劑反應得到可測定的比色的或化學發光的信號來測定是否存在生物素酰化的擴增的靶核酸。
從本發明的下面的描述，本發明的各種別的目的和優點將是明顯的。
使用聚合酶鏈反應進行核酸的擴增和測定的通常的原理和條件是公知的，其詳細說明提供在大量的參考中，包括美國專利4683195(Mullis et al.)，4683202(Mullis)，和4965188(Mullis et al.)，所有這些在這里引入并作為參考。因此，由于現有技術的教導和本文提供的具體的教導，本領域普通技術人員通過加入擴增后培養步驟使擴增酶在如前所述的產品測定之前失活以增加測定敏感性來實施本發明應該沒有困難。
應用耐熱性酶的其它擴增和測定方法也可在本發明的實施中應用。本發明提供擴增后測定前培養步驟，其使在擴增過程中使耐熱性酶失活。因此，本發明適合使用于任何應用耐熱性酶的擴增方法。別的耐熱性擴增方法包括如所述的連接酶鏈反應(LCR)，例如，EP-A-0320308(1987，十二月公開)和EP-A-0439182(1990，一月公開)，其使用耐熱性DNA連接酶連接鄰接的探針由此產生互補的核酸序列。在LCR中靶核酸用4個寡核苷酸探針和一種耐熱性DNA連接酶被放大。二個寡核苷酸探針與將被擴增DNA模板上的一個鏈上的鄰接位點互補。這些探針與DNA鏈雜化以使在兩個探針之間形成切口。然后用耐熱性DNA連接酶密封切口，由此產生與靶標互補的新的DNA鏈。第三和第四個探針與第二個DNA模板鏈互補并如第一對探針起作用以產生互補DNA。能用標準測定方法測定LCR擴增的產物。本發明擴增后測定前培養步驟與LCR一起使用使DNA連接酶在測定之前失活。因此，本文提供的技術能夠使本領域技術人員采用PCR所示的擴增后酶失活步驟進行其它已知的擴增和測定方法。本發明其余部分為詳細說明而涉及使用PCR實施本發明。
為了改良測定敏感性，本發明提供有關PCR已知方法的修改。根據本發明令人驚訝地發現能使用擴增后測定前培養步驟使聚合劑失活并降低在探針和試劑之間對被擴增的靶核酸的結合競爭性。此降低的競爭增加了測定敏感性。
本發明涉及在試驗樣品中存在的一個或多個靶核酸的擴增和測定。試驗樣品可包括細胞的或病毒的材料，血液或別的含能測定的遺傳性的DNA或RNA細胞材料。
將要擴增和測定的核酸能從各種來源得到，其包括質粒和任何來源(如細菌、酵母、病毒、植物、較高級動物、或人類)的天然存在的DNA或RNA。它可用已知方法從各種組織中提取，包括但不限于血液、外圍血液單核細胞(PBMC)、組織材料或別的本領域已知的來源。本發明尤其對一個或多個核酸序列的擴增和測定是用的，所述的一個或多個核酸序列發現于基因組DNA、細菌DNA、真菌DNA、病毒DNA、或在細菌或病毒感染的細胞中發現的DNA或RNA。
本文所述的方法能用來擴增或測定與傳染性疾病、遺傳性疾病、和細胞疾病如癌癥有關的靶核酸。它也可用在法庭調查和DNA分型。通過測定與之有關的核酸，它尤其可用于傳染性試劑的測定，如細菌和病毒。當需要高敏感性和/或定量測定時，其特別有用。
能用本發明測定的細菌包括，但并非僅限于此，在人類血液中發現的細菌，如沙門氏菌種，鏈球菌種，衣原體種，淋球菌種，分枝桿菌種，(如結核分支桿菌和貪婪分枝桿菌(Mycobacterium avium)復合物)，類菌質體種，(如Mycoplasma Hemophilus influenzae和肺炎枝原體)，Legionella Pneumophiila，Borrella burgdorferei，卡氏肺囊蟲，難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)，彎曲桿菌屬的種，耶爾森氏菌種，志賀氏菌種和李氏桿菌種。可測定的病毒包括，但并非僅限于此，細胞巨化病毒，單純性皰疹病毒，EB病毒，人類乳狀瘤病毒，流感病毒，肝炎病毒，和retroviruses(如，HTLV-I，HTLV-II，HIV-I和HIV-II)。原生動物的寄生蟲，酵母和霉菌也可通過本發明測定。別的可測定的樣品對本領域技術人員將是明顯的。
“PCR試劑”指認為是PCR要素的任何試劑，即一套針對每個靶核酸的引物，DNA聚合酶，DNA聚合酶輔助因子，和一個或多個脫氧核苷-5’-三磷酸鹽(dNTP’s)的試劑。在PCR中使用的別的任選的試劑和材料如下所描述。
術語“引物”指寡核苷酸，其是天然存在或合成的，能做為當放置在一定條件下時合成的起始點，在該條件下，與核酸鏈(即模板)互補的引物延伸產物的合成被誘導，這樣的條件包括存在別的PCR試劑，和合適的溫度和pH。
本發明所選的引物與將被引發和擴增的具體的核酸序列“大體上互補”。這意味著它們必須足夠地互補來雜化各個核酸序列以形成所需的雜化產物并且然后用DNA聚合酶延伸。典型地，“大體上互補”的引物將含至少70％或更多的與靶序列互補的堿基。更優選80％的堿基是互補的，再優選90％的堿基是互補的。在最優選的條件下，引物對靶核酸序列具有90％至100％精確的互補性。
引物優選單鏈以達到最大擴增效率，但如需要能含雙鏈區域。它必須足夠長以起動在DNA聚合酶存在下延伸產物的合成。每個引物的確切大小將取決于希望的效用，引物的濃度和序列，靶序列的復雜性，反應溫度，和引物的來源。通常，本發明所用的引物將有12至60個核苷酸，優選，16至40個核苷酸。更優選，每個引物有18至35個核苷酸。
本文所用的引物能用已知的技術和儀器制備，包括例如ABI DNA合成儀(來自Applied Biosystems)或Biosearch8600 Series或8800 Series合成儀(來自Milligen-Biosearch公司)。使用此儀器的方法已知并例如在美國專利4965188(Gelfand et al.)中描述，引入作為參考。從生物來源分離的天然存在的引物也是可用的(如限制性內切酶消化)。通常一套至少兩個引物用于每個靶核酸。因此，多數引物能同時使用來擴增多數靶核酸。
如本文使用的，“探針”是大體上與靶核酸的核酸序列互補并用于擴增的靶核酸的測定或捕捉的寡核苷酸。
用在本發明中的引物和/或探針能可選地被標記。用本領域已知方法，引物和/或探針能用特異性結合配位體(如生物素)、酶(如葡萄糖氧化酶、過氧化酶、尿酸酶、和堿性磷酸酶)、放射性同位素、電子密度高的試劑、發色團、熒光團、燐光部分或鐵蛋白標記。標記物優選特異性結合配位體。更優選生物素或它的衍生物，抗生蛋白鏈菌素或它的衍生物或半抗原。
對PCR必須的另外的PCR試劑包括DNA聚合酶(優選耐熱性DNA聚合酶)，DNA聚合酶輔助因子和合適的dNTP′s。這些試劑能作為試驗盒的一部分，或以試驗裝置的試劑室分別提供。
DNA聚合酶是將脫氧核苷酸單磷酸分子加入到引物和模板的復合物中引物的3’-羥基末端的酶，但這種加入是以模板依賴方式進行的。通常，延伸產物的合成以新合成鏈的5’到3’的方向進行，直至合成結束。
有用的DNA聚合酶包括，例如，大腸桿菌DNA聚合酶I，T4DNA聚合酶，Klenow聚合酶，逆轉錄酶和別的在現有技術中已知的。DNA聚合酶優選耐熱性的，即指對熱是穩定的，并優選在較高溫度下具有活性的，尤其指用于起動反應和DNA鏈的延伸時所用的高溫。更特別的是，耐熱性DNA聚合酶用在如上所描述的聚合酶鏈反應中的高溫下基本上不是無活性的。這樣的溫度將取決于一系列反應條件而變化，包括pH，核苷酸組成，引物長度，鹽濃度和本領域已知的別的條件。
很多耐熱性DNA聚合酶已在現有技術中報導過，包括詳細論述它們的美國專利4965188(Gelfand et al.)和4889818(Gelfand et al.)，兩者均收作參考。尤其有用的聚合酶是從各種棲熱菌種，如水生棲熱菌(Thermus aquaticus)，Thermus ther mophilus，Thermus filiformis，和Thermus flavus中獲得的那些。別的有用的耐熱性聚合酶是從各種微生物來源包括Thermocollus literalis，Pyrococcus furiosus，Thermotoga種中得到的那些以及在WO-A-89/06691(1989年，7月，27日公開)中描述的那些。一些有用的耐熱性聚合酶是商業上可得到的，如來自Perkin Elmer的AppliTaqr，Tth，UITmaTM，和來自Stratagene的Pfu，和來自New England Biolabs的Vent和DeepVent。從有機體中分離天然存在的聚合酶，以及使用重組技術產生遺傳上可操作的酶，所述的這些技術也是已知的。
DNA聚合酶輔助因子指非蛋白質化合物，酶可依靠其激活。因此，沒有輔助因子的出現，酶是催化非活性的。一些材料已知是輔助因子，包括，但并非僅限于此，錳和鎂鹽，如氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽和脂肪酸鹽優選氯化鎂和硫酸鎂。
對于PCR，二個或更多的脫氧核苷-5’-三磷酸，如二個或更多的dATP，dCTP，dGTP，dTTP和dUTP是必須的。類似物如dITP和7-去氮雜-dGTP也是有用的。優選四個常用的三磷酸鹽(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)在一起使用。
這里所述的PCR試劑以合適的濃度提供并使用在PCR中提供靶核酸的擴增。擴增所必須的引物，DNA聚合酶，輔助因子和脫氧核苷酸-5’-三磷酸的最小量和合適的范圍從已知技術中很容易得知。DNA聚合酶是最小量通常是至少約0.5單位/100μl溶液，優選約2至約25單位/100μl溶液，更優選約7至20單位/100μl溶液。對于所給的擴增系統，別的量也可以是有用的。一單位這里定義為于74℃下將10nmol核苷酸(dNTP’s)總量加入到延伸的核酸鏈30分鐘所需要的酶活性量。引物最小量至少約0.075μmol，優選約0.1至2μmol，其它量是本領域公知的。輔助因子通常以約2至約15mmol存在。每個dNTP量通常是約0.25至約3.5mmol。
PCR試劑可分別提供，或以各種合并形式提供，或以有pH范圍約7至約9的緩沖溶液形式一起予以提供，其可用任何合適的緩沖劑，許多是現有技術中已知的。
能用在PCR中別的試劑包括例如對耐熱性DNA聚合酶特異的抗體，核酸外切酶和/或糖基化酶。抗體能用來在擴增前抑制聚合酶。在本發明中有用的抗體對耐熱性DNA聚合酶是特異的，在低于約50℃溫度抑制DNA聚合酶的酶活性，并在較高溫度下使之失活。有用的抗體包括，單克隆抗體，多克隆抗體，抗體片段。抗體優選單克隆的。在本發明中使用的抗體能用已知的方法制備如在Harlow等的《抗體實驗室操作》(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor，NY(1988)說明的。
代表性的單克隆抗體在U.S.5338671(Scalce等)中描述，其內容收作參考。兩種這樣的單克隆抗體很容易地使用常規方法由技術人員而獲得，起始材料包括雜交瘤細胞系HB11126或11127，保藏于美國典型培養物保藏中心(ATTC)(Rockville，MD)。單克隆抗體以對DNA聚合酶摩爾比約5∶1至約500∶1的量存在。
對耐熱性DNA聚合酶特異的抗體在本發明中能單獨或與核酸外切酶和/或糖基化酶一起使用，如U.S.申請登記號08/385019中所描述的，其于1995，2，7日申請，發明人Sutherland等，題目“在聚合酶鏈反應中為增加特異性使用核酸外切酶和/或糖基化酶作為抗聚合酶抗體的補充”。抗體，核酸外切酶和糖基化酶的結合使用減低了零循環假象的形成。在PCR中使用的合適的核酸外切酶包括，但非僅限于此，核酸外切酶III，核酸外切酶I，核酸外切酶，T7核酸外切酶，核糖核酸酶II，多核苷酸磷酸化酶和BAL31核酸酶。這此核酸外切酶商業上是可以得到的或能用本領域已知方法獲得。本發明所用的糖基化酶是特異地酶解非普通堿基的那些酶，即，在DNA中除A，G，C，T外的堿基和在RNA中除A，G，C，U外的堿基。優選時糖基化酶包括尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)，次黃嘌呤-DNA-糖基化酶，和3-甲-6-氨嘌呤-DNA-糖基化酶I和II。在優選的實施方案中，使用Taq聚合酶，抗Taq聚合酶的單克隆抗體，核酸外切酶III和尿嘧啶-N-糖基化酶。
靶核酸(DNA或RNA)能從上述的任何各種來源得到。通常，樣品用某種方法處理使DNA可以和引物和別的PCR試劑接觸。這指使用一種已知方法從樣品中排除不需要的蛋白質和細胞物質。
因為要被擴增和測定的核酸常常是雙鏈形式，所以在引發和擴增產生之前兩鏈必須分開(即，失活)。只用熱處理或其與如上所描述的分開核酸鏈的任何別的合適的物理的，化學的或酶解的方式結合能完成失活。開始的失活通常通過加熱懷疑含靶核酸的樣品進行，開始溫度約85℃至約100℃進行合適的時間，例如，約1秒至3分鐘。
然后失活的核酸鏈冷卻至使核酸鏈引發的通常約55℃至約70℃范圍的溫度。開始的失活之后冷卻核酸鏈需要的時間將根據PCR方法所用的儀器類型而變化。
當失活的核酸鏈對第二個溫度時，失活核酸鏈與含PCR試劑的反應混合物在合適的溫度一起培養，產生引物對核酸鏈的退火作用(雜化)和引物的延伸，形成引物延伸產物。通常，此溫度至少約50℃，優選的范圍約62℃至約75℃。培養的時間根據培養溫度和所需的延伸產物長度而有很大變化，但在優選的實施方案中，時間是約1至約120秒。用二個或三個不同的溫度進行每個PCR循環，其一溫度用于變性，第二或第三個溫度用于引發和/或引物延伸產物生成。
至少一個引物延伸產物產生之后的任何時間，能停止擴增并測定靶引物延伸產物(“擴增”的靶標)。可是，如果雜交的引物延伸產物繼續變性，PCR能以所需的引發，延伸，和變性這樣的許多循環進一步進行。進行的PCR循環的數量將部分地取決于所需要擴增的靶標量，并能容易地由本領域熟練技術人員測定。通常，至少進行20個循環，優選20至50個循環。
當擴增的成倍的靶核酸，尤其當靶標之一是低復制量靶標并且另一是高復制量靶標的情況，能在開始的PCR循環進行之后應用第二個復性步驟，如在美國專利申請登記號08/264102中所描述的，申請日1994年6月6日，申請人是Backus等，題目是“用中間的復性步驟擴增的方法”。至少15次基本擴增循環之后(基本擴增循環包括變性，引發和延伸)，以相同步驟進行第二個擴增循環，除了在每個變性步驟之后和引物退火之前包括復性步驟。復性通過冷卻反應混合物至第四個溫度完成，如美國專利申請08/264102所描述。
本發明中，用所需的PCR循環數擴增靶核酸之后，進行擴增后測定前培養步驟使DNA聚合酶失活，因此，增加測定敏感性。擴增后培養步驟進行的條件將取決于所用的耐熱性酶但結合的溫度和培養周期將是使酶失活的溫度和周期。優選通過約95℃至約120℃在約1秒至30分鐘培養含擴增靶物的PCR擴增混合物進行此擴增后培養步驟。擴增后培養步驟優選包括在100℃至110℃之間的溫度加熱15秒到10分鐘，更優選約105℃5分鐘以上。
當擴增后培養步驟進行后，能測定擴增的核酸靶物。能以多種已知的方式進行測定，如在美國專利4965188(Gelfand等)所描述的。例如，擴增的核酸能用Southern印跡，斑點印跡，或用標記的探針的非同位素寡核苷酸捕捉測定法檢測擴增的核酸。或者，用適當標記的引物進行擴增，并且擴增的引物延伸產物能用標記物測定的方法和設備測定。
在優選的實施方案中，擴增的靶核酸用為測定而標記并能直接或間接地與擴增的靶物雜交的寡核苷酸探針測定。探針可以是可溶解的或附著在固體載體上。在另一個優選的實施方案中，用于擴增靶核酸的一個或多個引物被標記，例如，用特異的結合部分標記。被標記的引物被合并至得到的引物延伸產物，其能用探針捕捉。與探針雜交的擴增的靶物的測定能通過使用本領域已知的合適的測定儀器和方法測定標記的探針或標記的擴增的靶物的存在而完成。某種標記物是可以不用測定儀器而肉眼可見的。
在更優選的實施方案中，用來擴增靶核酸的一個或多個引物用生物素標記并且生物素酰化的擴增的靶核酸與附著于固體載體的探針雜交。然后被結合的靶物通過在氧化劑如過氧化氫，和合適的染料形成組合物存在的條件下將它們與抗生蛋白鏈菌素-過氧化酶軛合物接觸而測定。例如，有用的染料提供試劑包括四甲基聯苯胺和其衍生物，和無色染料，如三芳基咪唑無色染料，如在美國專利4089747(Bruschi)所述的。
如這里所用的，當指時間時，“約”指±10％的時間界限。當用來指溫度時，“約”指±5℃。
下面的實施例包括具體描述本發明的實施，并非意味著以任何方式的限制。除非特別指明，所有百分數是重量比。實施例材料用已知方法如在EP-A-0482714所述的方法制備來自Thermus aquaticus的重組DNA聚合酶，其活性約250000單位/mg蛋白質。
下面實施例中所用的引物有下列順序5′-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT-3′(SEQ.ID NO.1)5′-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3′(SEQ ID NO.1)捕捉探針有下列順序5′-GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG-3′(SEQ.ID NO.3)用已知起始材料和方法制備用在下面實施例的引物和探針，其方法使用APPlide Bilsystems Model 380B，和用標準亞氨基磷酸酯(phosphoramidite)化學和ABI 1μ摩爾尺度快周期操作的三柱DNA合成儀。從Applied Biosystems得到核苷酸-3’-亞氨磷酸酯和核苷酸衍生物對照的大孔玻璃載體。引物有上面確認的順序。根據美國專利4962029，它們在5’末端用二個氨基四甘醇間隔團接著用單個商業可得的Dupont生物素亞氨磷酸酯被作用。根據美國專利4914210，探針在3’末端用二個四甘醇間隔團，接著用單個氨二醇連結基團被作用。用核酸提純柱，接著進行反相HPLC技術進行所有的提純。脫氧核苷(dNTP’s)從Sigma化學公司得到。
使用抗生蛋白鏈菌素-過氧化酶軛合物溶液，其含在磷酸緩沖鹽水溶液(24mmol磷酸鈉和75mmol氯化鈉)中的有商業上可得到的(Sigma化學公司)抗生蛋白鏈菌素和辣根過氧化酶軛合物，酪蛋白(0.5％)，和雷硫汞(0.5％)的軛合物，做為軛合劑穩定劑加入4’-羥基乙酰苯胺。實施例1和2中最終的軛合物濃度是1.1nM。實施例3中最終的軛合物濃度是0.28nM。
從Applied Biotechnology公司得到細胞巨化病毒，AD169DNA菌株。簡單地說，用常規方法從人類包皮成纖維細胞系提取DNA。病毒種類表病毒 細胞巨化病毒，AD169菌株用于繁殖的細胞系人類包皮成纖維細胞病毒制備庶糖密度梯度提純，1000×濃度病毒粒數1.65×1010vp/ml，1000×活性病毒的TCID50滴定率 10TCID50單位/ml，1000×DNA提取物具體情況容積0.1ml懸浮緩沖劑 10mM Tris/1mM EDTA，pH8.0提取物的制備SDS，蛋白酶K消化，接著苯酚/氯仿提取并且乙醇沉淀。從1ml純病毒制備1ml提取液。運輸和貯藏 于-70℃6×0.1ml冷凍(frozen)運輸。于-20℃或更冷貯藏。
無色染料懸浮液含瓊脂糖凝膠(0.5％)，4，5-雙(4-二甲氨基苯基)-2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)咪唑無色染料(250μmol)，二乙基三胺基五乙酸(100μmol)，3’-氯-4’-羥基乙酰苯胺(5mmol)，聚乙烯吡咯烷酮(112mmol)，和磷酸鈉，單堿基，1-水合物(10mmol)和過氧化氫(H2O2)(8.82mmol)。
洗滌溶液(pH7.4)含氯化鈉(373mmol)，乙二胺四乙酸二鈉(2.5mmol)，十二烷基硫酸鈉(38mmol)和ethylcerithio水揚酸，在磷酸鈉，單堿基1-水合物緩沖劑(25mmol)中的鈉鹽(25μmol)。
單克隆抗體用在反應混合物中。這些抗體“TP1-12.2”和“TP4-9.2”對來自水生棲熱菌的DNA聚合酶是特異的，更詳細的描述在美國申請登記號08/385019，1995年2月7日申請，發明人Sutherland等，題目“使用核酸外切酶和/或糖化酶做為抗聚合酶抗體的補充以增加聚合酶鏈反應中的特異性”。
聚合酶鏈反應混合物(75ml)含三(羥甲基)氨甲烷緩沖液(10mmol，pH8)，氯化鉀(50mmol)，氯化鎂(4mmol)，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP(各為0.3mM)，引物SEQID NO1和SEQ ID NO2(各為0.4μmol)，IV類型凝膠(100mg/mL)，Taq聚合酶(16單位/100μl)，和丙三醇(9.5％)。使用50倍摩爾過量(超過聚合酶)TP1-12.2和5×過量的TP4-9.2。
使用在美國專利5089233所述的自動PCR處理儀進行PCR擴增。
為了形成捕捉試劑，探針共價地與多聚的顆粒(1μm平均直徑)結合，多聚的顆粒用常規的乳液聚合技術自聚[苯乙烯-共-3(對-乙烯基-芐硫基)丙酸](95∶5重量比，1μm平均直徑)制備。水中的顆粒懸浮液用2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸緩沖液(0.1mol，pH6)洗滌，懸浮至約10％固體。洗過的顆粒樣品(3.3ml)稀釋到在緩沖液(0.1mol，與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(2.1ml，84mg/ml水)和探針983μl，44.44OD/ml納純水混合)中含固體3.33％。得到的懸浮液于50℃水浴加熱大約二小時，伴隨間斷的攪拌，接著離心。然后顆粒用含乙二胺四乙酸二鈉鹽(0.001mol)的三(羥甲基)氨甲烷緩沖液(0.01mol，Ph8)洗滌三次，并在其中重新懸浮至含4％固體。接著顆粒以2％固體正性膠固定于臨床診斷PCR囊中的不連續的點。使用臨床診斷囊檢測系統測定PCR產物。
別的試劑和材料從商業來源得到或用容易得到的起始材料和常規方法制備。為增加測定敏感性在產品測定之前進行擴增后培養步驟實施例1此實施例證明本發明將測定核酸產物，此核酸產物用PCR的方法通過應用擴增后培養步驟使聚合酶變性而生產。
正性庫通過擴增CMV靶物使用下面的PCR規程40-45個循環產生1、于95℃加熱15秒變性，并且2、于70℃引發和延伸30秒進行循環。產品濃度用凝膠電泳以已知濃度的DNA做為標準物質進行定量。然后得到擴增后PCR反應混合物如下所述使用。
除了產生PCR后反應混合物外，CMV負性產品庫通過使用上述PCR方案，不加入CMV DNA靶物在PCR反應混合物上進行PCR擴增而制備。
擴增后PCR反應混合物(10-7至10-8M)用CMV負性產品庫稀釋至1∶100至1∶5000，得到最終CMV DNA濃度1×10-10M，2.5×10-11M，或5×10-11M。稀釋的擴增后PCR反應混合物進行擴增后培養以使聚合酶失活。擴增后培養步驟于97℃或100℃進行2分鐘，或于100℃進行5分鐘。
擴增后培養之后，擴增的產物在臨床診斷PCR囊中用捕捉試劑通過于58℃捕捉靶核酸5分鐘而測定。然后捕捉的產物于55℃與抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶軛合物溶液接觸并培養1分鐘。用洗液于55℃下進行1分鐘洗滌，其后，加入含染料組合物并于40℃培養4分鐘。得到的信號用線性陣列掃描儀讀取。掃描儀測定反射密度(ΔDr)的變化。在染料顯色開始之前的起始讀數和染料顯色4分鐘之后得到的最終讀數之間的反射密度中的ΔDr是不同的。在可見的負性捕捉珠上掃描儀背景范圍是0.05至0.1Dr單位。
下面的結果表明擴增后培養步驟增加檢測敏感性擴增后產物 CMV_Dr培養條件 濃度 (掃描儀)97℃2分鐘 1×10-10M 0.17597℃2分鐘 5×10-10M 0.1497℃2分鐘 2.5×10-11M 0.11100℃2分鐘1×10-10M 0.265100℃2分鐘5×10-11M 0.19100℃2分鐘2.5×10-11M 0.13100℃5分鐘1×10-10M 0.435100℃5分鐘5×10-11M 0.31100℃5分鐘2.5×10-11M 0.21這些結果表明于100℃的5分鐘擴增后培養步驟增加了背景之上的有效測定界限至少四倍，并且可能至少五倍。基于這些結果，尤其通過將100℃培養期從2分鐘增加到5分鐘的改進，進行了第二個實驗，其于100℃進行15分鐘擴增后培養。實施例2在此第二個實驗中，如實施例1所述進行CMV DNA的擴增。得到的擴增后PCR反應混合物用CMV負性產品庫稀釋，并進行擴增后培養使聚合酶失活，如實施例1所述。擴增后培養步驟于100℃進行15分鐘。擴增后培養之后，擴增的產物如實施例1所述測定。
下面的結果表明擴增后培養步驟增加測定敏感性擴增后 產物CMV_Dr培養條件濃度 (掃描儀)97℃2分鐘1×10-10M 0.14097℃2分鐘1×10-10M 0.122100℃5分鐘 1×10-10M 0.336100℃5分鐘 1×10-10M 0.346100℃15分鐘1×10-10M 0.503100℃15分鐘1×10-10M 0.480這些結果表明于100℃增加擴增后培養步驟時間能得到額外的益處。實施例3為測定是否通過增加培養溫度能實現額外的測定敏感的收益，如實施例1所述進行CMV DNA擴增，并于100℃或103℃進行擴增后培養。調查于103℃的不同培養時間。另外，用最終軛合物濃度0.28nM的較少敏感測定化學進行此試驗擴增后 產物 CMV_Dr培養條件 濃度 (掃描儀)100℃5分鐘1×10-10M 0.152100℃15分鐘 1×10-10M 0.270103℃2分鐘1×10-10M 0.264103℃5分鐘1×10-10M 0.318這些結果證明至少額外的二倍的增加和可能的三倍的增加能通過將擴增后培養步驟溫度由100℃升至103℃并維持五分鐘的培養周期得到。
上述的所有公開出版物均收編為參考。
當前面所述的發明為清楚和便于理解的目的進行了詳細說明時，應該了解本領域普通技術人員從本公開物的理解能進行形式和細節的各種改變但并不超出本發明的真實保護范圍。
序列表(1)普通信息(i)申請人Backus，John W.
Kramer，Marcia L.
Falvo，Joseph(ii)發明題目使用擴增后培養步驟擴增并測定靶核酸(iii)序列數3(iv)通信地址(A)地址Stasia L.Ogden(B)街道￡°One J&J Plaza(C)城市New Brunswick(D)州New Jersey(E)國家USA(F)郵政編碼08933(v)計算機可讀形式(A)媒介類型柔性塑料磁盤(B)計算機IBMPC兼容的(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利信息卡#1.0，版本#1.25(vi)當前的申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Ogden，Stasia L.
(B)登記號36228(C)參考/標簽號CDS-92(ix)電訊信息(A)電話908-524-2819(B)傳真908-524-2808(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征；(A)長度25個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)序列描述SEQ ID NO1CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)序列描述SEQ ID NO2TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)序列描述SEQ ID NO3GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG
權利要求
1.擴增并測定靶核酸的方法，包括(i)將懷疑含所述的靶核酸的樣本與至少二個寡核苷酸和一種耐熱性的擴增酶接觸，其中所述的至少兩個寡核苷酸大體上是與所述的靶核酸的一部分互補，在此條件下擴增所述的靶核酸；(ii)使擴增的靶核酸變性以形成單鏈核酸；(iii)在1秒和30分鐘之間和95℃和120℃之間培養所述的樣本，作為擴增后培養步驟使所述的耐熱性的擴增酶失活；和(iv)測定是否存在所述的擴增的靶核酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其中使用四個寡核苷酸和一種耐熱DNA連接酶。
3.擴增并測定靶核酸的方法，包括(i)將懷疑含所述的靶核酸的樣本與四個不同的核苷酸三磷酸，一種耐熱性的DNA聚合酶，和二個引物接觸，其中所述的引物大體上是與所述的靶核酸互補，在此條件下擴增所述的靶核酸；(ii)使擴增的靶核酸變性以形成單鏈核酸；(iii)在1秒和30分鐘之間和95℃和120℃之間培養所述的樣本，作為擴增后培養步驟使所述的聚合劑失活；和(iv)測定是否存在所述的擴增的靶核酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的擴增后培養步驟在100℃至約110℃進行15秒至10分鐘。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述的擴增后培養步驟在約105℃進行0.5秒至5分鐘。
6.根據權利要求3所述的方法，其中所述的靶核酸是DNA或RNA。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述的靶核酸是DNA。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述的靶核酸是RNA。
9.根據權利要求3所述的方法，其中所述的核苷酸三磷酸是脫氧核苷三磷酸。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的脫氧核苷三磷酸是dATP，dCTP，dGTP，和dTTP。
11.根據權利要求3所述的方法，其中所述的耐熱性DNA聚合酶選自thermus aquaticus聚合酶，thermus thermophilus聚合酶，和Thermococcus litoralis聚合酶。
12.根據權利要求3所述的方法，其中至少一種所述的引物是標記的。
13.根據權利要求3所述的方法，其中所述的引物是標記的。
14.根據權利要求12所述的方法，其中至少一種所述的引物是用特異結合配位基標記的。
15.根據權利要求14所述的方法，其中特異結合配位基是生物素。
16.根據權利要求3所述的方法，其中所述的擴增的靶核酸用標記過的探針測定，所述的標記過的探針能與一個或更多的靶核酸雜交。
17.根據權利要求16所述的方法，其中標記過的探針與固體載體附著。
18.根據權利要求3所述的方法，其中至少一種所述的引物用特異結合配位基標記，所述的擴增的靶核酸用能與一個或更多的靶核酸雜交的探針測定。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述探針與固體載體附著。
20.擴增并測定靶核酸的方法，包括(i)將懷疑含靶核酸的樣本與四種不同的核苷酸三磷酸，一種耐熱性的DNA聚合酶，和兩個引物接觸，其中所述的至少一個引物用生物素標記，所述的引物大體上是與所述的靶核酸互補，在此條件下使靶核酸擴增；(ii)在0.5分鐘和5分鐘之間和約105℃培養所述的樣本，做為擴增后培養步驟使聚合酶失活；和(iv)通過將所述的生物素酰化的擴增的靶核酸與抗生物素蛋白-酶共軛物反應，接著將所述的酶與底物試劑反應得到可測定的比色的或化學發光的信號來測定是否存在所述的生物素酰化的擴增的靶核酸。
21.根據權利要求20所述的方法，其中通過將所述的生物素酰化的擴增的靶核酸與抗生物素蛋白-過氧化物酶軛合物接觸，接著在氧化酶的存在下進行過氧化酶反應來測定所述的生物素酰化的擴增的靶核酸，所述的氧化劑是能產生可測定的化學光學信號的或能產生可測定的比色的信號的魯米諾。
全文摘要
本發明涉及擴增和測定靶核酸的方法。其包括將懷疑含靶核酸的樣本與一種耐熱性的DNA聚合酶和兩個引物接觸，其中所述的引物大體上是與所述的靶核酸互補，在此條件下使靶核酸擴增。然后擴增的靶核酸變性形成單鏈核酸。擴增之后，樣品進行測定前培養步驟。樣品在1秒和30分鐘之間和95℃至120℃培養使所述的聚合劑失活。最后，測定是否存在擴增的靶核酸。
文檔編號C12N15/09GK1165862SQ97109620
公開日1997年11月26日 申請日期1997年3月11日 優先權日1996年3月11日
發明者J·W·貝克斯, M·L·克拉馬, J·法爾沃 申請人:莊臣臨床診斷有限公司