一種酶法改性提高卵白蛋白乳化性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白質功能改性技術領域，具體設及一種酶法改性提高卵白蛋白乳化 性的方法。
【背景技術】
[0002] 我國是世界上禽蛋產量最高的國家之一。由于其特有的生理特性導致無法長時間 膽藏，且由于歷史和民族背景，我國國內對于蛋品的深加工研究還是處于初級研究階段，從 科研技術到生產技術的轉換并不完全，實際生產中突出的問題還不能有效的解決。除此，消 費者對于蛋品深加工產品的理解與接受能力較低。而國外對于蛋品深加工產品巧日全蛋液， 蛋黃液，蛋白液等）接受程度較高，且對蛋品研究較為系統、透徹。因而對其進行深加工，提 高基礎農副產品附加值具有重要意義，不僅可W解決禽蛋積壓的問題，還能增加養殖戶的 收入。但大多數的研究集中在卵白蛋白起泡性上，對于卵白蛋白乳化性的研究報道很少。
[0003] 卵白蛋白是典型的球蛋白，由385個氨基酸殘基組成，含有埋藏于疏水核屯、內部 的自由琉基。卵白蛋白的疏基在蛋白質變性過程當中起很大作用。卵白蛋白具有乳化特性、 起泡性和膠凝性。由于卵白蛋白具有良好的凝膠和泡沫特性，是食品加工的重要原輔料，但 欠理想的乳化性限制其在乳化體系中的應用。
[0004]目前，改善蛋白功能特性的方法有：化學法，如牛新培等采用不同體積分數乙醇溶 液，對大豆7S球蛋白進行變性研究；物理法，如黃群等采用超高壓處理對卵白蛋白處理后， 研究卵白蛋白構想與功能特性；酶法，如涂勇剛等利用木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性，并 用響應面優化工藝參數等。針對酶法改性改善乳化性的酶類分別有植物蛋白酶，動物蛋白 酶、微生物蛋白酶和其它酶類。利用生物酶技術改善蛋白質性能的研究越來越多的被科學 家們接受，多偏愛使用植物蛋白酶，但利用微生物酶改性卵白蛋白的鮮有報道。
[0005] 卵白蛋白為憐酸糖蛋白，有高度二級結構的球型結構，相對分子質量為43.OkDa， 等電點為4. 5,50%W上為疏水氨基酸殘基，含3. 5%糖基及埋藏于疏水中屯、內部的1個二硫 鍵、4個自由琉基，琉基均包埋在蛋白質的疏水核屯、部分。卵白蛋白相對有序度較高，結構較 為致密，自然卵白蛋白在儲運過程中會轉化為熱穩定性的S-卵白蛋白構型。卵白蛋白的結 構獨特性決定其分子改性W改善其功能特性時，呈現出與其他常用食品蛋白不同的機理與 條件。
[0006] 在本發明中使用的酶類為微生物蛋白酶類，從提高乳化活性著手，采用堿性蛋白 酶分解卵白蛋白，形成小分子膚，減小水-油界面張力使得乳化液更為穩定。同時微生物蛋 白酶具有適用范圍廣、經濟、方便、易制得等特點，故而是今后蛋白酶類研究的重點關注對 象。隨著蛋品深加工、綜合利用的研究深入，雞蛋生物活性成分的多級聯產提純技術日趨發 展與完善，卵白蛋白作為雞蛋清中含量最大的蛋白組分，是各種方法提純其它功能活性成 分時必須首先分離的對象，采用生物、物理或化學方法改善卵白蛋白的功能特性，對促進其 高效綜合利用具有重要意義。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種酶法改性提高卵白蛋白乳化性的方法，從提高乳化活 性著手，采用堿性蛋白酶有限酶解卵白蛋白，減小水-油界面張力使得乳化液更為穩定。 [000引為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 一種酶法改性提高卵白蛋白乳化性的方法，所述方法包括如下步驟： (1) 將卵白蛋白溶解于去離子水中，配置成蛋白溶液； (2) 調節抑值，加入堿性蛋白酶進行酶解反應，酶解條件為：酶解時間195min，抑值 9. 0,酶解溫度38°C，底物濃度為1. 0%、酶用量為30000U/g; (3) 將酶解液置于80°C水浴鍋中純化5min; (4) 再置于冷水中迅速冷卻至室溫后，收集上清液。
[0009] 提取卵白蛋白的方法是鹽析法。選擇無污染、無裂縫、新鮮的雞蛋，破殼分離蛋白 與蛋黃，盡量使蛋白中無蛋黃選入，防止蛋黃中的蛋白質干擾實驗。蛋白與水按照2:1的比 列稀釋，在25°C、磁力攬拌條件下，緩慢加入（NH4)2S04至飽和度0.65,繼續攬拌1-化。混合 液在4500r/min的條件下離屯、20min，將所得到的沉淀，即為卵白蛋白粗蛋白。透析袋經煮 沸處理后，裝入粗蛋白，置于蒸饋水中，透析2地，每化換一次水，將透析袋中的溶液真空冷 凍干燥后，收集粉末即為卵白蛋白粗品純品。
[0010] 卵白蛋白溶解于去離子水中，配制成1.Og/mL的蛋白溶液。經過不同條件下酶法 改性后，取3血樣品加入27血去離子水中，加入10血食用大豆調和油，在室溫下W1000化/ min速度均質IminW形成乳化液。均質后立即從乳化液底部吸取200yL，加入lOmL質量 分數為0. 1%SDS中，充分混勻后，W0. 1%SDS溶液作空白，在500nm處測其吸光度Ai，即為乳 化活性EA。靜置30min后，再次測定吸光度A2,即得乳化穩定性ES=AiXt/ (Ai-Az)，t表示 為靜置時間。
[0011] 本發明的優點在于：卵白蛋白的主要功能特性有乳化性、起泡性、持水性和成膜性 能等，可作為乳化劑、保濕劑、可食性包裝膜、凝膠劑等，在食品中起著改善食品的口感和質 地、提高產品的穩定性和延長保質期的作用。對卵白蛋白進行改性能夠提高/改善卵白蛋 白的功能特性，進一步擴大其在食品中的應用。本發明采用堿性蛋白酶酶法改性改善卵白 蛋白乳化活性及乳化穩定性，解決了現有技術中卵白蛋白產品乳化活性差等缺點，本發明 卵白蛋白乳化活性的條件為：酶解時間195min，抑值9.0,酶解溫度38°C設定底物濃度為 1. 〇%、酶用量為30000U/g。在此條件下水解得到的產物的乳化活性為0. 95。未改性的卵白 蛋白乳化活性為0. 51，相比于最優條件下酶解，乳化活性相比提高86. 27%。
【附圖說明】
[0012] 圖1底物濃度對卵白蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響。
[001引圖2抑值對卵白蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響。
[0014] 圖3堿性蛋白酶用量對卵白蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響。
[0015] 圖4酶解溫度對卵白蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響。
[0016] 圖5酶解時間對卵白蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響。
[0017] 圖6未酶法改性（a)與酶法改性（b)卵白蛋白乳化液顯微圖像（X100)。
[001引圖7 Y=f (A，B)的響應面和等高線分析圖。
[0019] 圖8Y=f(A,C)的響應面和等高線分析圖。
[0020] 圖9Y=f(B，C)的響應面和等高線分析圖。
【具體實施方式】
[0021] 1材料與方法 1. 1實驗儀器和材料 1. 1. 1實驗儀器 722型可見分光光度計（上海舜宇恒平科學科學儀器有限公司）；FJ200-甜數顯高速 分散均質器（上海標本模型廠）；LXJ-IIB飛錯牌離屯、機（上海安亭科學儀器廠）；町-3數 顯恒溫磁力攬拌器（常州振華儀器有限公司）；抑5-2. 5真空冷凍干燥器（SIM，U.S.A); FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學科學儀器有限公司）；HH-S2恒溫水浴鍋（金壇市成 輝儀器廠）；P服J-4A實驗室抑計（上海精密科學儀器有限責任公司）；DM2000顯微鏡及 DFC280攝像系統（妹卡公司，德國）；27mm透析袋度I0SHARP，U.S.A)。
[0022] 1. 1. 2材料與試劑 鮮雞蛋（湘西吉首市市場購置）；堿性蛋白酶（2000,000U/g，北京奧博星生物技術有限 責任公司）；金龍魚食用調和油（廣東省深圳市嘉里糧油（中國）有限公司）；硫酸錠，氨氧 化鋼，濃鹽酸均為國產分析純試劑. 1. 2實驗方法 1. 2. 1卵白蛋白提取 提取卵白蛋白的方法是鹽析法。選擇無污染、無裂縫、新鮮的雞蛋，破殼分離蛋白與蛋 黃，盡量使蛋白中無蛋黃選入，防止蛋黃中的蛋白質干擾實驗。蛋白與水按照2:1的比列稀 釋，在25°C、磁力攬拌條件下，緩慢加入（NH4)2S04至飽和度0. 65,繼續攬拌化。混合液在 45(K)r/min的條件下離屯、20min，將所得到的沉淀，即為卵白蛋白粗蛋白。透析袋經煮沸處 理后，裝入粗蛋白，置于蒸饋水中，透析2地，每化換一次水，將透析袋中的溶液真空冷凍干 燥后，收集粉末即為卵白蛋白粗品純品。
[0023] 1. 2. 2酶法改性卵白蛋白的工藝流程 卵白蛋白一加蒸饋水（配成一定的底物質量濃度）一調節抑值一加酶扣/g) -酶解 一 80°C水浴5min純化酶一置于冷水中迅速冷卻至室溫一收集上清液 1.3卵白蛋白乳化活性測定 卵白蛋白溶解于去離子水中，配制成1.Og/mL的蛋白溶液。經過不同條件下酶法改性 后，取3血樣品加入27血去離子水中，加入10血食用大豆調和油，在室溫下W1000化/min 速度均質IminW形成乳化液。均質后立即從乳化液底部吸取200y以加入10血質量分數 為0. 1%SDS中，充分混勻后，W0. 1%SDS溶液作空白，在500nm處測其吸光度Ai，即為乳化活 性EA。靜置30min后，再次測定吸光度Az，即得乳化穩定性ES=AiXt/ (Ai-Az)，t表示為靜 置時間。
[0024] 1. 4試驗方法 1.4. 1單因素試驗 W乳化性為評價指標，W底物濃度、抑值、酶用量、酶解時間、酶解溫度為實驗考察因 素，分別進行單因素實驗，探討各因素變化對卵白蛋白乳化性的影響。
[00巧]1. 4. 2響應面法優化試驗 在單因素實驗基礎上，選取酶解時間、抑值、酶解溫度為影響因子，W卵白蛋白乳化活 性為響應值，設計Box-Behnken中屯、組合實驗，進行二次多項回歸方程擬合并優化分析得 到最佳工藝條件，再進行驗證性實驗。
[0026] 1. 5乳化液微觀結果觀察 水解后的酶解液和未水解的蛋白液立即在室溫下l〇〇(K)r/min均質IminW形成乳化 液，從混合液底部吸取1滴乳化液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在DM2000顯微成像系統下進 行觀察，放大倍數為100。
[0027] 2結果與分析 2. 1單因素試驗 2. 1. 1底物濃度 稱取蛋白配成不同底物濃度的蛋白溶液，調節抑值到7. 0,酶用量為30000U/g，酶解反 應溫度為45°C，酶解反應時間為90min，探究不同底物濃度對卵白蛋白乳化性的影響，結果 如圖1所示。結果表明，卵白蛋白隨著底物濃度增加，乳化活性緩慢下降，當堿性蛋白酶在 底物濃度（W/V)為1. 5%時，下降到最低值，隨后迅速上升；乳化穩定性逐漸增大，