專利名稱：抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種醫藥分子生物技術在基因治療中的應用，尤其是一種抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用。
背景技術：
RNA干擾(RNAi)是如今生命科學界的研究熱點，它是抑制基因表達的有力工具，有利于控制疾病中出現異常的蛋白合成進程或外源致病核酸的復制及表達。RNAi現象是由Fire等在線蟲中首次發現并報道。他們觀察到在線蟲中雙鏈RNA(dsRNA)可在轉錄后水平特異性抑制基因表達。隨后許多學者對線蟲、果蠅、植物和動物細胞進行了大量研究，證實RNAi是相當保守的生物模式。對果蠅地研究使RNAi機制基本被闡明當長鏈dsRNA進入細胞時，被一種稱之為Dicer的核酸酶所識別，并被剪切成21-23核苷酸的SiRNA，雙鏈的SiRNA被RNA解鏈酶所解鏈，以單鏈的形式與另一核酸酶結合形成RNA酶復合體，復合體中的RNA鏈象向導一樣引導酶復合體識別序列與之互補的mRNA，并將該mRNA水解，從而特異性的抑制基因表達。2001年，Ruchl等首先發現合成21bp的SiRNA可在哺乳動物細胞中特異并有效的抑制基因表達(Elbashir，et al.Science 296，550-553；2002)。
RNA干擾是體內消除基因突變的一種生理性保護機制，但如果人為的使用合成的針對某種特異性基因的SiRNA，能夠抑制該基因的表達從而有效地用于腫瘤及病毒的基因治療。所謂RNAi技術指基于RNAi現象而開發的抑制特定基因表達或降解特定RNA分子的分子生物學技術，根據RNAi的基本原理，可針對致病基因的DNA核苷酸序列，選擇其中一段與其它基因同源性較低的序列作為靶序列，通過體外合成或體內轉錄形成具有21-29個堿基的互補寡核苷酸短鏈(SiRNA)，在細胞中與靶基因的mRNA特異性結合，激活細胞自身的機制使其降解，從而特異性抑制該致病基因的表達。同樣，也可以用RNAi對基因的功能進行研究。體外合成是根據靶序列直接化學合成一對互補寡核苷酸短鏈(SiRNA)；而體內轉錄是將SiRNA模板克隆帶入帶有RNA聚合酶III類啟動子(U6)的載體中，在細胞內轉錄形成具有發卡樣結構的SiRNA而發揮作用。目前RNAi技術廣泛的應用于抗病毒、抗腫瘤和基因功能的研究，并在其中取得了大量令人鼓舞的結果。
傳統的腫瘤治療方法包括放療、化療和手術治療以其局限性使人們尋找新的抗腫瘤治療方法。隨著分子生物學的發展和對腫瘤分子機制認識的深入，現在人們已意識到腫瘤是一種多因子、多步驟和多基因參加的基因病。從基因水平治療腫瘤為腫瘤疾病的根本性治愈提供了希望。在這近十年中，腫瘤的基因治療發展非常迅猛，是目前腫瘤治療研究的熱點和新希望。腫瘤的基因治療方法有很多種，常用的包括腫瘤的細胞因子基因治療、增加腫瘤細胞免疫原性的基因治療、自殺基因療法、導入抑癌基因、封閉癌基因的表達等5種方法。但無論是那種基因治療方法，靶基因的篩選對整個基因治療來說至關重要。
端粒酶是一種細胞核糖體蛋白酶，其活性與復制衰老有直接關系，端粒酶的作用是在染色體3’末端加上TTAGGG這一重復序列，主要有兩種形式，一種是HumanTelomerase Reverse Transcriptase Catalytic Subunit端粒酶逆轉錄酶(hTERT)，另一種為Human telomerase RNA Component(hTR or hTERC)。美國科學家Kim等發現臨床進展期惡性腫瘤必須有一種特定的機制來維持端粒的長度，使腫瘤細胞具有無限增殖的潛力，而這種作用是通過重新激活或上調端粒酶活性來實現。隨著端粒的縮短，腫瘤的惡性程度逐漸降低，最終通過細胞衰老機制使腫瘤消退。但如果對將這些衰老的腫瘤細胞轉導hTERT，使之獲得端粒酶活性，腫瘤細胞能在老鼠體內繼續生長，且惡性度越來越高，這充分證明端粒酶在腫瘤生長中的作用至關重要。而此時使用針對hTERT的ShRNA處理這些腫瘤，其生長迅速受到抑制，最終腫瘤細胞出現衰老而消退。
雖然載體介導的RNAi技術誕生時間并不長，然而由于其便捷、高效和低成本的特點，已經成為研究使致病基因失活和研究基因功能有力的工具。本發明的載體為第三代慢病毒病毒載體，是去除了3’-LTR末端U3區域133-bp的基因序列的自身非活化載體(SIN載體)，有利于建立具有組織特異性啟動子的載體，用于SiRNA基因治療時，U6或H1-RNA啟動子不會受到5’-LTR的影響。同時因丟失了5’-LTR強啟動子功能，明顯減少了因插入失活而導致癌變的危險。該載體表達基因的下游插入了WPRE(post-transcriptional regulatory element from the genome of Woodchuck hepatitisvirus)元件，明顯提高了目的基因的表達水平，同時加強了目的基因在靶細胞表達的穩定性。該慢病毒載體的包裝質粒中去除了Tat元件，使得該載體更安全。本發明的中間載體pKS-U6帶有原核復制元件和基本的U6或H1-RNA啟動子單位，U6或H1-RNA啟動子是RNA聚合酶III家族啟動子，在體內能很好的介導發卡樣SiRNA的合成，是RNAi載體不可缺少的元件。
發明內容
本發明的目的在于針對傳統的腫瘤的基因治療方法中，RNA干擾技術的中目標基因的選擇、轉染效率等存在的問題給研究工作帶來許多不便的實際問題，提供一種新的慢病毒介導的抑制端粒酶hTERT表達的ShRNA及其在抗腫瘤方面的應用。
本發明的目的是這樣實現的一種抑制端粒酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用，其特征在于該ShRNA的序列為正義鏈5’-CCGGCCAAGTATTCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG-3’反義鏈5’-AATTCAAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGATCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG-3’；將所述的ShRNA插入到慢病毒表達載體中，再整合到染色體中穩定表達SiRNA，從而抑制hTERT的表達；所述的ShRNA序列可識別端粒酶hTERT，被識別的序列為CCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGA，該序列針對hTERT全長mRNA序列(NCBIAB085628.)第3036-3063堿基處。
在本發明中所述的ShRNA序列中除了包括TTCAAGAGA Loop序列，還包括其它類型的Loop序列；被識別的序列還包括該序列范圍內的其它19-27堿基序列。
在本發明中所述的ShRNA序列兩端為Age I和EcoR I酶切位點，可以直接克隆入pKS-U6載體中，或同時包括使用其它酶切位點克隆入含H1-RNA啟動子的載體序列。
在本發明中所述的ShRNA序列中包括2個Wobble堿基取代，從而形成以下SiRNAhairpin結構 在本發明中是將該ShRNA插入到慢病毒載體中后，用于抗腫瘤基因治療藥物中。
在本發明中ShRNA插入到慢病毒載體中是通過中間載體pKS-U6實現的。
本發明的優點在于端粒酶hTERT在80％以上的腫瘤中高表達，本發明涉及的ShRNA序列能有效地抑制hTERT的表達，從而使腫瘤細胞進入衰老狀態而停止生長。將該基因序列插入中間載體pKS-U6中，有利于形成Leading sequence一致的重組子，提高RNAi效率。將U6-hTERT-ShRNA盒式結構用工具酶切除后亞克隆入慢病毒載體中，形成慢病毒注射液，可直接進行瘤體內注射，用于治療腫瘤。慢病毒載體不同于腺病毒載體、逆轉錄病毒載體，它既可以轉染活化狀態的細胞，還可以轉染靜息細胞，而且不會插入失活，不致突變。
圖1是構建U6-hTERT-ShRNA結構示意圖；圖2是構建pLenti-hTERT-ShRNA結構示意圖；圖3是肝癌細胞系SMMC-7721轉導pLenti-hTERT-ShRNA后端粒酶活性明顯減弱；圖4是HepG-2轉導pLenti-hTERT-ShRNA后端粒酶活性明顯減弱；圖5～圖11是pLenti-hTERT-ShRNA抗肝癌作用的體內實驗的照片。
具體實施例方式實施例1ShRNA的設計與合成根據hTERT mRNA序列(NCBIAB085628.)，用Ambion在線軟件選擇5條19-28nt的核苷酸序列作為RNAi靶點。這個靶序列分別為hTERT1678-697 CAGTGCCAGCCGAATCTGhTERT21324-1349 ACACAGACCCCCGTCGCCTGGTGCAhTERT33036-3063 CCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGAhTERT42705-2728 AGGCTGGGAGGAACATGCGTCGChTERT52372-2396 TCATCGAGCAGAGCTCCTCCCTGAA根據以上靶序列寡核苷酸鏈，分別設計其ShRNA，并其末端引入Age I和EcoR I酶切位點，中間有Loop序列。
以hTERT3序列為例，合成Oligoes(由南京生物工程公司合成)。
正義鏈5’-CCGGCCAAGTATTCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG-3’反義鏈5’-AATTCAAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGATCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG-3’合成的ShRNA序列中包括2個Wobble堿基取代，在轉入細胞后形成以下SiRNAhairpin結構為
實施例2重組質粒的構建構建重組質粒的過程如圖1所示。取實施例1合成并純化的ShRNA片斷各10ug，退火成互補雙鏈。將中間載體pKS-U6用(本試驗室構建)Age I和EcoR I雙酶切后，凝膠電泳回收大片斷。質粒載體與ShRNA以1∶4用T4連接酶連接，轉化感受態菌DH5-α，用氨芐青篩選位點，形成pKS-U6-hTERT-ShRNA。BamH I和Sal I酶切初步證實有外源性基因片段插入，進一步使用ABI-7700測序，與要合成的目的片段對比后確認合成的5對hTERT-ShRNA序列正確，無基因突變(如圖1)。將測序正確的pKS-U6-hTERT-ShRNA質粒用BamH I和Sal I酶切，得到U6-hTERT-ShRNA盒式結構，將其定向克隆入pLenti-GFP載體的BamH I和Sal I位點中，形成pLenti-hTERT-ShRNA，酶切鑒定插入子存在，進一步測序后證明5對hTERT-ShRNA序列正確(如圖2所示)。
實施例3重組慢病毒pLenti-hTERT-ShRNA的生產①、在100mm培養皿(Corning)中接種106個293T細胞，待細胞長至70-80％融合時作1∶3傳代，用含10％小牛血清(購于杭州四季青公司)的DMEM(購于GIBCO-BRL公司)作為培養基，在5％CO2培養箱中培養24h。
②、待細胞達70％融合時，將pLenti-hTERT-ShRNA質粒和慢病毒載體的包裝質粒一起，用磷酸鈣共沉淀法進行轉染。
③、待細胞生長24h后換細胞培養基，置37℃5％CO2培養箱中培養，24h后收獲病毒上清，換細胞培養基。
④、收獲轉化后72h病毒上清，用漂白劑處理細胞培養皿以破壞病毒生產細胞。
⑤、將病毒上清作50000rpm超速離心，吸取病毒上清層。
⑥、測病毒滴度，用PBS調整病毒滴度為1012VP/ml。
⑦、使用0.22μm的濾膜進行超濾，然后包裝入2ml的西林瓶中(每西林瓶含1ml)。-80℃的深低溫冰箱保存。
⑧、對病毒進行熱源檢測、微生物檢測，同時用PCR法檢測是否有野生病毒復制(RCL)，確保無熱源，無細菌、真菌、病毒等微生物污染，無野生病毒復制。
實施例4細胞感染分別取2盤10cm培養皿肝癌細胞系HepG2和SMMC-7721，中待其長至80％融合時，作1∶3傳代，分別獲6盤HepG2和SMMC-7721肝癌細胞，24h后分別加入5種pLenti-hTERT-ShRNA慢病毒上清3ml，設1盤空載體對照，共6組。37℃培養箱中共育3h，加入7ml含血清的RPMI1640。48h后加入puromycin篩選，分別獲得抗性克隆，用于端粒酶活性的檢測。
實施例5體外實驗端粒酶活性檢測和hTERT的表達情況。
1、TRAP assay離心收集SMMC-7721和HepG2，并用K+、Ca+的PBS洗兩次，加入100ul TRAP-lysisbuffer(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA，0.1mmol/L PMSF，5mmol/L b-硫基乙醇，0..5％CHAPs，10％甘油)，充分混勻后冰上放置30min，12000r/min 4度離心20min，收集上清并用考馬思亮蘭染色，用紫外分光光度法于595nm波長處測定，蛋白濃度并稀釋為2ug/ul。采用Kim報導的TRAP法(詳見Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomeraseactivity with immortal cells and cancer.Science，1994，2662011-2015)用端粒酶檢測試劑盒(購自CHEMICON公司)進行端粒酶活性測試，其結果如圖3所示。在圖中TRAP assay.0heat control；1SMMC-7721-pLenti-hTERT-ShRNA；2HepG-2-pLenti-hTERT-ShRNA；3SMMC-7721；4Hela-pLenti-hTERT-ShRNA；5BJ-hTERT-pLenti-hTERT-ShRNA；6Hela cells；7BJ-hTERT；8MJ-90-hTERT；93T3 cells as positive control。
2、RT-PCR①RNA的抽提各收集5×106SMMC-7721和HepG2，加入1ml TriPure，混勻，靜置5min。在管中再加入0.2ml氯仿，振蕩15s，室溫靜置8分鐘。12000g于4℃離心15分鐘。取上清500μl移至另一個用RNase free離心管中，加0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻15s，于室溫靜置8分鐘，12000g于4oC離心10分鐘，棄干上清。在管中加入1ml75％的乙醇，振蕩混旋，7500g于4oC離心5分鐘，棄上清后于室溫干燥5min。溶于50μl DEPC處理過的ddH2O，吹吸混勻，60℃水浴15分鐘，取3μl加入197μl的ddH2O稀釋后測濃度和OD260/OD280，保存于-70℃，待用。
②RT-PCR測定在用RNase free的PCR管中加入9.5μl的nuclease-free water，2μl Oligo dT(0.5g/l)和4g tRNA(0.5g/l)，PCR儀內70℃反應5分鐘，立即放到-20℃冰箱，冰浴5min，再加入5μl M-MLV 5×buffer，2.5μl dNTP(10mM)，1μlRNasin-Ribonuclease inhibitor，1μl M-MLV，輕彈管壁混勻，短暫離心，42℃反應60分鐘，獲得了cDNA。取上述cDNA 1μl加入35.5μl ddH2O，再加入5μl10×Buffer(含25mM Mg2+)、1μl dNTP、2μl引物(sense，antisense各1μl)和0.5μl(5unit/μl)Taq DNA聚合酶，在MJ Minicycler PCR儀進行擴增。擴增參數根據具體基因primer(sense5’gcctctagatttcatccagccaca3’；antisense5’cctctctcccctgcaacacaca3’)進行設定，并進行優化。
GAPDH 450bpSenseCTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA，AntisenseATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA，.
hTERT 145bpSense 5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’；Antisense5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’；PCR產物在含1μg/ml EB的1％agarose膠進行電泳，用UVP成像系統拍照，如圖4所示。在圖中RT-PCR1SMMC-7721；2SMMC-7721-pLenti-TERT-ShRNA；3HepG-2；4HepG-2-pLenti-TERT-ShRNA；5Hela cells；6Hela-pLenti-hTERT-SiRNA。
實施例6pLenti-hTERT-ShRNA治療人肝癌Scid鼠移植腫瘤1、材料與方法人肝癌細胞系HepG2和SMMC-7721(均可購自ATCC)為本實驗室傳代培養。Scid鼠重度聯合免疫缺陷小鼠，購自南京大學動物模式中心。
2、將Scid小鼠分為7組，每組6只。
第一組為將轉導pLenti-hTERT-ShRNA的SMMC-7721細胞(5×104/只)直接皮下注射。
第二組為將轉導pLenti-hTERT-ShRNA的HepG2細胞(5×104/只)直接皮下注射。
第三組轉導空質粒的SMMC-7721細胞(5×104/只)皮下注射。
第四組為轉導空質粒的HepG2細胞(5×104/只)皮下注射。
第五組為轉導pLenti-hTERT-ShRNA的SMMC-7721細胞(5×104/只)腎包膜下移植。
第六組為轉導pLenti-hTERT-SiRNA的HepG2細胞(5×104/只)腎包膜下移植。
第七組為轉導空質粒的HepG2腎包膜下移植。
圖5A為SMMC-7721-pLenti-hTERT-SiRNA皮下接種后42天的照片，B為HepG-2-pLenti-hTERT-SiRNA皮下接種后42天的照片，由圖可見均無明顯腫瘤生長；C為轉導空質粒的SMMC-7721皮下接種后21天的照片，D為HepG-2皮下接種后21天的照片，由圖可見腫瘤生長迅速，需要及時處死荷瘤scid小鼠；E為SMMC-7721-pLenti-hTERT-SiRNA腎包膜下移植后42天的照片，F為HepG-2-pLenti-hTERT-SiRNA腎包膜下移植后42天的照片，由圖可見腫瘤生長極其緩慢。G為HepG-2轉導空質粒后腎包膜下移植21天的照片，由圖可見腫瘤迅速腹腔轉移需處死小鼠。
以上實施例不是對本發明的具體限制，在具體實施時，在權利要求中涉及的28個堿基的被識別序列中，針對其中其他19-27個序列的設計ShRNA序列也同樣可以實施到本發明中。
<110>南京中脈生物醫藥有限公司<120>抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用<140>200610038270.7<141>2006-02-14<160>2<210>1<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>stem_loop<222>(33)...(41)<223>人工設計的正義鏈<400>1ccggccaagt attcctgttc aagttgactc gattcaagag atcgagtcag cttgagcagg 60aatgcttggt ttttg 75<210>2<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>stem_loop<222>(39)...(47)<223>人工設計合成的反義鏈<400>1aattcaaaaa ccaagcattc ctgctcaagc tgactcgatc tcttgaatcg agtcaacttg 60aacaggaata cttgg 7權利要求
1.一種抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用，其特征在于該ShRNA的序列為正義鏈5’-CCGGCCAAGTATTCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG-3’反義鏈5’-AATTCAAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGATCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG-3’；將所述的ShRNA插入到慢病毒表達載體中，再整合到染色體中穩定表達SiRNA，從而抑制hTERT的表達；所述的ShRNA序列可識別端粒酶hTERT，被識別的序列為CCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGA，該序列針對hTERT全長mRNA序列(NCBIAB085628.)第3036-3063堿基處。
2.根據權利要求1所述的抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用，其特征在于所述的ShRNA序列中還包括TTCAAGAGA Loop序列；被識別的序列還包括該序列范圍內的其它19-27堿基序列。
3.根據權利要求1所述的抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用，其特征在于所述的ShRNA序列兩端為Age I和EcoR I酶切位點，可以直接克隆入pKS-U6載體中，或同時包括使用其它酶切位點克隆入含H1-RNA啟動子的載體序列。
4.根據權利要求1所述的抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用，其特征在于ShRNA序列中包括2個Wobble堿基取代，從而形成以下SiRNA hairpin結構
5.根據權利要求1～4擇一所述的抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用，其特征在于將該ShRNA插入到慢病毒載體中后，用于抗腫瘤基因治療藥物中。
6.權利要求5所述的該ShRNA插入到慢病毒載體中是通過中間載體pKS-U6實現的。
全文摘要
本發明涉及一種抑制端粒酶逆轉錄酶hTERT表達的ShRNA在抗腫瘤中的應用。該ShRNA的序列為正義鏈5’－CCGGCCAAGTAT TCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG－3’反義鏈5’－AATTC AAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGATCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG－3’；將所述的ShRNA插入到慢病毒表達載體中，再整合到染色體中穩定表達SiRNA，從而抑制hTERT的表達；所述的ShRNA序列可識別端粒酶hTERT，被識別的序列為CCAAGCATT CCTGCTCAAGCTGACTCGA，該序列針對hTERT全長mRNA序列(NCBI AB085628.)第3036－3063堿基處。
文檔編號A61P35/00GK1843511SQ200610038270
公開日2006年10月11日 申請日期2006年2月14日 優先權日2006年2月14日
發明者孫倍成, 王尤山, 羅望, 徐玲, 許淼, 張泓 申請人:南京中脈生物醫藥有限公司