專利名稱：Ps-341在制備協同誘導分化治療白血病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬的化合物的應用，涉及化合物PS-341與維甲酸類藥物在制備聯 合治療白血病藥物中的應用，尤其是涉及化合物PS-341在制備協同促進維甲 酸類藥物誘導分化治療白血病的藥物中的應用。
背景技術：
誘導分化治療是腫瘤化學治療的一個重要領域，它應用化學藥物誘導腫瘤 細胞分化并逆轉其增殖、浸潤、轉移等惡性表型，使其成為正常或接近正常的 細胞，從而達到治療腫瘤的目的。維甲酸類化合物是被研究和臨床應用最為廣 泛的分化誘導劑，其中全反式維甲酸(all-trans retinoid acid, ATRA)是第一個 成功應用于白血病治療的誘導分化藥物，能夠特異性誘導急性早幼粒細胞性白 血病(APL)細胞分化成熟。1988年，上海瑞金醫院率先應用ATRA治療24 例APL， 23例取得完全緩解(CR)。隨后進行的一系列大樣本隨機對照臨床研 究進一步驗證了 ATRA治療APL的有效性，明顯降低了化療引發的出血相關 死亡率，提高了APL的CR率。
維甲酸對APL細胞的誘導分化作用，使大多數患者臨床上得到緩解，但 隨著病人生存期的延長，維甲酸使用過程中仍有一些問題尚待研究解決，如治 療中維甲酸毒副作用，特別是高白細胞綜合征及維甲酸綜合征；緩解后單用維 甲酸往往數月內復發；治療過程中細胞內維甲酸結合蛋白(CRABP)高表達及 細胞色素P450酶促分解代謝使維甲酸治療失效等。因此，尋找高效、低毒的 新型化合物，有效促進維甲酸的誘導分化作用，縮短治療進程且改善白血病患 者的預后及解決相關耐藥問題是一個亟待解決的問題。
蛋白酶體抑制劑PS-341 (Bortezomib)，分子式為C19H25BN404，是美國千 年制藥公司開發的一種二肽硼酸衍生物，商品名為Velcade(萬珂)。PS-341作 為一種蛋白酶體抑制劑使用，可強烈而可逆地抑制蛋白酶體的功能，導致一些 本應該被清除的蛋白質在細胞內大量堆積，進而引起細胞凋亡。目前，化合物 PS-341通過誘導細胞凋亡而發揮的抗腫瘤作用備受矚目，己臨床應用于治療復 發性、難治性的多發性骨髓瘤及部分非霍奇金淋巴瘤，對其它腫瘤的安全性、 有效性評價也正在進行中。然而，PS-341能否促進維甲酸類藥物對白血病細胞
的誘導分化作用，從而改善白血病患者的預后及解決相關耐藥問題等尚未見報 道。
發明內容
本發明的目的是提供化合物PS-341在制備協同促進維甲酸類藥物誘導分 化治療白血病的藥物中的應用，PS-341 (Bortezomib)是蛋白酶體抑制劑，分 子式為C19H25BN404，化合物PS-341的濃度為lxlO-1G~lxl(r8M，維甲酸的濃 度為lxl{T9~lxl(T5M。
化合物PS-341優選的濃度為0.5xl(T8M，維甲酸優選的濃度為lxl(T6M。
化合物PS-341對白血病細胞無明顯的誘導分化作用，但它可加速、加強 維甲酸的誘導白血病細胞分化作用，表現為促進維甲酸類藥物對白血病細胞的 增殖抑制作用，促進白血病細胞表面分化特異性抗原CDllb的表達及增加分 葉核的細胞數目，縮短獲得CR時間，有助于減輕維甲酸的毒副作用及降低維 甲酸使用過程中耐藥問題的發生。
化合物PS-341能夠明顯促進維甲酸對白血病細胞增殖抑制作用，同時促 進白血病細胞分化表面特異性抗原CDllb表達增加，細胞核質比減小，分葉 型核細胞數目較維甲酸單用組明顯增多。化合物PS-341促進維甲酸誘導白血 病細胞分化的作用具有明顯的濃度和時間依賴性。
化合物PS-341在制備協同促進維甲酸在誘導分化治療白血病的藥物中的 應用機制在于作為一種蛋白酶體抑制劑，化合物PS-341通過抑制蛋白酶體 活性，使維甲酸作用過程中被泛素-蛋白酶體系統降解的維甲酸受體RARa降解 減少，從而提高白血病細胞對維甲酸的敏感性。
總之，化合物PS-341對維甲酸誘導白血病細胞分化能力的增強作用為該 藥物開辟了新的應用領域，同時為進一步提高白血病患者的療效，改善耐藥及 相關預后情況提供了可能性。
圖1是不同濃度的PS-341與維甲酸合用對HL60細胞的增殖抑制作用。
圖2是不同濃度的化合物PS-341與維甲酸合用對HL60細胞表面分化抗原 CDllb表達的影響。
圖3是化合物PS-341與維甲酸合用對HL60細胞內維甲酸受體RARa蛋白 表達的影響。
具體實施例方式
本發明結合附圖和具體實施例作進一步的說明。實施例1:
用不同濃度的化合物PS-341 (1x10—1Q~lxlO—7M)分別與維甲酸(lxl(T8 lxl(T6M)共同處理HL60細胞株，120小時后，加入5 mg/ml的MTT溶液， 再孵育4小時，然后吸棄液體加入DMSO將甲瓚完全溶解后用酶標儀測定其 在570nm處測定吸光度。結果發現，化合物PS-341單獨作用于HL60細胞， 高濃度的PS-341 (lxl(T8~lxl(T7M)顯著抑制細胞增殖。但是低濃度的PS-341 (1X10"Q 1><10-8M)單獨作用，對HL60細胞增殖無明顯影響，但能明顯促進 維甲酸的生長抑制作用，且呈明顯的濃度依賴關系。結果參見圖l。
實施例2:
用不同濃度的化合物PS-341 (lxlO-1Q~lxl(T8M)分別與維甲酸(lxl(T6M) 合用處理HL60細胞株，在處理后72小時收集細胞，檢測細胞表面分化特異 性抗原CDllb的表達。細胞用冰PBS漂洗3次后用3%BSA在室溫下封閉45 min，然后用CDllb-PE標記的單克隆抗體避光孵育30min，經PBS洗滌后用 流式細胞儀進行檢測，并用CellQuestPro軟件分析。結果發現，化合物PS-341 可明顯促進維甲酸誘導分化表面特異性抗原CDllb表達，分化的細胞隨PS-341 濃度的增大、處理時間的延長而增多，而PS-341單用無明顯的誘導分化作用。 結果參見圖2。
實施例3:
用不同濃度的化合物PS-341 (lxl(T1() lxlO-8M)分別與維甲酸(lxl(r6M) 合用處理HL60細胞株，在處理后120小時收集細胞，用瑞氏-吉木薩染色法觀 察細胞核形態變化。維甲酸作用后，細胞核質比明顯減小，并出現明顯的分葉 型核，而化合物PS-341與維甲酸合用組分葉型核的細胞數目較維甲酸單用組
明顯增多。
實施例4:
將化合物PS-341 (0.5xl(T8M)與維甲酸(lxl(T6M)共同處理HL60細胞 株，在處理后72小時收集細胞，并用細胞裂解液裂解細胞抽取蛋白質，然后 用RARa抗體(購自美國Santa Cruz公司)進行Western blot免疫印跡。結果 發現，PS-341能部分抑制維甲酸誘導的維甲酸受體RARa的降解，從而增加 HL60細胞對維甲酸的敏感性。結果參見圖3。
權利要求
1.PS-341在制備協同誘導分化治療白血病藥物中的應用，所述PS-341是蛋白酶體抑制劑，該化合物的分子式為C19H25BN4O4，所述應用中化合物PS-341的濃度為1×10-10～1×10-8M，維甲酸的濃度為1×10-9～1×10-5M。
2. 根據權利要求l所述的應用，其特征是所述應用中化合物PS-341的 濃度為0.5xl(T8M，維甲酸的濃度為lxlO_6M。
3. 根據權利要求l所述的應用，其特征是所述化合物PS-341制備的藥 物與維甲酸類藥物一起應用。
全文摘要
本發明的目的是提供化合物PS-341在制備協同促進維甲酸類藥物誘導分化治療白血病的藥物中的應用，PS-341(Bortezomib)是蛋白酶體抑制劑，分子式為C<sub>19</sub>H<sub>25</sub>BN<sub>4</sub>O<sub>4</sub>，化合物PS-341的濃度為1×10<sup>-10</sup>～1×10<sup>-8</sup>M，維甲酸的濃度為1×10<sup>-9</sup>～1×10<sup>-5</sup>M。化合物PS-341能夠明顯促進維甲酸對白血病細胞增殖抑制作用，同時促進白血病細胞分化表面特異性抗原CD11b表達增加，細胞核質比減小，分葉型核細胞數目較維甲酸單用組明顯增多。化合物PS-341促進維甲酸誘導白血病細胞分化的作用具有明顯的濃度和時間依賴性，本發明為化合物PS-341開辟了新的藥物應用領域。
文檔編號A61P35/00GK101336925SQ200810062999
公開日2009年1月7日 申請日期2008年7月11日 優先權日2008年7月11日
發明者何俏軍, 偉 呂, 應美丹, 方艷芬, 朱迪峰, 波 楊, 沈敬山, 羅沛華 申請人:浙江大學