一種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞的方法，通過向貼壁培養的鼠胚胎干細胞團狀克隆中加入含有dorsomorphin與noggin、SB431542和CHIR99021的誘導培養基，誘導鼠胚胎干細胞細胞形成玫瑰花狀神經球；隨后加入含有bFGF的第二階段誘導培養基懸浮培養形成懸浮的神經球；最后將神經球消化成單細胞，然后用第三階段誘導培養基貼壁培養形成具有較長期的自我增殖與更新的神經上皮細胞。本發明摒棄了傳統的形成EB方法，縮短了分化時間，而且分化的效率達到了95％以上。本發明可快速誘導NE細胞替代NSC細胞功能治療中樞系統損傷，具有很高的臨床應用性。
【專利說明】一種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞 的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為 神經上皮細胞的組合物，尤其是利用該組合物快速直接定向的誘導鼠胚胎干細胞分化為神 經上皮細胞的方法，以及進一步將神經上皮細胞定向誘導分化成神經元細胞或神經膠質細 胞的方法。
【背景技術】
[0002] 神經干細胞（neural stem cell,NSCs)是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母 細胞，存在于成體腦組織中的一種干細胞。主要分布在腦室管膜，室下區，紋狀體，海馬齒狀 回等區域，是成年神經系統中可以自我更新和分化為多種神經類細胞的一種多能細胞，其 可分化為多種神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞等。神經干細胞的發現，給中樞神經系 統損傷和其他大腦退行性疾病的治療帶來了希望。NSCs作為一種全新的生物學治療方法， 隨著分離培養、體外擴增等技術的日臻完善，NSCs在中樞神經損傷修復中具有潛在的應用 價值，其應用主要集中以下幾方面：一是直接細胞移植進行替代治療，神經干細胞作為細胞 移植的來源，可以通過神經干細胞的體外移植或體內神經干細胞的激活，分化為神經元和 膠質細胞，與已經存在的細胞結構整合到一起；二是以NSCs作為基因載體，攜帶治療作用 的報告基因進行移植，從而達到細胞替代和基因治療的雙重作用；三是通過對生長因子和 細胞因子的研究，誘導自身的NSCs分化進行神經自我修復。由于神經干細胞是從大腦組織 中提取出來的成體干細胞，來源非常有限，目前在臨床應用的可能幾乎為零。因此，急需一 個替代物來取代其治療價值。
[0003] 小鼠胚胎干細胞于1981年首次由Evans和Kaufman成功分離建系，它們來源于胚 泡的內細胞團（inner cell mass, ICM)，這些細胞具有穩定的二倍體核型，在體外可以分化 為三個胚層的多種細胞。將小鼠胚胎干細胞重新植入胚泡可以參與形成胚胎。體外ES細 胞維持未分化狀態依賴于一些細胞因子的存在，如白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF)。撤去這種自我更新的刺激信號后，ES細胞很快分化為多種細胞。這些屬性 使ES細胞成為非常有用的發育生物學和功能基因組學研究的生物系統。
[0004] 神經上皮細胞是一種干細胞，可細胞分裂產生兩個完全相同的細胞。而后， 子細胞會經由不對稱的細胞分裂，產生一個與親代相同的細胞及另一個非干細胞的先 驅細胞或神經元。文獻（Billon N，Jolicoeur C，Ying QL，et al.，Journal of Cell Science，2002, 115)公開了一種誘導小鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞的方法，然而這 種利用EB自然分化產生的神經上皮細胞，分化比例非常低，而且是瞬時產生的不具有較長 期的自我增殖與更新的能力，無法做為細胞產物長期體外培養，凍存與利用。
[0005]文獻（Falk A, Koch P, Kesavan J, et al. PL0S One, 2012, 7)公開了一種誘導人胚 胎干細胞分化為可以較長時間進行自我增殖與自我更新的神經上皮細胞的方法，但是其是 通過自然分化的方法同時加入生長因子EGF和bFGF，誘導時長達30天以上，其利用價值大 大降低。也有研究者通過加入SMAD信號通路的兩種抑制劑Noggin與SB431542,誘導人胚 胎干細胞分化為神經干細胞，但其誘導效率較低，且耗時較久（Chambers，S. M.，et al.，Nat Biotechnol, 2009. 27, 3)〇
[0006] 小鼠和人的ES細胞有較大差異： 1. 二者的形態不同：小鼠ES細胞形成多層鳥巢狀的集落，難以分清單個細胞，人 ES細胞形成相對扁平的單層細胞集落，單個細胞密集排列，可見清晰的核仁（Buecker C, Geijsen N, Cell Stem Cell, 2010, 7)； 2. 二者維持未分化的機制不同（Hanna J,Markoulaki S,Mitalipova M,et al, Cell Stem Cell, 2009, 4)； 3. 二者表達的分子標志有所不同（Takahashi and Yamanaka, Cell, 2006, 126 ; Takahashi K,Yamanaka S, Cell, 2007, 131)。因此在實際中，小鼠和人的ES細胞研究工作 是各自相對獨立的研究體系。
[0007]目前尚無一種方法可以快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為具有自我更新與 增殖能力的神經上皮細胞。
【發明內容】
[0008]目前還沒有關于從小鼠胚胎干細胞越過EB階段直接分化生成為具有較長期自我 復制與更新能力的神經上皮細胞（Neuroepithelial cells, NE)的報導。本發明首次報導 了利用幾種小分子直接誘導分化小鼠胚胎干細胞生成神經上皮細胞的快速有效方法，利用 本發明的方法生成的神經上皮細胞（NE)具有較長期的自我更新能力與自我復制的能力， 并類似神經干細胞，表達神經干細胞的標記物Nestin和Soxl，可進一步誘導NE定向分化為 多種神經細胞如神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞等，為臨床應用提供了可能。
[0009] 本發明具體技術方案如下： 一種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞的方法，包括如下步驟： (1) 第一階段：向貼壁培養的鼠胚胎干細胞團狀克隆中加入含有dorsomorphin、 noggin、SB431542和CHIR99021的誘導培養基，連續培養若干天，一般為3-5天，細胞每天 換液，誘導鼠胚胎干細胞形成玫瑰花狀神經球； (2) 第二階段：消化并挑出第一階段的神經球，加入含有bFGF的第二階段誘導培養基 懸浮培養形成懸浮的神經球； (3) 第三階段：將神經球消化成單細胞，然后用第三階段誘導培養基貼壁培養形成具 有較長期的自我增殖與更新的神經上皮細胞。
[0010] 上述方法中的鼠胚胎干細胞團狀克隆可以用常規方法制備得到，例如：首先，用基 質膠（BD)包被24孔板（Corning)。細胞計數后，將小鼠胚胎干細胞（mESCs，購買于上海 斯丹賽生物技術有限公司，品系Ml)以1x103/孔的數量種在細胞培養板上。每個孔加入 400 yl的培養基，并隔天換液。3-5天后細胞即長成團狀克隆。
[0011] 上述方法中的第一階段誘導培養基包含有DMEM/F12神經基礎培養基、N2培 養基、B27 培養基、NEAA 和 0 -Mercaptoethanol，優選配方為：DMEM F12(Invitrogen)， lxN2(Invitrogen),lxB27(Invitrogen) , lx NEAA(Invitrogen),0. ImM^-Mercaptoet hanol(Invitrogen),lOOng/ml noggin(R&D Systems),20u M SB431542(Sigma),2u M dorsomophin (Sigma)，3 ii M CHIR99021 (Stemgent)。
[0012] 上述方法中的第二階段誘導培養基包含有DMEM/F12神經基礎培養基、N2培養 基、bFGF 和葡萄糖，優選配方為：DMEM F12，lx N2,20ng/ml bFGF(P印rotech)，1.6g/L glucose(Sigma)〇
[0013] 上述方法中的第三階段誘導培養基包含有DMEM/F12神經基礎培養基、N2培養基、 B27培養基、胰島素、葡萄糖、bFGF和EGF，優選配方為DMEM F12，lxN2，liil/ml B27,20ug/ ml insulin(Wako Pure Chemical Industries), 1. 6g/L glucose(Sigma),20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF(R&D Systems)〇
[0014] 上述方法中，第一階段向鼠胚胎干細胞團狀克隆中加入各個因子的含量優選 0? 1 ?5iiM 的 dorsomorphin、100 ?500ng/ml(4. 35 ?21. 75nM)的 noggin、5 ?30iiM 的 SB431542 和 1 ?5iiM 的 CHIR99021，更優選的組合為：2iiM 的 dorsomorphin、100ng/ ml (4. 35nM)的 noggin、20 ii M 的 SB431542 和 3 ii M 的 CHIR99021。
[0015] 本發明還提供了一種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞 的組合物，包括 dorsomorphin、noggin、SB431542 和 CHIR99021，優選 dorsomorphin、 noggin、SB431542 和 CHIR99021 的摩爾比為（100 ?5000) : (4. 35 ?21. 75) : (5000 ? 30000): (1000 ?5000)，（100ng/ml noggin (R&D Systems)，換成摩爾濃度是 4. 35nM)，更優 選摩爾比為 460:1:4598:690 (對應的濃度比為 2 ii M: 4. 35nM: 20 ii M: 3 ii M)。
[0016] 胚胎干細胞（embryonic stem cells, ES cells)是從囊胚期內細胞團（inner cell mass，ICM)分離得到的，在體外具有無限或較長期的自我更新能力，并能在特定的 誘導條件下分化成外中內三胚層，并進一步分化為各種組織特異性細胞。大量研究表 明，0CT4、S0X2和NAN0G這三個轉錄因子對ES細胞基因轉錄具有關鍵性的調控作用，它 們通過結合靶基因調控區，選擇性地抑制分化基因表達或促進多能性基因表達。它們通常 只在多能干細胞中表達，在分化細胞中不表達。在不同的發育階段，它們的表達量受到特 異調控，并且分別與S 〇x-2、F〇xD3等其他轉錄因子以及1正、81^、《拉、1§卜0等胞外信號 通路互相作用，形成一個復雜的轉錄調節crosstalk網絡，對保持ES細胞多潛能性和自 我更新發揮作用。目前，通過對LIF、BMP、wnt、Tgf-0等胞外信號通路的調控來誘導胚胎 干細胞分化的研究很多，有研究報導指出同時使用noggin, SB431542和dorsomorphin三種 小分子可以將小鼠外胚層胚胎干細胞（mouse embryonic epiblast stem cell)直接分化 為增殖2-3代的NE細胞（MJ Nejm，Nature Method, 2011)。由于外胚層胚胎干細胞與胚胎 干細胞的誘導分化存在差異，在本發明的研究中，實驗結果表明使用noggin，SB431542和 dorsomorphin并不能直接將鼠ES細胞分化為神經上皮細胞，實驗是失敗的（圖3)。
[0017] 本發明首次發現在ES形成神經球的階段通過同時加入dorsomorphin、noggin、 SB431542和CHIR99021，可快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞，實驗結 果表明，上述因子不僅抑制ES細胞的多條保持ES細胞的多能性信號通路，并且抑制ES細 胞向中胚層和內胚層的分化，從而高效率的將ES向外胚層進行定向分化從而生成神經上 皮細胞，使ES細胞向神經上皮細胞的分化效率幾乎達到100%。
[0018] SB431542(4_[4_(3, 4-Methylenedioxyphenyl)_5_(2-pyridyl)-lH-imidazol-2-yl]-Benzamidehydrate)是TGF-0 1I型受體阻斷劑，主要是通過抑制TGF-0 1激活素受體 樣激酶 activin receptor-like kinases (ALKs)中的 ALK4、ALK5、ALK7 來抑制 TGF-beta/ Activin信號通路。
[0019]
【權利要求】
1. 一種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞的方法，其特征在于包括 如下步驟： (1) 第一階段：向貼壁培養的鼠胚胎干細胞團狀克隆中加入含有dorsomorphin與 noggin、SB431542和CHIR99021的誘導培養基，連續培養若干天，細胞每天換液，誘導鼠胚 胎干細胞形成玫瑰花狀神經球； (2) 第二階段：消化并挑出第一階段的神經球，加入含有bFGF的第二階段誘導培養基 懸浮培養形成懸浮的神經球； (3) 第三階段：將神經球消化成單細胞，然后用第三階段誘導培養基貼壁培養形成具 有較長期的自我增殖與更新的神經上皮細胞。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述第一階段誘導培養基包含有DMEM/F12神 經基礎培養基、N2培養基、B27培養基、NEAA和P-Mercaptoethanol ;第二階段誘導培養基 包含有DMEM/F12神經基礎培養基、N2培養基、bFGF和葡萄糖；第三階段誘導培養基包含有 DMEM/F12神經基礎培養基、N2培養基、B27培養基、胰島素、葡萄糖、bFGF和EGF。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于第一階段向鼠胚胎干細胞團狀克隆中加入 0? 1 ?5 u M 的 dorsomorphin、100ng/ml ?500ng/ml (4. 35 ?21. 75nM)的 noggin、5 ?30 u M 的 SB431542 和 1 ?5 ii M 的 CHIR99021。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于第一階段向鼠胚胎干細胞團狀克隆中加 入 2uM 的 dorsomorphin、100ng/ml(4.35nM)的 noggin、20iiM 的 SB431542 和 3uM 的 CHIR99021。
5. -種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化為神經上皮細胞的組合物，包括 dorsomorphin、noggin、SB431542 和 CHIR"〇2l。 6?如權利要求5所述的組合物，其特征在于所述dorsomorphin、noggin、SB431542和 CHIR99021 的摩爾比為（100 ?5000) : (4. 35 ?21. 75) : (5000 ?30000) : (1000 ?5000)。
7. -種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化成神經元的方法，其特征在于采用如權利 要求1-4之一項所述方法制備得到神經上皮細胞，進行貼壁培養，加入向神經元分化的普 通誘導培養基或向中腦神經元分化的培養基，連續培養若干天，即得到普通神經元細胞或 者中腦神經元。
8. -種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化少突膠質前體細胞的方法，其特征在于采 用如權利要求1-4之一項所述方法制備得到神經上皮細胞，進行貼壁培養，加入0PC誘導培 養基，連續培養若干天，即得到少突膠質前體細胞，所述0PC誘導培養基包含有：DMEM/F12 神經基礎培養基,N2培養基，不含維生素 A的B27培養基、Glutamax、bFGF、roGF-AA和SHH。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于0PC誘導培養基包含有DMEM F12，1XN2， lXB27,20iig/ml 胰島素，1.6g/L 葡萄糖、20ng/ml bFGF 和 20ng/ml EGF。
10. -種快速直接定向誘導鼠胚胎干細胞分化少突膠質細胞或星形膠質細胞的方法， 其特征在于采用如權利要求7所述方法制備得到少突膠質前體細胞，進行貼壁培養，加入 少突膠質細胞誘導培養基或者星形膠質細胞誘導培養基，連續培養若干天，即得到少突膠 質細胞或星形膠質細胞。
【文檔編號】C12N5/079GK104450618SQ201410199624
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】卞菁, 鄭嬌 申請人:南通大學