專利名稱：金銀花菌深層發酵生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物工程技術領域，涉及一種金銀花菌(學名茶薦子葉狀層菌 Phylloporia ribis (Schumach. :Fr.) Ryvarden)的深層發酵生產工藝，屬傳統中藥和現代生物技術有機結合的產物。
背景技術：
金銀花菌(茶薦子葉狀層菌Phylloporia ribis (Schumach. Fr) Ryvarden)是山東著名道地藥材金銀花植株上的一種藥用真菌，在當地民間具有悠久的藥用歷史，2002年載入《山東省中藥材標準》。該菌子實體用于治療咽炎、喉炎、扁桃體炎等口腔炎癥，臨床療效顯著。藥理實驗研究證明，該菌具有抗炎、抗病毒、抗癌、促進肌體免疫等生物活性，是一種珍貴的、可以代替金銀花消炎作用的真菌藥物資源。為深入開發利用這一資源，我們對其進行了菌種分離純化，得到了該菌的純菌種，并通過液體深層發酵的生物技術，達到大規模人工生產金銀花菌的目的。目前，我國金銀花年產量僅800萬公斤，而國內外市場需求量為2000萬公斤以上， 每年供需缺口達1200萬公斤。本發明生產的金銀花菌絲，在一定程度上可以代替金銀花作為清熱解毒藥使用，以緩解金銀花菌供需矛盾緊張的局面。此外本發明生產的金銀花菌絲營養成分豐富，經檢測氨基酸含量達40%以上，也可以作為一種氨基酸營養補充劑。
發明內容
本發明所用金銀花菌的原菌種經鑒定，屬于真菌界、擔子菌門、無隔擔子菌綱、非褶菌目、銹革孔菌科真菌。子實體形狀不規則，呈扁平狀、拳形、半圓形或云片狀。菌蓋表面粗糙，硬而韌，覆瓦狀排列，赤醬色至淺栗色，無光澤，有同心環狀棱紋及細微絨毛， 1. 5-4X3-7cm，邊緣薄或稍鈍，深肉桂色。無菌柄，子實體背面黃褐色，肉眼可見布滿細小的管口，管口淺肝褐色至暗褐色，有時可見成簇的新生子實體。斷面可見菌肉呈纖維質，棕黃色，菌管長l_2mm。孢子呈淡黃色，球形或闊卵形，直徑3 μ m。我們選用PDA培養基，對該菌進行了菌種分離純化，得到了該菌的純菌種，并通過液體培養實驗，初步確定了菌絲體的發酵培養基配方為麥芽汁(IOBx) 10%，蛋白胨0.3%， 葡萄糖1 %，蔗糖1 %，玉米漿0. 5 %，PH5. 5-6. 0。采用以上培養基，27°C培養96小時搖瓶培養菌絲體收率達到最高，可以達到1.5%。確立了中試發酵生產工藝流程試管斜面菌種——500ml三角瓶液體種子(裝量200ml)——5L血清瓶種子(裝量3L)——1噸發酵罐 (裝量500L)——菌絲過濾一一氣流沸騰干燥——成品。中試發酵培養基和大生產培養基為麥芽汁(IOBx) 15%，蔗糖1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，玉米漿0.5%，PH5. 0-6.0，培養條件為裝量50 %，接種量6-10 % ’溫度27 士 1 °C，攪拌轉速160rpm，通氣量6立方米/小時，36 72小時菌絲體得率就達到最高，可以達到1. 6%。為了對發酵菌絲進行質量評價，我們通過高效液相法測定了金銀花菌發酵菌絲的脂溶性成分麥角留醇含量做了測定并與原子實體中麥角留醇含量做了對比，結果證明以Agilent 1100LC 高效液相色譜儀，hrbax eclipse XDB C8, (150mmX4. 6mm)色譜柱，甲醇為流動相，檢測波長為^2nm，流速1. Oml/min。標準曲線在0. 1 0. 5mg/ml線性良好，最低限量為0. lmg/ml, RSD = 2. 88%，金銀花菌發酵菌絲中的麥角甾醇含量是原子實體麥角甾醇含量的10倍。該菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存(北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所；郵編100080)；分類命名茶薦子葉狀層菌(新分類學名)環棱褐孔菌為曾用名Xanthochrous nilgheriensis (Phylloporia ribis (Schumach. :Fr)Ryvarden)
保藏編號CGMCCNo. 1195，保藏日期2004年7月22日。
附圖為金銀花菌發酵生產主要工藝流程。
具體實施例方式金銀花菌的液體深層發酵工藝流程1、在PDA培養基上的培養情況將分離到的純菌種調取少許，轉移到PDA培養基上，30°C培養3天，菌落圓形，邊緣整齊，平鋪，中間部分隆起，白色，絮狀，致密，背面黃色， 具放射狀溝紋，直徑2. 7-3. 2cm。顯微鏡下觀察菌絲無色，細長，具橫隔，縱橫交錯，多分枝， 直徑2-2. 5 μ m ；菌絲細胞的細胞壁薄而透明，菌絲生長初期可見鎖狀聯合，生長后期分枝較多時，鎖狀聯合不明顯。2、液體培養將馬鈴薯去除芽眼與外皮，切成Icm見方的小塊，稱取600克，加水 3000ml，用鋁鍋在電爐上加熱，待其沸騰后，保持30分鐘，然后用四層紗布過濾，濾液備用。 另外稱取葡萄糖60克、磷酸二氫鉀6克、硫酸鎂1. 5克、尿素1. 2克，加適量水溶解后，與上述馬鈴薯水煎液混合，最后定容至3000ml。取300ml三角瓶，洗凈烘干放冷后，每瓶加入上述培養液150ml，注意不要使液體粘附到瓶壁上，上蓋棉塞，最后用牛皮紙、橡皮筋封口。在接種菌種之前，將包裝好的三角瓶整體置于紫外燈下消毒40分鐘。3、菌絲的接種與培養取小三角瓶中固體培養生長情況較好的金銀花菌菌絲進行接種，注意剔除底部含有瓊脂的固體培養基，菌絲團的直徑大約為1 2mm，盡量使所取菌絲團的大小保持一致，每瓶取5個菌絲團。如前重新封品后，置于恒溫振蕩器上進行培養， 保持溫度27°C，振幅為2cm，振蕩速率為lOOrpm。4、菌絲體培養條件優化搖瓶培養的溫度和培養時間的確定，采用500ml三角瓶， 裝量200ml，搖瓶轉速150rpm，在30°C溫度條件下，發酵后測定菌絲體干重的收率。結果表明菌絲體的適宜培養溫度為27°C，在27°C條件下搖瓶培養的時間為96小時。5、發酵生產菌絲體的發酵培養基配方為麥芽汁(10BX)10%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1 %，蔗糖1 %，玉米漿0. 5%，PH5. 5-6. O。采用以上培養基，27°C培養96小時搖瓶培養菌絲體收率達到最高，可以達到1. 5%。確立了中試發酵生產和工藝流程試管斜面菌種—— 500ml三角瓶液體種子(裝量200ml)——5L血清瓶種子(每個裝量3L)——500L發酵罐 (裝量300L)——5噸發酵罐。培養基為麥芽汁(IOBx) 15 %，蔗糖1 %，葡萄糖1 %，蛋白胨0.3%，玉米漿0.5%，PH5. 0-6.0，培養條件為裝量60%，接種量10% ；溫度27°C，攪拌轉速160rpm，通氣量6立方米/小時，36小時菌絲體得率就達到最高，可以達到1. 6%。6、將發酵罐的發酵液與菌絲轉入板框壓濾機壓濾，壓濾后冷凍干燥，粉碎，裝袋， Co輻照滅雜菌，外包裝。參考文獻[1]. Lee IK, Lee JH, Yun BS.Polychlorinated compounds with PPAR-gamma agonistic effect from the medicinal fungus Phellinus ribis[J]. Bioorg Med Chem Lett.2008Aug 15 ；18(16) :4566[2]. Moon DC,Hwang KH,Choi KR,et al. Constituents of ceramide of a naive mushroom,Phellinus ribis in Korea[J]. Analytical Science and Technology,1994,7 547 554[3]. Moon DC. Some preoxysterols and ceramides from "Phellinus ribis", a Korean wild mushroom[J]. Analysis Science Technol. , 1995 ；8(4) :901-906[4],劉玉紅，徐凌川，王建平.茶薦子葉孔菌強酸性化學成分的研究《時珍國醫國藥》2006，17(9)[5],劉玉紅，徐凌川，王建平.褐孔菌屬藥用真菌化學成分與藥理作用研究纂要 《中醫藥學刊》2003，21 (12)[6],劉玉紅，徐凌川，王建平.茶薦子葉孔菌化學成分的研究《中藥材》2005， 28(11)
權利要求
1.一種用發酵法生產金銀花菌絲的工藝技術。其特征在于發酵培養基配方為麥芽汁 (IOBx) 10%，蛋白胨 0. 3%，葡萄糖 1%，蔗糖 1%，玉米漿 0.5%，PH5. 5-6. 0。27°C 培養 96 小時搖瓶培養菌絲體收率達到最高，可以達到1. 5%。生產工藝流程試管斜面菌種——三角瓶液體種子——血清瓶種子——種子罐——生產罐——菌絲過濾——氣流沸騰干燥(或冷凍干燥)——成品。
2.—種權利要求1所述的金銀花菌經鑒定為茶薦子葉狀層菌Wiylloporia ribis(Schumach. :Fr.)Ryvarden，其特征在于該菌是從金銀花植株分離純化得到的菌種，固體培養基上生長的菌絲顏色潔白而濃密，液體發酵所得菌絲干燥粉碎后為乳白色或灰白色粉末。
3.—種權利要求1所述的發酵菌絲粉作為氨基酸營養補充劑或作為消炎、抗病毒、抗腫瘤的單方或復配方及提取物，用以治療咽炎、咽喉炎、上呼吸道感染、多種腫瘤而制成的片劑、口含片、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射劑等各種劑型。
全文摘要
本發明名稱“金銀花菌深層發酵生產工藝”，屬微生物工程技術領域。本發明公開了一種金銀花菌的大規模人工發酵生產技術。其特征是用金銀花菌的純菌種，經過PDA培養基培養，轉為液體培養基培養，再經過種子罐培養放大，按照10％接種量轉入生產罐，經過36～72小時達到發酵生產最大量。該發酵菌絲含有40％以上的氨基酸，可以作為營養補充劑使用。另外，它具有類似金銀花的消炎作用，能治療咽炎及上呼吸道感染等癥，可以單用或與其他中藥復配使用。
文檔編號A61K36/06GK102191183SQ201010579919
公開日2011年9月21日 申請日期2010年12月9日 優先權日2010年12月9日
發明者廉士文, 張永清, 張良宏, 徐凌川, 殷法杰, 田景振, 秦國培 申請人:廉士文, 張良宏, 徐凌川