一種農藥降解菌制劑及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了甘蔗渣在制備農藥降解菌制劑中的應用，提供了一種農藥降解菌制劑及其制備方法和應用。該農藥降解菌制劑包含有以下組分：（1）對農藥有降解作用的菌株（如短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）HZ-2菌株，2013年9月6日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為湖北省武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCCNO：M2013380）；（2）微生物制劑載體：甘蔗渣。本發明農藥降解菌制劑使用甘蔗渣作為微生物制劑載體，以葡萄糖或糖蜜為輔料，極大地提高了工業廢料的利用率，成本低，且為制劑中的微生物提供了穩定碳源，保證制劑的持效性。該農藥降解菌制劑使用簡單，降解效果好，具有很好的推廣應用價值。
【專利說明】一種農藥降解菌制劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物菌劑及農藥降解【技術領域】。更具體地，涉及一種農藥降解菌制劑及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]農藥的過量使用對食品安全、農作物藥害及有害生物抗性發展等問題已經引起了全球廣泛關注，同時農藥的大量富集對地表水、地下水以及海洋環境造成了巨大威脅，最終將影響人類的生存環境和身體健康。在現代農業生產中，政府及農業科學家們都極力提倡采用病蟲害綜合防治(Integrated Pest Management, IPM),綜合農業耕作、物理、生防等措施，降低化學防治的比重和頻率，改變用破壞生態環境來換取經濟發展的陳舊模式，在可持續地防治病蟲草害的同時，穩步發展農業生產與經濟。可是，推陳出新的農藥品種和逐年增長的農藥產量卻揭示了一個不可回避的事實，化學藥劑在作物病蟲草治理中仍占據不可動搖的重要地位。
[0003]我國是農業大國，農藥的生產與使用量占世界總量的十分之一，施入農田的農藥大部分殘留于土壤環境介質中。農藥本身雖具有不同程度的自然降解特性，但長時間大量使用必然導致環境污染；此外，有些農藥由于自身特性的原因，降解周期長，且有一些種類其自身降解產物毒性更甚，因此，農藥在自然界中的殘留富集存在生態環境安全隱患，危害水體生態及非靶標生物等。如何降低或消除農藥在環境中的累積，從而杜絕生態安全問題的發生，已經成為許多國家和地區亟待解決的問題。 [0004]開發土壤農藥殘留治理新技術是消除農藥生態隱患的關鍵，應著眼于農藥污染源的控制及農藥殘留的修復。利用微生物修復污染土壤是解決農藥殘留富集的新方法、新途徑，自然界微生物資源極為豐富，微生物修復法因其具有二次污染少、操作簡單、成本低等優勢，擁有修復生態環境中農藥污染的強大潛力，值得深入研究開發。
[0005]微生物修復農藥污染土壤的技術難點在于微生物制劑的開發與研制。如何將活性微生物集中、固定在制劑中，保證微生物的活性，同時對環境友好，對人畜無害，是開發農藥降解菌制劑的突破口和關鍵之處。由于傳統農藥劑型中各種助劑對微生物有機體的優劣影響并不明確，因此傳統農藥劑型的配制并不完全適用于微生物劑型的開發。
[0006]甘蔗渣以及糖蜜等作為低碳環保、資源豐富的制糖工業廢料，已在發酵生產乙醇、木糖醇等工業中成熟運用，而其在農藥降解菌制劑中的應用未見報道。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是克服現有農藥降解菌制劑的技術不足，提供一種甘蔗渣在制備農藥降解菌制劑中的應用。
[0008]本發明的另一目的在于提供一種農藥降解菌制劑。
[0009]本發明的再一目的是提供所述農藥降解菌制劑的制備方法。
[0010]本發明還有一個目的是提供所述農藥降解菌制劑的應用。[0011 ] 本發明的目的通過以下技術方案予以實現:
本發明提供甘蔗渣在制備農藥降解菌制劑中的應用。本發明將甘蔗渣制成微生物制劑所需載體，不僅實現了能源再利用，也降低了生物制劑影響環境的風險。
[0012]本發明同時提供一種農藥降解菌制劑，包含以下組分:(1)對農藥有降解作用的菌株；(2)微生物制劑載體甘蔗渣。
[0013]組分(I)所述菌株可采用對農藥有降解作用的常規菌。優選地，本發明提供一種最為優選的技術方案，所述菌株為短小芽孢桿菌pumilusm HZ-2菌株，菌種保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址是，湖北省武漢市武漢大學，保藏日期是2013年9月6日，菌種保藏編號為CCTCC NO:M 2013380。
[0014]組分(2)所述的甘蔗渣為制糖工業廢料甘蔗渣或經其他途徑所得的甘蔗渣。
[0015]本發明所述農藥降解菌劑使用普通的甘蔗渣就能達到非常好的效果，優選地，甘蔗渣經物理粉碎至粒徑大小為20~200目，或經化學改性后，改性甘蔗渣具有更好的吸水性和緩釋性。
[0016]所述化學改性的方法為:
S1.將甘蔗渣浸泡在含20%氫氧化鈉溶液的燒杯中，于室溫下攪拌I h，留置過夜后過濾，用蒸餾水沖洗蔗渣至PH值為8、之間，記為堿化蔗渣(BSB)。
[0017]S2.將堿化蔗渣(BSB)置于三角瓶中，加入乙醇及環氧氯丙烷，與溫度器、冷凝器及磁性攪拌器一同放入60 °C油浴，24 h，所得蔗渣記為醚化蔗渣(ESB)。
[0018]S3.將四乙烯五胺緩慢倒入醚化蔗渣(ESB)，保持60 °C反應，24 h后，于60 °〇真空干燥器中干燥12 h，制得改性甘蔗渣(MSB)。
[0019]化學改性的過程圖示如`附圖9所示。
[0020]優選地，所述農藥降解菌制劑還包含有輔料，所述的輔料為工業廢料葡萄糖或糖蜜或其他來源的糖蜜；按照質量百分含量計，所述輔料添加至農藥降解菌制劑后的濃度為1%~95%。
[0021]本發明采用廢糖蜜或葡萄糖作為本發明農藥降解菌劑的輔料，為菌劑中的微生物提供了穩定的針對性的碳源，以保證制劑持效性。同時極大程度地提高了工業廢料的利用率。
[0022]本發明同時提供該農藥降解菌制劑的制備方法，包括以下步驟:
51.將農藥降解菌活化，接種于液體LB培養基中，震蕩培養至對數期；
52.將SI所得菌液離心后去掉上清液，加入無菌水，制成菌種液；
53.將S2所得菌種液接入上述甘蔗渣中，密封，震蕩掛膜，離心，常溫真空干燥至近干，分裝密封。
[0023]優選地，在將S2所得菌種液接入甘蔗渣中后加入輔料工業廢料葡萄糖或糖蜜。
[0024]SI所述降解菌活化采用常規菌株活化方法，活化后培養。
[0025]作為優選，本發明提供培養方法如下:按降解菌不同種的屬性可采用冷凍保存法保存，將農藥降解菌的菌種活化，接種針挑取菌株接種，接種于斜面培養基，28 °C生化培養箱中培養，菌種長滿斜面后，移至4 1:冰箱保存；菌種可采用液體石蠟保存法，將菌種在培養基中培養得到健壯的菌體或孢子，用滅菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端Icm為準，使菌種與空氣隔絕，將試管直立，4°C下保存。選擇菌種適宜培養基。按照如下配方配制LB培養基:氯化鈉:10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L ;按照如下配方配制PDA培養基:馬鈴薯:200 g/L ;葡萄糖:20 g/L。按照如下配方配制查彼氏培養基:硝酸鈉:2 g/L，氯化鉀:0.5 g/L，硫酸鎂:0.5 g/L，磷酸氫二鉀:1.0 g/L，硫酸鐵:0.01 g/L，蔗糖:30.0 g/L。在pH 7.0的液體培養基中，接入體積比1%的濕菌體，在氣浴恒溫振蕩器中培養1~7 do
[0026]S2所述無菌水的加入量為l(T20mL。
[0027]S3所述菌種液、甘蔗渣、輔料的用量按照以下比例確定:在每Ig甘蔗渣中，按照I X IO7^l X IO10 cfu/mL的接種量接入S2所得菌種液I mL~5mL ;按照質量百分含量計，加入1%~95%廢糖蜜或葡萄糖。
[0028]S3所述的震蕩掛膜方法如下:在氣浴恒溫振蕩器中震蕩培養24-48小時，使菌體掛膜于甘鹿洛。
[0029]本發明提供了所述農藥降解菌制劑在降解農藥中的應用。
[0030]優選地，當農藥降解菌制劑中菌株為短小芽孢桿菌(ifeci77i/5.pumilus)的HZ-2菌株時，所述的農藥為硝磺草酮。
[0031]本發明具有以下有益效果:
本發明為工業廢料甘蔗渣提供了一種全新的應用，將其應用于制備農藥降解菌制劑。本發明農藥降解菌制劑制備過程中使用了甘蔗渣作為微生物制劑載體，不僅實現了能源再利用，低碳環保、成本低廉、資源豐富、操作簡便，也降低了生物制劑影響環境的風險，無二次污染，為微生物制劑開發提供了新的載體材料。
[0032]本發明提供的農藥降解菌制劑可以使農藥田間殘留量降低75%以上，具有較高的降解效果，成功地解決了農產品種植過程中除草劑的使用與消除農藥環境富集的矛盾，對保證作物、土壤、水體、非靶標生物及生態環境安全具有重大意義。
[0033]本發明進一步提供了工業廢料葡萄糖或糖蜜的新應用，本發明所述農藥降解菌制劑添加了工業廢料葡萄糖或糖蜜作為農藥降解菌制劑的輔料，極大程度地提高了工業廢料的利用率，且為制劑中的微生物提供了穩定碳源，能夠保證制劑的持效性，該菌劑在施用21d后仍能具有很高的降解率，保持田間目標農藥殘留量處于低水平。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1為環境電鏡下掃描固菌前的甘蔗渣表面形態。
[0035]圖2為環境電鏡下掃描固菌前的甘蔗渣維管束形態。
[0036]圖3為環境電鏡下掃描固菌前的甘蔗渣維管束剖面形態。
[0037]圖4為環境電鏡下掃描固菌后的甘蔗渣維管束形態。
[0038]圖5為環境電鏡下掃描固菌后的甘鹿洛表面降解菌株的分布情況。
[0039]圖6為環境電鏡下掃描固菌后的甘蔗渣維管束內降解菌株的分布情況。
[0040]圖7為降解菌制劑在LB培養基中對硝磺草酮的降解作用。
[0041]圖8為降解菌制劑和菌液對硝磺草酮田間降解作用的比較。
[0042]圖9為改性甘蔗渣MSB的制作過程示意圖。
【具體實施方式】[0043]以下結合附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、設備為本【技術領域】常規試劑和設備。
[0044]實施例1制作過程改性甘蔗渣MSB
甘蔗渣經化學改性制備得到改性甘蔗渣MSB，經化學改性后的改性甘蔗渣具有更好的吸水性和緩釋性。
[0045]所述化學改性的方法為:
51.將10g甘蔗渣浸泡在含20%氫氧化鈉溶液的500 mL燒杯中，于室溫下攪拌I h，留置過夜后過濾，用蒸餾水沖洗蔗渣至pH值為8-9之間，備用，記為堿化蔗渣(BasifiedSugarcane Bagasse, BSB)。
[0046]S2.將10.0 g BSB置于500 mL三角瓶中，加入200 mL乙醇及40 mL環氧氯丙烷(Chloroepoxy propane),與溫度器,冷凝器及磁性攪拌器一同放入60 °C油浴,24 h,所得鹿禮:記為醚化鹿禮:(Etherified Sugarcane Bagasse, ESB)。
[0047]S3.將40 mL四乙烯五胺(ΤΕΡΑ)緩慢倒入ESB，保持其于60 °C反應。24 h后，于60 °C真空干燥器中干燥12 h,制得改性甘鹿洛(Modified Sugarcane Bagasse, MSB)。
[0048]改性甘蔗渣MSB的制作過程圖示如附圖9所示。
[0049]實施例2農藥降解菌制劑的制備
1、材料
(I)所用甘蔗渣為制糖工業廢料蔗渣，經機械粉碎至粒徑大小為60目。
[0050](2)所用菌株為短小芽孢桿菌(MaciIIus pumilus、飽HZ-2菌株,菌種保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址是，湖北省武漢市武漢大學，保藏日期是2013年9月6日，保藏編號為CCTCC NO:M 2013380。
[0051]2、制備步驟如下:
將菌株HZ-2的菌種在培養皿上活化，接種于試管斜面；活化方法為常規菌株活化方法。
[0052]S1.將上述斜面上的單菌落接種于LB液體培養基搖瓶中，震蕩培養至對數期得菌液；LB液體培養基為常規的培養基；
52.將SI所得菌液以4800r/min離心lOmin，去上清液，加入l(T20mL無菌水，初步制成液體劑型菌種液；
53.在每Ig甘蔗渣中，按照IX 109cfu/mL的接種量接入S2所得菌種液2mL，按照質量百分含量計，加入5%廢糖蜜，密封，在氣浴恒溫振蕩器中震蕩掛膜24h后，離心，常溫真空干燥至近干，分裝密封。
[0053]實施例3農藥降解菌制劑的制備
1、材料
(I)所用甘蔗渣為實施例1制備的改性甘蔗渣MSB。
[0054](2)所用菌株為蠟狀芽孢桿菌cerem)，華南農業大學昆蟲毒理研究室保存。
[0055]2、制備步驟如下:
將菌株蠟狀芽孢桿菌cerem)的菌種在培養皿上活化，接種于試管斜面；活化方法為常規菌株活化方法。[0056]S1.將上述斜面上的單菌落接種于LB液體培養基搖瓶中，常溫下震蕩培養至對數期得菌液；LB液體培養基為常規的培養基；
S2.將SI所得菌液以4800r/min離心lOmin，去上清液，加入l(T20mL無菌水，初步制成液體劑型菌種液；
S3.在每Ig甘蔗渣中，按照IX IO7 cfu/mL的接種量接入S2所得菌種液2 mL,按照質量百分含量計，加入85%廢葡萄糖，密封，在氣浴恒溫振蕩器中震蕩掛膜26h后，離心，常溫真空干燥至近干，分裝密封。
[0057]實施例4甘蔗渣對降解菌HZ-2的固定能力
將本發明實施例2~3隨機選取一種所得降解菌制劑置于掃描電鏡,進行環境電鏡掃描觀察，得到其固菌形態，結果見附圖1~附圖6。
[0058]附圖1、附圖2和附圖3為固菌前的甘蔗渣形態；附圖4、附圖5和附圖6為固菌后的蔗渣和菌體形態。
[0059]結果顯示，固菌前甘蔗渣呈圓柱狀、表面不光滑(如附圖1所示)，導管清晰，伴有破損及碎片(如附圖2、附圖3所示)，應為物理粉碎時對蔗渣組織造成機械損傷。
[0060]固菌后甘蔗渣表面形態及導管無明顯變化(如附圖4所示)，菌體大量附著在蔗渣表面(如附圖5所示)及導管內(如附圖6所示)，分布廣泛，清晰可見，說明降解菌能夠在載體甘蔗渣中迅速富集固定。
[0061]實施例5本發明降解菌制劑對硝磺草酮的降解效果 本實施例中硝磺草酮為市購。
[0062]將實施例2制備的降解菌制劑按體積分數1%分別接種至初始濃度25、50、100、200mg/L的硝磺草酮LB液體培養基中，分別在培養2d、3d和4d后，高效液相色譜法檢測農藥殘留情況，結果如附圖7所示。
[0063]結果顯示，培養3d后，各濃度硝磺草酮降解率均為80%~95%。
[0064]培養4d后，殘留量分別為1.17mg/L、l.01mg/L、2.29mg/L和2.84mg/L,降解率分別為 95.31%、97.99%、97.71% 和 98.58%。
[0065]實驗結果說明，本發明降解菌制劑對起始濃度為25~200 mg/L的硝磺草酮均有突出的降解能力，能在短時間內迅速降低硝磺草酮殘留量。
[0066]實施例6本發明降解菌制劑田間降解硝磺草酮試驗 本實施例中硝磺草酮為市購。
[0067]選取未施用除草劑的玉米田，劃分小區，每小區面積不小于20 m2，3個重復。將40%的硝磺草酮懸浮劑，配制為100 mg/L水溶液，按照50 L/667 m2的用量，均勻噴施于田間。
[0068]2 h后，分別施用實施例2制備的降解菌制劑和單純菌液，并設立空白對照CK，按照五點取樣法選取五個時間點進行取樣分析，計算降解率，評價降解菌制劑對硝磺草酮的田間降解效果。結果如附圖8所示。
[0069]結果顯示，處理21d后，降解菌制劑的降解率達到75.13%，并且降解率顯著高于單純菌液處理的降解率，表明本發明方法制得的降解菌制劑，加入甘蔗渣作為有效的生物載體，能夠顯著的提高降解菌的降解作用，具有很高的降解效果。
【權利要求】
1.甘蔗渣在制備農藥降解菌制劑中的應用。
2.一種農藥降解菌制劑，其特征在于，包含以下組分:(1)可用于降解農藥的菌株；(2)微生物制劑載體； 所述微生物制劑載體為權利要求1所述甘蔗渣。
3.根據權利要求2所述農藥降解菌制劑，其特征在于，所述的菌株為短小芽孢桿菌{Bacillus pumilus)的HZ-2菌株,菌種保藏單位為中國典型培養物保藏中心,保藏單位地址是，湖北省武漢市武漢大學，保藏日期是2013年9月6日，菌種保藏編號為CCTCC NO:M2013380。
4.根據權利要求1或2所述農藥降解菌制劑，其特征在于，所述的甘蔗渣為制糖工業廢料甘蔗渣。
5.根據權利要求4所述農藥降解菌制劑，其特征在于，所述的甘蔗渣經物理粉碎至粒徑大小為20~200目，或經化學改性； 所述化學改性的方法為: 51.將甘蔗渣浸泡在含20%氫氧化鈉溶液的燒杯中，于室溫下攪拌Ih，留置過夜后過濾，用蒸餾水沖洗蔗渣至PH值為8、之間，記為堿化蔗渣； 52.將堿化蔗渣置于三角瓶中，加入乙醇及環氧氯丙烷，與溫度器、冷凝器及磁性攪拌器一同放入60 °C油浴，24 h，所得蔗渣記為醚化蔗渣； 53.將四乙烯五胺緩慢倒入醚化蔗渣，保持60°C反應，24 h后，于60 °C真空干燥器中干燥12 h，制得改性甘蔗渣。
6.根據權利要求2所述農藥降解菌制劑，其特征在于，還包含有輔料，所述的輔料為工業廢料葡萄糖或糖蜜；` 按照質量百分含量計，所述的輔料濃度為19^95%。
7.—種權利要求2所述農藥降解菌制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.將農藥降解菌活化、接種于液體LB培養基中，震蕩培養至對數期； 52.將SI所得菌液離心后去掉上清液，加入無菌水，制成菌種液； 53.將S2所得菌種液接入甘蔗渣中，密封，震蕩掛膜，離心，常溫真空干燥至近干，分裝密封。
8.根據權利要求7所述農藥降解菌制劑的制備方法，其特征在于，將步驟S2所得菌種液接入甘蔗渣中后加入輔料工業廢料葡萄糖或糖蜜。
9.權利要求2所述農藥降解菌制劑在降解農藥中的應用。
【文檔編號】A62D3/02GK103667240SQ201310620600
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】鐘國華, 劉婕, 蔣剛彪, 翁群芳, 肖盈 申請人:華南農業大學