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氧化酶、編碼該酶的多核苷酸、以及它們的應用的制作方法

文檔序號:11109466閱讀:來源:國知局

技術特征:

1. 編碼下述(A1)至(A5)中的任一氨基酸序列的多核苷酸:

(A1)序列編號3所示的氨基酸序列、

(A2)i)與序列編號3所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A3)i)在序列編號3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A4)i)由與由序列編號4或13所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

(A5)i)在序列編號3所示的氨基酸序列中,具有選自第109號的纈氨酸置換為異亮氨酸、第191號的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246號的谷氨酰胺置換為精氨酸中的1個以上氨基酸置換的改變的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列。

2.權利要求1記載的多核苷酸,其具有包含使得編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列的密碼子使用頻率與大腸桿菌的密碼子使用頻率相符的選擇的密碼子的改變的核苷酸序列。

3.在宿主細胞內可發揮功能的啟動子與權利要求1或2記載的多核苷酸以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸。

4.含有權利要求1至3中任一項記載的多核苷酸的重組載體。

5.將權利要求1至3中任一項記載的多核苷酸或權利要求4記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體。

6.權利要求5記載的轉化體,其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌。

7.保有權利要求1至3中任一項記載的多核苷酸的轉化體。

8.重組載體的制備方法,其包含在可在宿主細胞內復制的載體中摻入權利要求1至3中任一項記載的多核苷酸的步驟。

9.轉化體的制備方法,其包含將權利要求1至3中任一項記載的多核苷酸或權利要求4記載的重組載體導入宿主細胞的步驟。

10. 編碼下述(B1)至(B4)中的任一氨基酸序列的多核苷酸:

(B1)序列編號1所示的氨基酸序列、

(B2)i)與序列編號1所示的氨基酸序列具有95%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(B3)i)在序列編號1所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

(B4)i)由與由序列編號2所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列。

11.在宿主細胞內可發揮功能的啟動子與權利要求10記載的多核苷酸以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸。

12.含有權利要求10或11記載的多核苷酸的重組載體。

13.將權利要求10或11記載的多核苷酸或權利要求12記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體。

14.權利要求13記載的轉化體,其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌。

15.保有權利要求10或11記載的多核苷酸的轉化體。

16.重組載體的制備方法,其包含在可在宿主細胞內復制的載體中摻入權利要求10或11記載的多核苷酸的步驟。

17.轉化體的制備方法,其包含將權利要求10或11記載的多核苷酸或權利要求12記載的重組載體導入宿主細胞的步驟。

18.含有權利要求1至3中任一項記載的多核苷酸和權利要求10或11記載的多核苷酸的重組載體。

19.權利要求18記載的重組載體,進一步包含編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列的多核苷酸、或該多核苷酸與在宿主細胞內可發揮功能的啟動子以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸。

20.權利要求19記載的重組載體,其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質是亮氨酸脫氫酶。

21. 權利要求19或20記載的重組載體,其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列是下述(C1)至(C3)中的任一氨基酸序列:

(C1)序列編號7所示的氨基酸序列、

(C2)i)與序列編號7所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

(C3)i)在序列編號7所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列。

22.將權利要求18至21中任一項記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體。

23.權利要求22記載的轉化體,其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌。

24.轉化體,其保有:

i)具有編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸,或該多核苷酸與在宿主細胞內可發揮功能的啟動子以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸;

ii)權利要求1至3中任一項記載的多核苷酸;和

iii)權利要求10或11記載的多核苷酸。

25. 具有下述(A1)至(A5)中的任一氨基酸序列的蛋白質:

(A1)序列編號3所示的氨基酸序列、

(A2)i)與序列編號3所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A3)i)在序列編號3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A4)i)由與由序列編號4或13所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

(A5)i)在序列編號3所示的氨基酸序列中,具有選自第109號的纈氨酸置換為異亮氨酸、第191號的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246號的谷氨酰胺置換為精氨酸中的1個以上氨基酸置換的改變的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列。

26. 具有下述(B1)至(B4)中的任一氨基酸序列的蛋白質:

(B1)序列編號1所示的氨基酸序列、

(B2)i)與序列編號1所示的氨基酸序列具有95%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(B3)i)在序列編號1所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

(B4)i)由與由序列編號2所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列。

27. L-α-氨基酸化合物的制備方法,其包含:

(1)使α-羥基羧酸化合物與具有下述(A1)至(A5)中任一氨基酸序列的蛋白質和具有下述(B1)至(B4)中的任一氨基酸序列的蛋白質中的任一或兩者作用,得到對應的α-氧代羧酸化合物的步驟:

(A1)序列編號3所示的氨基酸序列、

(A2)i)與序列編號3所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A3)i)在序列編號3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A4)i)由與由序列編號4或13所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

(A5)i)在序列編號3所示的氨基酸序列中,具有選自第109號的纈氨酸置換為異亮氨酸、第191號的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246號的谷氨酰胺置換為精氨酸中的1個以上氨基酸置換的改變的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列;

(B1)序列編號1所示的氨基酸序列、

(B2)i)與序列編號1所示的氨基酸序列具有95%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(B3)i)在序列編號1所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

(B4)i)由與由序列編號2所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列,并且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列;

(2)使步驟(1)中得到的α-氧代羧酸化合物與具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質作用,得到對應的L-α-氨基酸化合物的步驟。

28.權利要求27記載的制備方法,其中α-羥基羧酸化合物是含硫α-羥基羧酸化合物,對應的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物,對應的L-α-氨基酸化合物是含硫L-α-氨基酸化合物,步驟(1)中與α-羥基羧酸化合物作用的蛋白質是至少具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力的蛋白質。

29.權利要求28記載的制備方法,其中:

含硫α-羥基羧酸化合物是式(1)所示化合物:

https://patentscope.wipo.int/search/docservice_image_ft/WO@@@id00000032009499@@@11124596@@@213@@@63@@@jpoxmldoc01-appb-i000004.gif

上式中,R1表示氫或可任選取代的碳原子數1-8的烷基;

含硫α-氧代羧酸化合物是式(2)所示化合物:

https://patentscope.wipo.int/search/docservice_image_ft/WO@@@id00000032009499@@@11124596@@@212@@@57@@@jpoxmldoc01-appb-i000005.gif

上式中,R1表示與上述相同的含義;

含硫L-α-氨基酸化合物是式(3)所示化合物:

https://patentscope.wipo.int/search/docservice_image_ft/WO@@@id00000032009499@@@11124596@@@210@@@63@@@jpoxmldoc01-appb-i000006.gif

上式中,R1表示與上述相同的含義。

30.權利要求27記載的制備方法,其中α-羥基羧酸化合物是α-羥基-異己酸,對應的α-氧代羧酸化合物是α-氧代-異己酸,對應的L-α-氨基酸化合物是L-亮氨酸,步驟(1)中與α-羥基羧酸化合物作用的蛋白質是至少具有將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力的蛋白質。

31.權利要求27至30中任一項記載的制備方法,其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質是亮氨酸脫氫酶。

32. 權利要求27至31中任一項記載的制備方法,其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列是下述(C1)至(C3)中的任一氨基酸序列:

(C1)序列編號7所示的氨基酸序列、

(C2)i)與序列編號7所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列,并且ii)具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

(C3)i)在序列編號7所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列,并且ii)具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列。

33.權利要求27至32中任一項記載的制備方法,其中以下列形式向反應體系提供步驟(1)中與α-羥基羧酸化合物作用的蛋白質,其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中。

34.權利要求33記載的制備方法,其中所述轉化體是權利要求5、6、7、13、14、15、22、23或24中任一項記載的轉化體。

35.權利要求27至34中任一項記載的制備方法,其中以下列形式向反應體系提供具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質,其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中。

36.權利要求35記載的制備方法,其中所述轉化體是權利要求22、23或24中的任一項記載的轉化體。

37.權利要求27至36中任一項記載的制備方法,其中步驟(1)在具有將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成氧化型的能力的蛋白質的存在下進行。

38.權利要求37記載的制備方法,其中具有將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成氧化型的能力的蛋白質是進一步具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質。

39.權利要求37或38記載的制備方法,其中以下列形式向反應體系提供具有將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成氧化型的能力的蛋白質,其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中。

40.權利要求27至39中任一項記載的制備方法,其中步驟(2)在具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成還原型的能力的蛋白質的存在下進行。

41.權利要求40記載的制備方法,其中具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成還原型的能力的蛋白質是進一步具有將α-羥基羧酸化合物氧化轉變成對應的α-氧代羧酸化合物的能力的蛋白質。

42.權利要求40或41記載的制備方法,其中以下列形式向反應體系提供具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成還原型的能力的蛋白質,其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中。

43.權利要求27至42中任一項記載的制備方法,其中步驟(1)和步驟(2)在一個反應體系中進行。

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