一種新型小分子肽和其在阿爾茲海默癥檢測中的應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種新型可與人ad7c-ntp特異性結合的小分子肽及其應用。

背景技術：

阿爾茲海默癥是一種中樞神經退行性疾病，多發于老年人，主要癥狀為漸進性記憶丟失、認知功能障礙、智力水平的慢性缺失。據統計數據表明，65歲以上老人中發病率約為6％-12％，80歲以上的老人發病率為20％-40％，每年新增的癡呆人數達到近770萬人，且每二十年老年癡呆患者數量增長一倍。到2020年，患者數目將高達6000萬人；預計到2050年，將有約1.2億人受到老年癡呆的影響。2013年，我國65歲以上的老年人人口數量達到1.4億，我國目前至少有600萬老年癡呆癥患者，加之中國人口基數大、老齡化程度高，因此對于中國來說，該疾病也是一個強大的負擔。2010年全球癡呆成本約6040億美元，相當于全球總gdp的1％，其增長幅度可能會比患病率還要高，因而給家庭、社會帶來了巨大的經濟、人力負擔。因此，阿爾茲海默癥的及時診斷與治療越來越受到廣泛的關注與重視，早期診斷也成為了一個熱點的話題。

到目前為止，阿爾茲海默癥的診斷存在著如下的問題：1.基于美國精神醫學學會出版的《精神疾病診斷與統計手冊》為基礎的結合量表診斷，在可信度、有效度、方便性等方面受到很大的局限；同時，量表存在一定的主觀性，對于病人的心理因素、文化差異、地域差異、年齡等相關因素影響較大，所以可能造成針對不同醫護人員與患者造成診斷結果不一的情況。2.基于病理學的檢查需要獲取腦組織，這一有創性檢查實施難度較大，且難以讓患者與其家屬接受，可行性較差。3.對于影像學檢查來說，腦核磁共振(mri)是老年癡呆臨床鑒別診斷最主要的工具，可以很好的顯示出腦的形態的改變，是ad檢測很好的指標，但是該種方法需要持續觀測，因此需要定期檢查，這對于一些家庭可能會造成較大的經濟負擔，因此普及性不強。pet檢查可以診斷與ad相關的代謝異常，但是價格昂貴，不適用于常規的檢查。功能核磁共振(fmri)可以在ad早期提供更多的信息，但受其它功能影響較大，因此在臨床上其診斷價值還需要進一步提高。

對于早期診斷來說，又具有如下局限：1.標志物存在于腦脊液中，獲取困難，取材受到嚴重的影響，因此臨床上難以運用。2.目前檢測采用的磷酸化的tau蛋白無特異性，在其它神經系統疾病中也有變化，難以診斷。3.其它如igfbp6、cxcl8、icam-1等的標志物發現以及酶的測定對診斷沒有指導意義，僅限于描述性研究，并無實用價值。

ntp又稱為神經絲纖維蛋白，是人體大腦中一類磷蛋白，可以與神經絲蛋白(ptp)發生交叉反應，該類蛋白與神經細胞的發生與分化和神經變性以及突出丟失有關。suzannedelamonte等首次在ad患者的腦脊液中發現ad7c-ntp蛋白，該蛋白大小為41kd，含有375個氨基酸。隨著研究發現，腦脊液與尿液中該蛋白的表達水平與ad的嚴重程度呈顯著性相關關系，因此ad7c-ntp作為ad的一個生化指標，是一個敏感性和特異性極強的蛋白，對ad的檢測有著極其重要的作用，這種無創性檢測對于老年人常規體檢有著非常廣闊的前景。

目前，基于ad7c-ntp檢測的方法均以ad7c-ntp的抗原決定簇肽段交聯血蘭蛋白作為抗原制備抗體，從而進一步檢測使用。該方法具有如下的缺陷：1.多克隆抗體特異性低、易發生交叉反應。2.制備過程復雜、方法批間重復性差。3.價格較高、無普適性。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種特異性結合ad7c-ntp的小肽及其應用。

本發明提供了一種小肽，其序列為seqidno.1和seqidno.2中的任一項所示。

本發明的小分子親和肽，所述小分子親和肽與人ad7c-ntp特異性結合。進一步的，本發明的小肽可用于檢測ad7c-ntp。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和有益效果：

1)高效：該小肽可以與ad7c-ntp特異性結合。

2)安全：該小分子親和肽分子量小(小于6肽)，其殘基序列取自20種必需氨基酸。

3)經濟：該小肽由固相合成而得，成本較低且便于質量管控。

附圖說明

圖1為檢測dewh與ad7c-ntp結合能力以及結合率。

圖2為檢測wrdw與ad7c-ntp結合能力以及結合率。

具體實施方式

實施例1：小分子肽合成

1)活化樹脂：吸取0.75mlaf-amino-650m樹脂，加入10-15mldmf浸泡，使其充分溶脹。

2)縮合反應：連接下一個氨基酸，稱取fmoc-氨基酸的用量是1.4mmol/g樹脂，910mgtbtu，加入10mldmf和0.45ghobt混和均勻后，加入0.52mldiea配成反應液，室溫下氮氣吹沸反應2h。反應完畢后，用異丙醇洗滌樹脂三次，然后用dmf洗滌樹脂三次。檢測氨基。

3)脫保護：浸泡樹脂的dmf壓濾除去，加入10ml含有20％哌啶的dmf溶液，氮氣吹沸反應15min，然后壓濾除去，脫除氨基的fmoc基團，用10ml異丙醇洗滌樹脂三次，再用10mldmf洗滌三次，而后用茚三酮法檢測樹脂應成黑色或紫色。

4)重復步驟2)-3)過程：按多肽的順序自c端向n端延伸多肽。重復脫保護.洗滌.縮合的過程至剩余的氨基酸連接完畢，完成多肽的連接。

5)除去其它保護：用氮氣將多肽-樹脂復合物吹干，按tfa/h2o/tis(95/2.5/2.5)的比例配成混和切割試劑，氮氣保護下吹沸40min，而后再將其用氮氣吹干，置于無水乙醇中，4℃保存。

根據上文方法共合成seqidno：1-2的2種小分子肽。

實施例2：親和吸附驗證

1)裝柱：將連接肽段的樹脂作為填料，做成柱子，在上安裝。

2)上樣：150mmpbs溶解蛋白，流速設為0.3ml/min，基線跑平后，上0.5mg蛋白質。

3)堿洗脫：10min時，注入0.5mlph9.0、150mm硼酸洗脫。

4)酸洗脫：20min時，注入0.5mlph2.0100mm鹽酸洗脫。

6)計算洗脫比以及洗脫率。

結果見圖，圖1為dewh結果圖，圖2為wrdw結果圖，由實驗數據，wrdw吸附率在90％以上，dewh吸附率在85％以上，二者均為特異性吸附。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特征以及方法，但本發明并不局限于上述詳細特征以及方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特征以及方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用材料和步驟的等效替換以及輔助材料和步驟的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。