本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基及其制備方法。
背景技術：
由于各種原因導致的牙體缺損和牙齒缺失，已成為危害口腔乃至人體健康的主要疾病，其發病率逐年增加。目前，主要是借助于各種牙科材料充填來應對牙齒缺損疾病，雖然在一定程度上能阻止病變的繼續發展，但卻不能解決根本問題。對于牙齒缺失盡管解決途徑很多，但最有效和最根本的辦法還是牙齒生物性再生。
隨著組織再生醫學的快速發展，為牙體缺損和牙齒缺失的有效治療帶來了希望。目前，已有許多研究利用牙源性上皮和牙源性間充質的相互作用，再生出了牙齒組織。常用的牙源性間充質包括牙乳頭細胞和牙髓組織細胞。由于牙乳頭細胞在臨床上難以獲得，因此，目前用于牙體及牙齒再生的種子細胞首選是牙髓組織來源的細胞，其中最重要的是牙髓干細胞。
中國專利申請CN106011053A公開了一種新型牙髓干細胞培養基，每1L牙髓干細胞培養基中由以下成分組成：100-150mL的胎牛血清、10-15mL的青鏈霉素雙抗、1-5ngTGF-R，1-5mM L-谷氨酰胺，1640培養基余量。
中國專利申請CN104711219A公開了一種牙髓干細胞培養基，基礎培養基為IMDM，1L培養基中含有SITE100*，抗壞血酸200-400mM，SITE為細胞生長必需的組份，抗壞血酸和纖連蛋白有助于牙髓干細胞形成細胞外基質，利于牙髓干細胞生長，含有PDGF1-10ug，氫化可的松1-10μg，EGF1-5ng，b-FGF1-5ng，PTH50-200ng，地塞米松1-20mM。
臨床使用牙髓干細胞的前提是對牙髓干細胞進行大量的擴增，現有的擴增方法最常規的是使用添加10％胎牛血清的培養基，臨床使用含動物源的培養基不僅會引起免疫排斥反應，異源病毒感染，而且采用這種培養基培養的牙髓干細胞，生長比較緩慢，在傳代超過5次之后其分化功能細胞的潛能會大大降低。雖然已經研發出不含血清的牙髓干細胞培養基，但是價格昂貴。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基及其制備方法。本發明提供的適用于牙髓干細胞體外培養的培養基成分明確且價格較低，不含有胎牛血清，不含任何動物來源成份，安全性高，能夠顯著提高牙髓細胞的擴增速度，且不影響牙髓干細胞的多向分化能力。
本發明的技術方案是：
一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶3-5mg/L，輔酶Q10 0.2-0.4μM，亞麻酸7-9μM，血小板衍生生長因子1-3μg/L，葫蘆素B0.2-0.6mg/L，硫辛酸0.12-0.15mg/L，葉酸12-15μM，羧甲基殼聚糖0.5-1g/L，表皮生長因子8-10μg/L，牛磺酸7-10mg/L和貼壁材料22-30μg/L。
進一步地，所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶4mg/L，輔酶Q10 0.3μM，亞麻酸8μM，血小板衍生生長因子2μg/L，葫蘆素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，葉酸13μM，羧甲基殼聚糖0.8g/L，表皮生長因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和貼壁材料27μg/L。
進一步地，所述基礎培養基為MEM或M199培養基。
進一步地，所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比5-7∶9-12組成。
進一步地，所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比6∶11組成。
另外，本發明還提供了所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基的制備方法，包括以下步驟：
S1向基礎培養基中加入亞麻酸、血小板衍生生長因子、硫辛酸、葉酸、表皮生長因子、牛磺酸和貼壁材料，攪拌15-22分鐘，加入葫蘆素B和羧甲基殼聚糖，繼續攪拌28-36分鐘，靜置2-4小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌25分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至6.9-7.2，用0.2-0.25微米濾膜過濾除菌，即得。
優選地，所述步驟S1攪拌18分鐘。
優選地，所述步驟S1繼續攪拌32分鐘。
優選地，所述步驟S1靜置3小時。
優選地，所述步驟S2調節步驟S1所得混合物的pH至7.0。
優選地，所述步驟S2用0.24微米濾膜過濾除菌。
本發明適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，添加的添加劑包括過氧化氫酶、輔酶Q10、亞麻酸、血小板衍生生長因和葫蘆素B等。在本發明的各種培養基的成分中，基礎培養基能夠提供牙髓干細胞的生存和最低的生理活動。在本發明中，過氧化氫酶能夠清除自由基，保護牙髓干細胞免受超氧自由基損害等。在本發明中，輔酶Q10主要用作抗氧化劑和細胞代謝激活劑。在本發明中，亞麻酸能夠提供細胞膜合成所需的脂質，并且與本發明中的其他原料協同作用，能夠促進細胞增殖，提高細胞產率。在本發明中，血小板衍生生長因子和表皮生長因子主要作為維持牙髓細胞體外培養生存、增殖和分化所需的補充因子。在本發明中，硫辛酸與本發明所用其他原料協同作用，明顯促進牙髓干細胞的增殖，另外，硫辛酸還起到抗氧化的作用。在本發明中，葉酸參與嘌呤和胸腺嘧啶的合成，進一步合成DNA和RNA，并且還起到抗氧化的作用。在本發明中，牛磺酸能夠促進牙髓干細胞的增殖，與本發明所用其他原料協同作用，能夠顯著提高牙髓干細胞的擴增效果。在本發明中，貼壁材料能夠促進牙髓干細胞的粘附，及其貼壁生長。
研究發現，在培養基中加入羧甲基殼聚糖，羧甲基殼聚糖能夠與其他成分間協同作用，提高牙髓干細胞的擴增速度，另外，在本發明培養基中羧甲基殼聚糖還作為穩定劑。在培養基中加入葫蘆素B，能夠進一步促進牙髓干細胞的生長增殖。本發明適用于牙髓干細胞體外培養的培養基中各成分協同作用，能夠顯著提高牙髓細胞的擴增速度，且不影響牙髓干細胞的多向分化能力。
與現有技術相比，本發明提供的適用于牙髓干細胞體外培養的培養基具有以下優勢：
(1)本發明提供的適用于牙髓干細胞體外培養的培養基安全性高，不含有胎牛血清，不含任何動物來源成份。
(2)本發明提供的適用于牙髓干細胞體外培養的培養基成分明確且價格較低。
(3)本發明提供的適用于牙髓干細胞體外培養的培養基能夠顯著提高牙髓細胞的擴增速度，且不影響牙髓干細胞的多向分化能力。
具體實施方式
以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。
本發明所用羧甲基殼聚糖可購自浙江澳興生物科技有限公司，MEM培養基可購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，M199培養基可購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司。
實施例1、一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基
所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶3mg/L，輔酶Q10 0.2μM，亞麻酸7μM，血小板衍生生長因子1μg/L，葫蘆素B0.2mg/L，硫辛酸0.12mg/L，葉酸12μM，羧甲基殼聚糖0.5g/L，表皮生長因子8μg/L，牛磺酸7mg/L和貼壁材料22μg/L。
所述基礎培養基為MEM培養基。
所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比5∶12組成。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入亞麻酸、血小板衍生生長因子、硫辛酸、葉酸、表皮生長因子、牛磺酸和貼壁材料，攪拌15分鐘，加入葫蘆素B和羧甲基殼聚糖，繼續攪拌28分鐘，靜置2小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌25分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至6.9，用0.2微米濾膜過濾除菌，即得。
實施例2、一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基
所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶5mg/L，輔酶Q10 0.4μM，亞麻酸9μM，血小板衍生生長因子3μg/L，葫蘆素B0.6mg/L，硫辛酸0.15mg/L，葉酸15μM，羧甲基殼聚糖1g/L，表皮生長因子10μg/L，牛磺酸10mg/L和貼壁材料30μg/L。
所述基礎培養基為M199培養基。
所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比7∶9組成。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入亞麻酸、血小板衍生生長因子、硫辛酸、葉酸、表皮生長因子、牛磺酸和貼壁材料，攪拌22分鐘，加入葫蘆素B和羧甲基殼聚糖，繼續攪拌36分鐘，靜置4小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌25分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至7.2，用0.25微米濾膜過濾除菌，即得。
實施例3、一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基
所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶4mg/L，輔酶Q10 0.3μM，亞麻酸8μM，血小板衍生生長因子2μg/L，葫蘆素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，葉酸13μM，羧甲基殼聚糖0.8g/L，表皮生長因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和貼壁材料27μg/L。
所述基礎培養基為M199培養基。
所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比6∶11組成。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入亞麻酸、血小板衍生生長因子、硫辛酸、葉酸、表皮生長因子、牛磺酸和貼壁材料，攪拌18分鐘，加入葫蘆素B和羧甲基殼聚糖，繼續攪拌32分鐘，靜置3小時，加入過氧化氫酶和輔酶Q10，攪拌25分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至7.0，用0.24微米濾膜過濾除菌，即得。
對比例1、一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基
所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶4mg/L，輔酶Q10 0.3μM，亞麻酸8μM，血小板衍生生長因子2μg/L，薯蕷皂苷元0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，葉酸13μM，羧甲基殼聚糖0.8g/L，表皮生長因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和貼壁材料27μg/L。
所述基礎培養基為M199培養基。
所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比6：11組成。
與實施例3的區別在于，將葫蘆素B替換為薯蕷皂苷元。
對比例2、一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基
所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶4mg/L，輔酶Q10 0.3μM，亞麻酸8μM，血小板衍生生長因子2μg/L，葫蘆素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，葉酸13μM，羧甲基殼聚糖0.8g/L，表皮生長因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和貼壁材料27μg/L。
所述基礎培養基為M199培養基。
所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比1∶1組成。
與實施例3的區別在于，所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比1∶1組成。
對比例3、一種適用于牙髓干細胞體外培養的培養基
所述適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：過氧化氫酶4mg/L，輔酶Q10 0.3μM，亞麻酸8μM，血小板衍生生長因子2μg/L，葫蘆素B0.5mg/L，硫辛酸0.14mg/L，葉酸13μM，水溶性殼聚糖0.8g/L，表皮生長因子9μg/L，牛磺酸8mg/L和貼壁材料27μg/L。
所述基礎培養基為M199培養基。
所述貼壁材料由玻表粘連蛋白和纖粘連蛋白按重量比6∶11組成。
與實施例3的區別在于，將羧甲基殼聚糖替換為水溶性殼聚糖。
試驗例一、本發明適用于牙髓干細胞體外培養的培養基對牙髓干細胞培養效果
1、受試培養基：本發明實施例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，以及對比例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基。
2、培養干細胞來源：來源于牙髓的牙髓干細胞。
3、體外細胞培養實驗
用無菌鑷子夾取牙髓組織，切除根尖部1mm的牙髓組織；用眼科彎剪將牙髓組織剪成1mm3，置于50mL離心管中，加入13mL的組織消化液，封口后充分混合均勻，轉移至恒溫空氣搖床中，37℃、200rpm消化15min；加入等體積的培養基反復吹打離散細胞團塊，通過70μm的細胞篩網過濾，2000rpm離心3min；利用PBS清洗1～2次，沉淀用培養基重懸，以5×103個/mL接種培養皿中，混勻細胞懸液，放于37℃、濕度為95％的二氧化碳培養箱中培養。每隔24小時，用血球計數板測一次細胞數量。
4、實驗結果
用本發明實施例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，以及對比例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基對牙髓干細胞進行培養，培養開始時以及培養1天、2天、3天、4天和5天的細胞數量如表1所示。
表1：不同培養基對牙髓干細胞培養后細胞數量
由表1可以看出，在相同的培養時間內，生長在本發明實施例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基中牙髓干細胞的細胞數量，明顯大于生長在對比例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基中牙髓干細胞的細胞數量。這說明，本發明適用于牙髓干細胞體外培養的培養基可以明顯促進牙髓干細胞的增殖，本發明適用于牙髓干細胞體外培養的培養基的擴增效果好。
試驗例二、對增殖后的牙髓干細胞體外分化為成骨細胞，成軟骨細胞，成脂肪細胞的潛能分析影響實驗
1、受試培養基：本發明實施例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基，以及對比例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基。
2、培養干細胞來源：來源于牙髓的牙髓干細胞。
3、體外細胞分化實驗
將細胞傳代擴增至P10代，使用LONZA的成脂，成骨，成軟骨檢測試劑盒對P10代牙髓干細胞進行分化檢測。
4、實驗結果
檢測結果表明，經本發明實施例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基培養過的牙髓干細胞分化成脂肪細胞，成軟骨細胞，成骨細胞的比率在85％以上。而經對比例1-3所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基培養過的牙髓干細胞分化成脂肪細胞，成軟骨細胞，成骨細胞的比率在65％。因此，本發明所得適用于牙髓干細胞體外培養的培養基可以有效的保持牙髓干細胞的多向分化能力。