本發明涉及干細胞培養領域，具體涉及一種間充質干細胞培養基。
背景技術：
間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。隨著國內外學者對間充質干細胞生物學特性及功能的深入研究，目前已經可以從多種組織中分離出間充質干細胞。間充質干細胞具有支持造血和調節免疫等作用，在造血重建、組織修復、免疫治療等方面具有廣闊的臨床應用前景。
間充質干細胞采用含動物血清的間充質干細胞培養基作為常見的培養基質，血清能為干細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白和其它營養物質，但其存在諸多缺點：批間差異較大，來源不穩定，需要大量驗證工作，價格昂貴，成分不明確，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產品的分離純化，容易被細菌和支原體感染等。針對現有的含有血清的培養基質存在的上述問題，尋找到一種替代的培養基質已成為行業內研發重點之一。如公告號為CN102433302A的中國專利提供了一種間充質干細胞無血清培養基，其包括25μg/ml纖連蛋白、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、15ng/ml人表皮細胞生長因子、1mg/ml重組人胰島素、0.55mg/ml人轉鐵蛋白、體積比為5％的人血白蛋白、0.67μg/ml的亞硒酸鈉、5mM左旋卡尼丁和30μM白藜蘆醇。
該間充質干細胞無血清培養基，由于不含有動物來源的血清，因此可以控制培養基自身對培養細胞感染的風險；但在使用該無血清培養基對間充質干細胞培養的過程中，仍然存在被操作環境中的支原體對間充質干細胞造成污染的風險，如果培養的干細胞被支原體污染，會造成培養的干細胞生長率明顯下降，生長緩慢，破碎細胞多，需要將培養基中的干細胞全部舍棄，對操作環境嚴格滅菌后重新獲取干細胞后再對其進行培養，造成大量成本的浪費。
技術實現要素：
針對現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種間充質干細胞培養基，減少間充質干細胞培養過程中支原體的污染。
本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：
一種間充質干細胞培養基，包含無血清的基礎培養基及添加在基礎培養基中的添加劑，所述添加劑包括納他霉素和殺菌劑，所述殺菌劑選用氟喹諾酮和甲基紅霉素；且所述間充質干細胞培養基中，所述納他霉素、氟喹諾酮和甲基紅霉素的濃度分別為40-50mg/ml、0-60mg/ml和0-45mg/ml。
采用上述方案，納他霉素的內酯環上含有氨基二脫氧甘露糖基團，該基團能與甾醇化合物作用從而使形成納他霉素分子-甾醇化合物；而常見的細菌，特別是在干細胞培養中常對細胞培養造成污染的支原體，其細胞膜上含有較多的甾醇化合物；當培養基感染支原體等細菌后，納他霉素能與支原體細胞膜表面的甾醇化合物結合，納他霉素上的多醇部分在細胞膜上形成通孔，增大細胞膜的通透性；
氟喹諾酮又稱吡啶酮酸類，屬化學合成抗菌藥，其殺菌機理作用主要是通過細菌或真菌的細胞膜后作用于細胞內的DNA旋轉酶，阻礙細胞膜DNA的正常復制、轉錄、轉運與重組，從而造成支原體死亡；
甲基紅霉素屬于大環內酯類抗菌素，其可透過支原體的細胞膜，在支原體細胞內與接近供位(“P”位)與核糖體成可逆性結合，阻斷了轉移核糖核酸(t-RNA)結合至“P”位上，同時也阻斷了多肽鏈自受位(“A”位)“P”位的位移，因而細胞內蛋白質合成受到抑制，從而阻止支原體的快速分裂，從而起到對支原體的殺滅作用；
納他霉素與氟喹諾酮聯合作用，當培養基中混入細菌如支原體時，納他霉素可作用于細菌細胞膜使細胞膜表面形成“通道”，氟喹諾酮直接通過該“通道”快速進入到支原體細胞中，并與細胞內的DNA旋轉酶作用，遏制DNA旋轉酶的形成，從而阻礙細胞膜DNA的正常工作，使支原體快速“凋亡”，大大提高了對支原體的殺滅能力，在對間充質干細胞支原體感染實驗研究中發現，采用本申請的一種間充質干細胞培養基培養間充質干細胞的過程中，納他霉素與氟喹諾酮聯合殺菌效果可在5天內將接種至培養基中的支原體全部殺滅；
納他霉素與甲基紅霉素聯合作用，當培養基中混入細菌如支原體時，納他霉素可作用于細菌細胞膜使細胞膜表面形成“通道”，甲基紅霉素直接通過該“通道”快速進入到支原體細胞中，作用于支原體細胞內的蛋白質系統，擾亂蛋白質的正常合成，使支原體快速死亡，在對間充質干細胞支原體感染實驗研究中發現，采用本申請的一種間充質干細胞培養基培養間充質干細胞的過程中，納他霉素與甲基紅霉素聯合殺菌效果可在6天內將接種至培養基中的支原體全部殺滅；
納他霉素、氟喹諾酮與甲基紅霉素聯合作用，當培養基中混入細菌如支原體時，納他霉素可作用于細菌細胞膜使細胞膜表面形成“通道”，氟喹諾酮與甲基紅霉素直接通過該“通道”快速進入到支原體細胞中，分別抑制支原體細胞內DNA的正常合成及蛋白質的正常合成，從而殺滅支原體，在對間充質干細胞支原體感染實驗研究中發現，采用本申請的一種間充質干細胞培養基培養間充質干細胞的過程中，納他霉素、氟喹諾酮與甲基紅霉素聯合殺菌效果可在3天內將接種至培養基中的支原體全部殺滅。
作為優選，所述間充質干細胞培養基中納他霉素、氟喹諾酮和甲基紅霉素的濃度分別為40-50mg/ml、60mg/ml和45mg/ml。
采用上述方案，經多次試驗證明，采用上述濃度可達到對支原體最佳的殺滅效果。
作為優選，所述基礎培養基包括有Hedgehog通路激動劑Purmorphamine和葉酸；且所述間充質干細胞培養基中，Hedgehog通路激動劑Purmorphamine和葉酸的濃度分別為7μmol/L和5.5mg/L。
采用上述方案，Hedgehog信號通路控制著細胞的生長與增殖，經反復試驗在培養基中添加7μmol/L的Purmorphamine能有效加快培養基中培養的干細胞增殖能力，同時添加5.5mg/L葉酸可減少培養過程中干細胞的畸變與凋亡；在對間充質干細胞支原體感染實驗研究中發現，當培養基體系中同時含有Purmorphamine和葉酸時，在一周內該培養基體系中間充質干細胞的生長速度明顯優于只含有Purmorphamine或葉酸或不含有Purmorphamine和葉酸的培養基，且最后的細胞活率在90％以上。
作為優選，所述基礎培養基為DMEM/F12培養基。
采用上述方案，DMEM/F12培養基是將DMEM培養基與F12培養基1：1結合組成的培養基，其結合了DMEM培養基具有較高濃度的營養成分及F12含有多種細胞生長所需微量元素的特點，故其能保證培養基中干細胞的快速生長過程中的物質所需。
本發明的另一個目的在于提供一種上述間充質干細胞培養基的制備方法：一種間充質干細胞培養基的制備方法，包含以下步驟：
向DMEM/F12培養基中，按所述濃度加入甲基紅霉素、氟喹諾酮、納他霉素、Purmorphamine及葉酸，混勻，過膜除菌即得。
綜上所述，本發明具有以下有益效果：
1.具有較強的殺菌能力，特別是對培養基中間充質干細胞內外的支原體具有較強的殺滅清除能力，經過反復試驗證明，該培養基能在一周內將培養基中感染的支原體全部殺滅，當培養基中同時含有納他霉素、氟喹諾酮和甲基紅霉素時，培養基中支原體全部被殺滅的時間可縮短至3天；
2.Purmorphamine與葉酸結合能有效提高該培養基體系中間充質干細胞的增殖速度及細胞活性，經過反復試驗證明，該培養基中同時含有這兩種物質時可保證間充質干細胞數量在一周內迅速增長，且最后的細胞活率維持在90％以上，且其對間充質干細胞增值的影響優于單獨只含有Purmorphamine與葉酸中的一種或不含Purmorphamine與葉酸的培養基。
綜上，該間充質干細胞培養基能保證在其中培養的間充質干細胞免受環境中支原體的污染，防止支原體對干細胞的正常生長造成影響，確保間充質干細胞的快速生長及保持良好的細胞活性。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例1-8：一種間充質干細胞培養基，其由如下方法制備得到：
向基礎培養基中，加入甲基紅霉素、氟喹諾酮、納他霉素、Purmorphamine及葉酸，混勻，用millipore 0.22um孔徑濾器過膜除菌即得，實施例1-8的一種間充質干細胞培養基中各組分如表1所示；
將牙髓間充質干細胞按照1000細胞/cm2的密度種植到盛有上述培養基的T75細胞培養瓶中進行培養。
表1實施例1-8的成分及其含量
實施例9：
實驗步驟：
1.取實施例1-8中的細胞培養瓶各7瓶，分成7組，每組含實施例1-8中的細胞培養瓶各1瓶，并作上標記；
2.分別向培養瓶中添加EP(歐洲藥典)生產的口腔支原體標準品5μl；
3.將所有細胞培養瓶放入到37℃、CO2濃度為5％的細胞培養箱中進行細胞培養；
4.在細胞培養24小時后將第1組細胞培養瓶中的細胞收獲，48小時后將第2組細胞培養瓶中的細胞收獲，72小時后將第3組細胞培養瓶中的細胞收獲，96小時后將第4組細胞培養瓶中的細胞收獲，120小時后將第5組細胞培養瓶中的細胞收獲,144小時后將第6組細胞培養瓶中的細胞收獲，168小時后將第7組細胞培養瓶中的細胞收獲；
5.使用Lonza MycoAlert支原體檢測試劑盒，對每瓶細胞培養瓶中細胞培養后的培養液上清液進行檢測，檢測結果如表2所示；
6.同時將步驟4得到的細胞用Invitrogen公司全自動細胞計數儀Countess進行細胞計數和存活率計數。每組測3次，結果取平均值如表3所述。
表2支原體檢測結果
由表2可知，實施例1、2、5、6和7中細胞培養基在第3天檢測時，支原體檢測結果由陽性轉為陰性，說明在72小時(3天)這些實施例中培養基內里面含有的支原體全部死亡；實施例3在第5天檢測時，支原體檢測結果由陽性轉為陰性，說明在120小時(5天)實施例3中培養基內里面含有的支原體全部死亡；實施例4中細胞培養基在第6天檢測時，支原體檢測結果由陽性轉為陰性，說明在144小時(6天)實施例4中培養基內里面含有的支原體全部死亡；實施例8的檢測一直為陽性，說明實施例8中培養基一直存在存活的支原體。
實驗分析：通過對比支原體檢測結果可知，當培養基中同時含有納他霉素、氟喹諾酮和甲基紅霉素這三種成分時，其殺滅支原體的效果最強，并且其殺菌效果優于納他霉素與氟喹諾酮或者納他霉素與甲基紅霉素的組合，能至少提前48小時將培養基中支原體全部殺滅，說明這三種成分的結合在清除支原體上起到了協同作用，其清除支原體的效果遠遠優于兩種藥物的組合。
表3細胞數及細胞活率檢測結果
由表3可知，實施例1、5、6和7中的細胞數一致處于增加狀態，說明細胞一直在增殖，實施例2.、3和4中細胞培養6天后即停止增殖，實施例8中細胞培養5天后即停止增殖。
實驗分析：通過對比以上實施例可知，當培養基中存在Purmorphamine或者葉酸中的一種物質時，干細胞在培養的一周內都是在一直在增殖；同時對比實施例1和實施例5和實施例1與實施例6可知當培養基中同時含Purmorphamine和葉酸兩種物質時，其對干細胞增殖的作用遠遠大于培養基中只含有Purmorphamine或者葉酸的情況；此外對比實施例5和實施例6的數據可知Purmorphamine對干細胞增殖的影響遠遠大于葉酸；說明了Purmorphamine和葉酸對于培養基中干細胞的增殖起到了協同作用，其結合對干細胞增殖起到的效果遠遠優于單獨使用Purmorphamine或單獨使用葉酸；
同時對比實施例1和實施例7可知當基礎培養基為DMEM/F12時，培養的間充質干細胞具有更快的增值速度和更好的細胞活性。
此外結合對表2的分析可知，當培養基中同時存在納他霉素、氟喹諾酮、甲基紅霉素、Purmorphamine和葉酸時可在防止培養基中的間充質干細胞被支原體感染的情況下，維持培養體系中間充質干細胞的活性，使間充質干細胞保持更快的增殖速度。
本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其并不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書后可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求范圍內都受到專利法的保護。