經刺激的干細胞的培養基的毛發生長促進功能及其用途的制作方法

本發明涉及用于預防脫發和促進毛發生長的組合物、其制造方法及其用途，所述組合物含有通過特定的退行期誘導物(包括TGF-β)刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分。

背景技術：

隨著環境污染、壓力、老齡化和工業發展的進行，禿頭癥(Alopecia)癥狀或脫發癥狀變得更加嚴重，并且隨著福利時代的到來，對生活質量和軀體外觀的關注日益增加。

禿頭癥(頭發從頭皮脫落的癥狀)是由各種原因引起的，包括例如內在因素(如遺傳性狀和雄性激素的作用)；日常生活中的精神壓力；以及外部因素(如脂質過氧化物的積累)，并且已知禿頭癥癥狀由非常復雜的過程引起。

毛發光禿并不意味著毛發喪失并且永不再生長，而是毛發逐漸變得更細成為絨毛狀毛發，并且存在于毛發根部中的真皮乳頭變小。隨著真皮乳頭變得更小，毛發厚度也變得更細，并且毛發周期變得更短，從而使新生長的毛發變得更細。隨著光禿不斷發展，毛發變成絨毛狀毛發，并且使毛發周期更短，從而在短的生長之后失去毛發。另外，目前還關注了已知為自身免疫性疾病的斑禿，以及歸因于內分泌疾病、營養缺乏、藥物、軀體或精神的壓力(例如分娩等)而發生的暫時性禿頭癥。

最近，不僅是男性型禿頭癥，而且女性的肥胖性禿頭癥和年輕人禿頭癥正在逐漸增加。根據由韓國國家保障服務部的健康福利政策研究所在2009年發布的消息，2008年的國內禿頭癥患者的數量與2001年相比增加了至少60％。此外，兒童和青少年禿頭癥患者的數量從2006年的21,643例增加至2011年的23,025例，在5年中表現出了約6.4％的增加。

為了矯正上述脫發現象，市場上已經有了許多類型的毛發生長劑和毛發滋養劑。根據Economy 21的報告，在韓國當前的脫發服務國內市場中，化妝品和準藥品占80％，且藥品占約20％，其中，看過醫生的禿頭癥患者僅占5％。目前，在使用毛發生長相關產品的人群中，約72.7％的使用者對產品不滿意，并且除了由美國FDA在1998年(即大約15年前)公布的經批準的兩種制劑和之外，并沒有已批準的用于脫發治療的療法。因此，這兩種制劑不足以治愈所有的各種類型的脫發相關的癥狀。特別地，作為非那雄胺制劑而制備的并不是毛發生長劑，而是脫發預防劑。僅具有通過阻斷5-α還原酶而抑制DHT的產生來最大程度地延緩男性類型的禿頭癥的進展的作用。

在目前市場上可獲得的毛發生長劑和毛發滋養劑(例如和)的情況下，由于應用激素制劑，該試劑可能引起副作用，或者它們僅在發根激活的區域發揮作用。因此，盡管該試劑具有有關預防脫發的作用，但是它們對處于長期休止期的毛發的生長(即毛發生長)的作用可忽略不計，或者只有當它們連續給予或施用時才可能表現出作用，因此，有必要開發用于解決禿頭癥或脫發癥狀的有成本效益且穩定的技術。韓國用于禿頭癥的治療劑的研發水平在技術上落后于發達國家，并且急需研發用于預防脫發、促進毛發生長和毛發再生的治療劑。關于針對韓國的脫發的研究，自1950年以來已經公開了關于毛發生長和發根再生的報告，但是由于缺乏再現性等，在過去的50年中毛發再生被認為是不可能的。

然而，美國賓夕法尼亞大學醫學院的Costarelis教授在1990年首次發現了毛囊干細胞(Cell，1990)，成功地分離了人毛囊干細胞(J.Clin.Invest，2006)，并發布了其對于毛囊再生的可能性的研究結果(Nature，2007)，其再現性在那時被認為是不可能的，并且開辟了研究禿發本身的基礎治療的可能性。

最近，已經開發了使用基因和干細胞對脫發進行治療的方法。作為本發明的基礎，韓國專利號10-0771171(2007年10月29日)描述了用于毛囊干細胞的分離、擴增和分化的方法，以及用于禿發的治療組合物。韓國專利申請公開號10-2008-0097593(2008年11月06日)描述了包含來源于人脂肪組織和毛囊細胞的多能干細胞的細胞治療劑。此外，韓國專利號10-1218101(2013年1月3日)描述了用于促進毛發生長和預防脫發的組合物，該組合物包含來自羊水的胎兒來源的間充質干細胞的條件培養基作為活性成分。

然而，使用干細胞的上述試劑對毛發生長的作用并不充分，因此，正在進行使用干細胞的各種嘗試，以開發用于對脫發進行治療的有效治療劑。

在這一方面，本發明人在努力鑒定來源于臍帶血的間充質干細胞對毛發生長的作用的同時，發現與先前的看法相反，TGF-β(已知為引起脫發的物質)對臍帶血干細胞的處理分泌了對毛發生長有效的蛋白質，并且還確認了通過培養用TGF-β刺激的干細胞而獲得的條件培養基表現出比先前已知的案例更優秀的毛發生長促進效果，從而完成了本發明。

現有技術文獻

專利文獻

1.韓國專利號10-0771171(2007年10月29日)

2.韓國專利號10-1422559(2014年7月17日)

3.韓國專利申請公開號10-2013-0009117(2013年1月23日)

4.韓國專利申請公開號10-2014-0125735(2014年10月29日)

5.韓國專利申請公開號10-2008-0097593(2008年11月6日)

6.韓國專利號10-1218101(2013年1月3日)

非專利文獻

1.Dong L，Hao H，Xia L，Liu J，Ti D，Tong C，Hou Q，Han Q，Zhao Y，Liu H，Fu X，Han W，Treatment of MSCs with Wnt1a-conditioned medium activates DP cells and promotes hair follicle regrowth，Sci Rep.2014Jun 25，4：5432.doi:10.1038/srep05432。

2.Park BS，Kim WS，Choi JS，Kim HK，Won JH，Ohkubo F，Fukuoka H，Hair growth stimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced by hypoxia:evidence of increased growth factor secretion，Biomed Res.，2010年2月，31(1)：27-34。

3.Jeong YM，Sung YK，Kim WK，Kim JH，Kwack MH，Yoon I，Kim DD，Sung JH，Ultraviolet B preconditioning enhances the hair growth-promoting effects of adipose-derived stem cells via generation of reactive oxygen species，Stem Cells Dev，2013年1月1日，22(1)：158-68.doi:10.1089/scd.2012.0167.Epub 2012Aug 13。

在本發明的整個申請文件中，參考了許多參考文獻和專利文獻，并且適當地指出了其引用。將所引用的參考文獻和專利文獻的公開內容以其整體作為參考并入本申請文件中，從而對本發明所屬的技術領域的水平和本發明的公開內容進行更清楚地解釋。

技術實現要素：

技術問題

本發明使用通過特定的毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基，通過刺激干細胞分泌與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白，并且本發明的主要目的是提供用于預防脫發和促進毛發生長的組合物，該組合物含有通過特定的毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基。

本發明的另一目的是提供使用該組合物用于預防脫發和促進毛發生長的方法。

本發明的進一步的目的是提供有效使用該組合物的方法。

技術方案

為了實現上述目的，本發明提供了通過用特定的毛發退行期誘導物(包括TGF-β)刺激干細胞經由分泌與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白而利用非常有效的毛發生長功能的各種用途。

在示例性實施方式中，本發明提供了用于預防脫發和促進毛發生長的組合物，該組合物包含通過至少一種毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分，所述毛發退行期誘導物選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組。優選地，本發明提供了通過包括TGF-β的至少一種因子刺激的條件培養基。

由于通過毛發退行期誘導物刺激的干細胞產生了分泌Wnt3a、Bcl-2、細胞周期蛋白D-1等(已知為與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白)的效用，因此實現了預防脫發和促進毛發生長的作用。

具體而言，通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物刺激的條件培養基具有以下功能：

(i)縮短毛發周期中的從休止期至生長期的轉變時間；

(ii)產生真皮乳頭細胞并促進長度方面的生長；

(iii)增加毛囊的數量和大小；以及

(iv)增加頭皮皮膚的厚度。

特別地，干細胞可以是選自于由如下所組成的組中的至少一種：來源于骨髓、臍帶血、脂肪、血液、肝臟和腸道、皮膚、胃腸道、胎盤、神經、腎上腺、上皮和子宮的人組織成體干細胞；以及胚胎干細胞。優選地，干細胞可以來源于骨髓、臍帶血或脂肪；更優選來源于臍帶血的成體干細胞，例如，來源于臍帶血的間充質細胞。此外，待使用的臍帶血優選為來源于人的臍帶血。

通過毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基的終濃度優選為10％至30％、終濃度更優選為25％。

另外，待使用的條件培養基可以是適用于動物細胞生長的任何基礎培養基，且培養基的非限制性實例可以包括MEM(最低必需培養基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培養基)和KM(角質形成細胞培養基)、KBM(角質形成細胞基礎培養基)、EpiLife KM(角質形成細胞-EpiLife培養基)等，并且優選KM(角質形成細胞培養基)、KBM(角質形成細胞基礎培養基)和EpiLife KM(角質形成細胞-EpiLife培養基)。

特別地，可以通過在將毛發退行期誘導物加入至干細胞后將干細胞刺激22小時至26小時，然后培養選自1至3天的時間段，獲得通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4等所組成的組中的毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基。更具體的實例可以參考本發明的實施例。

在本發明中，通過包括TGF-β的毛發退行期誘導物刺激的干細胞分泌已知作為與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1等，而干細胞的培養、本發明的干細胞的條件培養基的特征在于該條件培養基包含選自于由Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1所組成的組中的至少一種蛋白質。

能夠以藥物組合物或化妝品組合物的形式來制備和提供本發明的組合物。

同時，在另一示例性實施方式中，本發明可以提供使用該組合物用于預防脫發和促進毛發生長的優選方法，如上所解釋的，所述組合物含有通過毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基，所述毛發退行期誘導物選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組。

另外，本發明可以提供通過促進毛發生長來對脫發進行治療的方法，所述方法使用含有通過毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分的毛發生長促進組合物。

優選地，在本發明的方法中，可以通過局部涂抹或注射、更優選局部涂抹來使用皮膚外給予。

因此，本發明基于以下事實的發現：使用已知為脫發誘導物質的毛發退行期誘導物(例如TGF-β、BMP等)、更優選包括TGF-β的試劑對來源于臍帶血的干細胞進行處理，能夠分泌對毛發生長有效的蛋白質。這與常規的看法相反，并且本發明提供了經刺激的干細胞的條件培養基的優異的預防脫發和毛發生長作用及其各種用途。

附圖說明

圖1是示出了用通過TGF-β刺激的來源于各種來源的干細胞的條件培養基和對照組進行處理的hDPC的細胞增殖的評估結果的圖；

圖2是確認了在通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基中包含的、與毛發組織分化關聯的信號轉導系統相關蛋白的表達水平的蛋白質印跡結果；

圖3是確認了在用通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基和對照組進行處理后，真皮乳頭(DP)細胞長度生長的結果；

圖4是關于用通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基和對照組進行處理后，毛囊形成數的圖表和立體顯微照片；以及

圖5是確認了用通過TGF-β刺激的來源于UCB(臍帶血)的干細胞的條件培養基和對照組涂覆CH3小鼠3周后的毛發生長特征的圖片。

圖6是確認了用通過TGF-β刺激的來源于脂肪和骨髓的干細胞的條件培養基和對照組涂覆CH3小鼠4周(28天)后的毛發生長特征的圖片。

具體實施方式

本發明中使用的術語可以如下文所述進行定義。

“毛發生長促進”和“脫發預防”是具有相似含義的術語，它們是指本領域中的促進毛發形成和毛發生長以及預防脫發或毛發劣化的所有效果。

本文所使用的術語“干細胞”是指可以發育成任何組織的細胞。干細胞的兩個基礎特征是能夠通過重復分裂產生自我的自我更新以及能夠根據環境而分化成具有特定功能的細胞的多分化潛能。

本文所使用的術語“間充質干細胞”是指分離自人或哺乳動物且可來源于各種組織的一類未分化的成體干細胞。成體干細胞中的造血干細胞主要以非粘附狀態存在，但是間充質干細胞通常是粘附細胞。特別地，間充質干細胞可以是臍帶來源的間充質干細胞、臍帶血來源的間充質干細胞、骨髓來源的間充質干細胞、脂肪來源的間充質干細胞、肌肉來源的間充質干細胞、神經元來源的間充質干細胞、皮膚來源的間充質干細胞、羊膜來源的間充質干細胞、胎盤來源的間充質干細胞，并且優選臍帶血來源的間充質干細胞。從各組織中分離干細胞的技術是本領域已知的。

本文所使用的術語“條件培養基”是指包含在通過培養干細胞獲得的培養基中含有的構成成分的物質，并且用于制備上述條件培養基的干細胞在其種類方面不受限制。例如，用于制備條件培養基的干細胞可以是胚胎干細胞或成體干細胞。此外，成體干細胞可以來源于所有組織的成體干細胞。在本發明的示例性實施方式中，使用臍帶血來源的成體干細胞來制備條件培養基。優選地，通過將TGF-β向其中加入22小時至26小時進行刺激，隨后培養選自1至3天的時間段而獲得干細胞。

本文所使用的術語“分化”是指細胞中的現象，其中，細胞的結構或功能在通過細胞分裂的細胞生長期間特化，即，生物體的組織或細胞的形狀或功能方面的漸進性變化，使得它們可以執行分配給它們的工作。通常，該術語是指將相對簡單的系統分化為兩個以上的不同性質的部分系統的現象。

本文所使用的術語細胞的“增殖”或“生長”是指通過細胞分裂使具有相同性質的細胞增加，并且通常是指多細胞生物體的軀體中的細胞數目的增加。當增殖(擴增)后的細胞的數量達到一定時期時，細胞的特征在其變化(分化)時受到調整。

本文所使用的術語“培養基”是指細胞的體外生長和增殖所必需的混合物，包含細胞生長和增殖所必需的元素，例如氨基酸、各種營養物質、血清、生長因子、無機物質等。特別地，本發明的培養基是用于干細胞的生長和增殖的培養基。

本文所使用的術語“基礎培養基”是指含有細胞存活所需的糖、氨基酸和水等而不包含血清、營養物質和各種生長因子的混合物。可以通過人工合成加以制備或通過購買可商購的培養基來使用本發明所述的基礎培養基。商業上制備的培養基可以包括例如DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基)、EDM(內皮分化培養基)、MEM(最低必需培養基)、BME(基礎培養基Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-最低必需培養基)、G-MEM(Glasgow最低必需培養基)和Iscove改良的Dulbecco培養基，但不限于此。

本文所使用的術語“治療”是指為了獲得有利或優選的臨床結果的手段(access)。對于本發明的益處，有利或優選的臨床結果作為非限制性實例可包括癥狀緩解、疾病范圍縮小、疾病狀態穩定(即不惡化)、疾病進程延遲或減弱、疾病狀態(部分或全部地)改善或暫時緩解和變好、以及存在物的可檢測或不可檢測。術語“治療”同時指治療性處理和預防性或防治性治療方法。治療不僅包括可預防傷殘，而且還包括在已經發生的傷殘中所需的治療。術語“緩和(palliating)”是指相對于未進行治療的情況而言的不期望的臨床征象和/或疾病狀態范圍的減小和/或進展時程的延長或延伸。

本文所使用的術語“有效量”是指能夠影響有利或期望的臨床結果或生化結果的合適的量。有效量可以一次給予或多次給予。有效量是適于暫時緩解、改善、穩定、逆轉、減緩或延緩疾病狀態進展的量。在本發明中，有效量是指緩解或延緩脫發進展或促進毛發生長所需的量。如果待獲得益處的動物可以耐受組合物的給予，或者該給予適合于動物，則該組合物被認為是“藥學上或生理上可接受的”。當給予的量在生理學上重要時，可以認為制劑以“治療學上有效量”給予。當制劑本身的存在引起有益患者數量方面的生理學上可檢測的變化時，該制劑被認為是生理上有意義的。

本文所使用的術語“約”是指相對于參比的量、水平、值、數量、頻次、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度而言，變化程度為30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、數量、頻次、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。

在本發明的申請文件中，除非在上下文中另有需要，否則術語“包括/包含(include/including)”應當解釋為包括/包含所表明的步驟或成分或者步驟或成分的組，但并不排除其它可選的步驟或成分或者步驟或成分的組。

下面將對本發明進行詳細描述。

本發明涉及用特定因子處理的干細胞的條件培養基的特定功能(即，預防脫發和促進毛發生長的功能)及其用途。

可用作用來顯著預防脫發和促進毛發生長的毛發退行期誘導物的因子為選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF、BMP2/4等所組成的組中的至少一種，最優選包括TGF-β的因子。

干細胞是能夠自我復制并分化成兩種以上細胞的細胞，并且根據其來源可以使用胚胎干細胞或成體干細胞。在本發明中，待使用的干細胞可以是來源于各種組織來源的成體干細胞，例如來源于脂肪、子宮、骨髓、肌肉、胎盤、臍帶血或皮膚(上皮)的組織。特別地，優選間充質干細胞(MSC)。間充質干細胞通常是有助于血細胞生成的基質，并且可以分化成各種中胚層細胞，并且容易增殖且同時保持未分化狀態。在示例性實施方式中，使用來源于脂肪、骨髓和臍帶血的間充質干細胞(MSC)。最優選使用來源于臍帶血的間充質干細胞。

臍帶血是指來自臍帶的血液，并且含有大量的產生白細胞、紅細胞和血小板等的造血干細胞以及內皮祖細胞，而且還含有產生軟骨、骨骼、肌肉、神經等的間充質干細胞，因此，其具有高的藥用價值。臍帶血的特征不僅在于造血干細胞的數量以高于骨髓或外周血液中的濃度存在于臍帶血中，而且還在于臍帶血具有比起骨髓中發現的造血干細胞而言顯著更高的增殖能力、自我復制能力和分化能力。另外，臍帶血可以通過簡單的外科手術從待丟棄的臍帶中獲得，并且相對于其量而言還有相對大量的造血干細胞和干細胞。因此，在優選的實施方式中，本發明使用人臍帶血來源的間充質干細胞(hUCB-MSC)。

特別地，臍帶血來源的間充質干細胞：(i)當作為細胞治療劑使用時，與來源于其它組織的干細胞不同，其幾乎沒有免疫排斥；(ii)由于它們是從待丟棄的胎盤和臍帶中收集的，因而并不會伴有從中獲取干細胞的受試者的病痛；以及(iii)當施用時，可以直接施用至患有疾病的區域。特別地，其優點在于，當將該間充質干細胞移植入實際靶區域中時，旁分泌效應被激活，并因此分泌能夠治療、復原或恢復患有疾病的區域的因子(蛋白質、細胞因子)，從而治愈疾病。

待用于分離和培養從臍帶血收集的間充質干細胞的方法可以為本領域已知的任何方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)，例如，可以使用包括韓國專利號10-0494265中公開的方法在內的所有常規方法。在本發明的實施方式中，可以使用以下方法。

通過離心將單核細胞從收集的臍帶血中分離，并洗滌數次以除去雜質。將所得到的單核細胞通過以適當的密度接種在培養容器中進行培養，從而使細胞能夠增殖，并同時形成單層。本文中，當在相差顯微鏡下觀察時，以具有長的均勻的紡錘形狀的集落的形式增殖的細胞為間充質干細胞。然后當細胞生長至融合時，將細胞進行傳代培養和增殖直至獲得適當數量的細胞。

特別地，本發明的特征在于優選通過用特定的毛發退行期誘導物進行處理來刺激干細胞。退行期誘導物包括選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種因子，并且最優選TGF-β。

相對于細胞體積，用于處理的毛發退行期誘導物的濃度為8-15ng/mL、優選8-12ng/mL、最優選9-11ng/mL。在本發明的示例性實施方式中，當細胞融合被確定為80％以上時，用約10ng/mL的毛發退行期誘導物對細胞進行處理。

TGF-β是具有各種功能的細胞因子，并且是已知通過經由Smads調節TGF-β相關基因的表達而與細胞生長和分化、炎癥反應、細胞凋亡和細胞的基質合成密切相關的物質，其是存在于細胞質中的轉錄因子并且據報道參與毛囊細胞的壞死。

脫發的最大原因是作為激素的二氫睪酮(DHT)綴合至作為還原劑的5-α-還原酶和睪酮，并且進入正常毛發細胞的DHT遞送了破壞細胞核信號的DNA細胞，從而導致減小毛囊尺寸或損壞以及脫發。特別地，毛囊細胞凋亡因子通過毛發細胞的DNA破壞信號來攻擊鄰近的毛囊細胞，從而導致脫發，毛囊的壞死因子的實例包括BMP、DKK-1和TGF-β(J Cell.Sci，2006，J.Anat.，2003)。也就是說，TGF-β或BMP等是已知的誘導脫發的物質。

因此，為了預防脫發和促進毛發生長的效果而用這些物質對干細胞進行處理是本領域普通技術人員不容易想到的技術，并且它也是構成了本發明的重要特征的特點。

本發明人首次確認了通過用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物進行處理來刺激干細胞分泌出了有效用于毛發生長的物質。

用這些因子刺激的干細胞分泌出了已知為與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1等，并且通過這些蛋白質可以進一步改善預防脫發和促進毛發生長的功能。

因此，在本發明中，通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基包含選自于由Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1所組成的組中的至少一種蛋白質。

在優選的實施方式中，可以通過向干細胞添加TGF-β而將干細胞刺激22小時至26小時、最優選約24小時，獲得經毛發退行期誘導物刺激、例如經TGF-β刺激的干細胞的條件培養基。優選地，將經刺激的干細胞培養選自1至3天的時間段。代表性的制備方法可以參考本發明的實施例。

因此，在另一示例性實施方式中，本發明包括通過用毛發退行期誘導物刺激干細胞來制備用于預防脫發和促進毛發生長的干細胞的條件培養基的方法。

干細胞的條件培養基的終濃度優選為約10％至50％、更優選約10％至30％、甚至更優選20％至30％、并且最優選約25％。

特別地，本發明的干細胞可通過本領域已知的方法進行增殖和培養。

作為合適的培養基，可以使用可在實驗室中制備的伴隨有用于培養動物細胞(特別是哺乳動物細胞)所必需或所開發的合適組分(例如合成代謝碳、氮和/或痕量營養物)的任何可用的培養基。

作為非限制性實例，培養基是適合于動物細胞生長的任何基礎培養基，并且通常用于培養的基礎培養基可以包括MEM(最低必需培養基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培養基)和KM(角質形成細胞培養基)，以及可以不受限地使用的本領域中使用的任何培養基。優選地，培養基可以選自于由如下所組成的組：α-MEM培養基(GIBCO)、KM(角質形成細胞培養基)、KBM(角質形成細胞基礎培養基)、EpiLife KM培養基(角質形成細胞-EpiLife培養基)、DMEM培養基(Welgene)、MCDB 131培養基(Welgene)、IMEM培養基(GIBCO)、DMEM/F12培養基、PCM培養基、M199/F12(混合物)(GIBCO)和MSC擴增培養基(Chemicon)。

可以向基礎培養基中加入痕量營養物、氮和碳的合成代謝供應源，并且作為非限制性實例，可以加入血清供應源、生長因子、氨基酸、抗生素、維生素、還原劑和/或糖供給源。然而，顯而易見的是，本領域普通技術人員可以選擇用于來源于各種組織來源的干細胞的最合適的培養基，或者根據已知的方法組合并適當地培養。在本發明的實施方式中，使用α-MEM培養基和K-SFM培養基等。

另外，顯然可以基于本領域的常識，在調節例如培養環境、時間、溫度等條件的同時對干細胞進行培養。

在示例性的實施方式中，將間充質干細胞培養在α-MEM培養基中，直至細胞融合為約80％-90％、優選約90％，并且例如，使用PBS等對間充質干細胞進行洗滌，然后進一步在K-SFM培養基中培養約20小時至25小時、優選24小時。

本文所使用的術語“融合(％)”是表示本領域常規使用的每面積的細胞濃度(飽和程度)的術語，以及本領域普通技術人員在實驗中頻繁使用的相對地表示每單位面積的細胞數(細胞濃度)的單位。本發明還包括制備這些尺寸為8μm以下的干細胞及用于該干細胞的條件培養基的方法。

同時，該方法可以進一步包括用胰蛋白酶對在根據本發明的培養基中培養的干細胞進行處理的步驟。當用胰蛋白酶對經培養的干細胞進行處理時，可以獲得處于單核細胞形狀的干細胞。特別地，胰蛋白酶進行處理以抑制細胞之間的積聚，從而獲得單細胞形狀，并且可以使用能夠抑制細胞之間形成積聚的任何物質。

可以使用本領域中常規已知的容器進行干細胞的培養。例如，可以使用三維生物反應器或旋轉器、或者在普通的粘附容器中培養干細胞。

本發明涉及通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物刺激的條件培養基的用途，所述條件培養基具有極其出色的預防脫發和促進毛發生長的作用。

特別地，通過這些因子刺激的干細胞的條件培養基包含已知為與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1等，因此，通過真正的真皮乳頭細胞的產生、長度生長的促進、毛囊數量和大小的增加、頭皮厚度的增加等作用，它們不僅具有簡單的延緩脫發癥狀的作用，而且還具有毛發生長的作用(即，毛發形成和生長的作用)。

用于減少DHT(其為脫發的原因)的藥物(迄今為止所使用的)的實例包括使用非那雄胺制備的然而，該藥物的主要機理是該藥物抑制5-α還原酶的作用以減少DHT，從而矯正脫發。僅具有阻斷5-α還原酶以抑制DHT形成的作用，從而最大程度地延緩男性類型脫發的進展。因此，是用于男性的治療劑，并因此具有如下局限：它不是用于促進毛發生長的試劑，而僅僅是用于預防脫發的試劑。

然而，通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物(最優選包括TGF-β的誘導物)刺激的干細胞的條件培養基的優點在于其是用于預防脫發的藥劑，同時也是用于促進毛發生長的出色的試劑。

在下文中，將對如下的條件培養基的脫發預防和毛發生長特性進行描述，所述條件培養基是通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基。

(i)減少毛發周期中的從休止期至生長期的轉變時間。

人毛發喪失，同時周期性地重復生長期、退行期和休止期，然后再次形成，并且毛發周期通過激素調節或多種生長因子的調節來建立。真皮乳頭細胞具有生長期(其中生長變得活躍)、退行期(其中開始退化)和休止期的周期。在休止期后，當接收到來自相鄰細胞的信號時，真皮乳頭細胞進入生長期，并且建立細胞更新，并最終引起新的毛發的形成。

通過誘導物刺激的本發明的條件培養基并不具有歸因于激素等的暫時性作用，而是通過使毛發周期調節正常化而具有永久性毛發生長效應的作用。

(ii)產生真皮乳頭(DP)細胞，促進長度生長并顯著增加毛囊的數量和大小。

毛囊是僅由哺乳動物擁有的皮膚的附屬器官，從胎兒期產生，并且通過上皮和間充質之間的相互作用而形成。

胎兒期的毛囊的產生通過來自真皮的信號觸發，其結果是上皮變厚并形成平板。來自厚的上皮平板的真皮信號誘導了來源于間充質的真皮細胞的凝集，并且從由此形成的凝集體再次發出真皮信號。該信號促進了真皮細胞的增殖，并同時誘導向上皮細胞的真皮侵襲，從而包圍在凝集體的周圍，并隨后形成真皮乳頭。因此，形成了第一毛囊結構，并且隨著上皮細胞繼續增殖和分化，它們發育成形成毛發的成熟毛囊。毛囊的基質細胞和真皮乳頭細胞之間的相互作用通過成熟的毛囊中的基底膜引起毛囊的基質細胞的特定分化，其結果是形成毛發并使其生長。此外，該相互作用產生了毛囊的周期、維持了器官、并確定了生物特性(例如毛發的厚度和形狀)。

在毛囊中，決定生物特性的兩個重要因素是外根鞘(ORS)(其為毛囊上皮)和間充質來源的真皮乳頭(DP)，并且毛發通過重復毛發周期而生長和喪失。

在本發明的實施方式中，確認了使用hDPC、ORS、hKC和HaCaT細胞的通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基有效地增殖了真皮乳頭(DP)細胞。

此外，通過動物實驗確認了，原始DP細胞的毛囊長度的助長作用、毛囊形成的促進作用、毛發生長的速度和量極其出色。

(iii)增加頭皮皮膚的厚度。

此外，通過上述因子刺激的干細胞的條件培養基還可以有效地增加皮膚的厚度和長度，從而改善與毛發生長相關的整體環境。

因此，基于如下的新事實，毛發退行期誘導物、特別是TGF-β和BMP等(盡管它們已知為脫發誘導物質)對干細胞進行處理，可以分泌對毛發生長而有效的蛋白質，本發明展示出改善毛發生長所需的整體環境的作用。

在本發明的實施方式中，通過使用小鼠的體內實驗以及體外和離體實驗，確認了用TGF-β處理的臍帶血來源的干細胞的條件培養基展示出極其優異的毛發生長作用。

能夠觀察毛發生長可能性的體內實驗的實例可以確認在具有正常的毛發生長周期和快速誘導的生長期的小鼠中縮短休止期的作用。特別地，可以常規地使用C57/BL6小鼠或C3H小鼠，因為這些小鼠能夠觀察具有黑色素顏色的毛發。使用使毛發生長和毛囊增殖的能夠觀察到DP增殖的裸鼠。在本發明中，可以使用本領域已知的用于確認毛發生長作用的任何小鼠。

然而，優選使用C3H小鼠。與具有約兩周的休止期的普通小鼠不同，C3H小鼠可以保持至少4周的休止期，并因此作為斑禿小鼠模型更有用。也就是說，可以通過確認誘導C3H小鼠的毛發周期進入生長期的作用來對毛發生長作用的優越性進行評價。

因此，一方面，本發明涉及用于促進毛發生長的組合物、其制備方法以及使用該組合物預防脫發和促進毛發生長的方法，所述組合物含有用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組的至少一種毛發退行期誘導物(最優選包括TGF-β的誘導物)刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分。

該組合物能夠以不顯示任何細胞毒性的10％至50％(v/v)、優選約10％至30％(v/v)、優選20％至30％(v/v)、最優選25％(v/v)的有效濃度而被包含，但不限于此。

在本發明的實施方式中，本發明的組合物可以包括藥物組合物和/或化妝品組合物。

藥物組合物

在另一方面，本發明可以提供用于促進毛發生長的藥物組合物，所述藥物組合物含有用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物(最優選包括TGF-β的誘導物)刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分。

脫發主要分為瘢痕性脫發和非瘢痕性脫發，非瘢痕性脫發包括先天性脫發、男性類型脫發和斑禿等。在本發明中，脫發包括上述所有的脫發，并且不限于此。

待包含在本發明的藥物組合物中的藥學上可接受的載體為在制造中常規使用的載體，并且可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽/酯、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油等，但不限于此。除了上述成分之外，本發明的藥物組合物還可以含有潤滑劑、保濕劑、甜味劑、矯味劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑等。

本發明的藥物組合物的劑量的適當量可以根據各種因素而變化，所述因素包括配制方法、給予方法、患者年齡、體重、性別、疾病嚴重程度、飲食、給予持續時間、給予途徑、釋放速率和反應靈敏度，并且經驗豐富的醫生可以容易地確定和開出用于預期治療的有效劑量。同時，本發明的藥物組合物的劑量不限于此，并且可以是每天0.01mg/kg(體重)至2000mg/kg(體重)。

本發明的藥物組合物可以口服給予或腸胃外給予。當腸胃外給予時，可以通過靜脈內注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜內注射、皮膚外給予來給予藥物組合物。優選地，藥物組合物經腸胃外給予。優選地，本發明的藥物組合物的給予途徑可以根據疾病的類型來確定。

例如，本發明的藥物組合物可更優選地局部(locally或topically)給予以施用于皮膚上。用于施用本發明的藥物組合物的區域不僅包括頭皮，還包括需要毛發生長的軀體的任何部分。例如，可將其用于改善其中的毛發或其它體毛由于損傷造成的疤痕而損壞的區域，或用于改善需要美容護理作用的區域，例如寬前額或M型前額、睫毛或眉毛，以及用于改善無毛癥

優選地，可經由涂抹或注射、更優選經由涂抹的皮膚外給予來給予本發明的組合物。

在使用涂抹給予的情況下，通過簡單地將組合物以一次至三次涂抹在頭皮上，本發明示出了預防脫發和促進毛發生長的顯著的作用。

特別地，在經由注射給予的情況下，推薦將該組合物注射至真皮層中，同時注射器的針的端部的孔朝上，從而使組合物在充分擴散入皮膚的真皮層之后遞送至毛細血管中，即，為了防止組合物在真皮層上短暫保留后立即進入真皮層。

化妝品組合物

在另一方面，本發明涉及用于促進毛發生長的化妝品組合物，所述化妝品組合物含有通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物(最優選包括TGF-β的誘導物)刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分。

本發明的化妝品組合物能夠以本領域中常規制造的任何制劑制備。例如，化妝品組合物可以配制成乳液、面霜、化妝水、面膜、粉底、洗液、美容液、發用化妝品，但不限于此。

優選地，可以通過加入常規添加劑將化妝品組合物制備為組合物，例如洗發香波、潤發劑、生發油、發膠、洗發劑、發膜、噴發劑、發用摩絲、焗油膏、染發劑、護發素、用于促進毛發生長的它們的混合類型(例如洗發香波和潤發劑的混合類型、潤發劑和焗油膏的混合類型)和用于毛發生長的液態試劑等，并且可以包括其氣溶膠類型。

當制劑類型為膏劑、面霜或凝膠時，載體的組分可以為動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、二氧化硅、滑石或氧化鋅等。當制劑類型為粉劑或噴霧劑時，載體的組分可以為乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末，特別地，在噴霧劑的情況下，可以包含推進劑，例如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚。當制劑類型為液體或乳劑時，載體的組分可以為溶劑、增溶劑或乳化劑，例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脫水山梨糖醇的脂肪酸酯。當制劑類型為懸浮劑時，載體的組分可以為液相稀釋劑，例如水、乙醇或丙二醇；懸浮液，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯；微晶纖維素；偏氫氧化鋁；膨潤土；瓊脂或黃蓍膠等。當制劑類型為含表面活性劑的清潔劑時，載體的組分可以為脂族醇硫酸酯/鹽、脂族醇醚硫酸鹽/酯、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽/酯、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

除了活性成分以外，待包含在本發明的化妝品組合物中的成分可包括在化妝品組合物中常用的組分和載體，所述組分例如抗氧化劑、穩定劑、增溶劑、維生素、常規助劑(如色素和矯味劑)。

可以通過任何常用的方法來制備化妝品組合物。

優選地，用于預防脫發和促進毛發生長的化妝品組合物可以通過直接將其施用在頭皮或毛發上或者將其注射在頭皮或毛發上的皮膚施用來使用。

基于成人體重，本發明的組合物中包含的作為活性成分的混合提取物的施用量為40mg/kg以下、優選20mg/kg-40mg/kg。

將組合物施用在皮膚上的方法可以包括本領域公開的任何方法。本發明的化妝品組合物可以單次使用或重復使用，或者可以與其它化妝品組合物組合使用。另外，可以根據常規使用方法來使用具有出色的皮膚保護作用的本發明的化妝品組合物，并且其施用頻率可以根據使用者的皮膚狀況或品味而變化。

脫發治療的方法

此外，另一方面，本發明涉及通過使用促進毛發生長的組合物促進毛發生長來治療脫發的方法、制備該組合物的方法以及使用該組合物預防脫發和促進毛發生長的方法，所述化妝品組合物含有用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發退行期誘導物(最優選包括TGF-β的誘導物)刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分。

在上述的治療脫發的方法中，干細胞的條件培養基或組合物的細節與上文的描述相同。

在上述的治療脫發的方法中，特別優選使用利用涂抹或注射方法的皮膚外給予方法。特別地，優選將該組合物的活性成分注射入真皮層中，同時注射器的針的端部的孔朝上，從而使得組合物在充分擴散至皮膚的真皮層之后遞送至毛細血管中，即，為了防止組合物在真皮層上短暫保留后立即進入真皮層。

如上所述，參考藥物組合物和化妝品組合物，對通過前述解釋的毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基的功能進行了解釋。然而，對于本發明所屬領域的普通技術人員來說顯而易見的是，本發明涉及用于預防脫發和促進毛發生長的各種形式的組合物以及使用具有各種應用的組合物的方法，所述組合物含有通過毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基作為活性成分。

實施例

在下文中，將參照所附的示例性實施方式對本發明進行詳細描述。這些實施方式僅出于說明目的而公開，并且對于本領域技術人員來說應當顯而易見的是它們不應被解釋為限制本發明的范圍。

盡管本發明人使用了臍帶血來源的干細胞和TGF-β，但是對于本領域技術人員顯而易見的是，也可以使用其它來源的干細胞和其它毛發退行期誘導物(Current Biology，19，R132-R142，2009年2月10日；J Invest Dermatol，124：675-685，2005年)。

材料和方法

1.干細胞的條件培養基的制備

(1)干細胞的分離和培養

在本發明中，使用通過Medipost Co.,Ltd.(韓國)提供的人臍帶血來源的間充質干細胞。可以從收集臍帶血的步驟和從臍帶血分離間充質干細胞并進行培養的步驟獲得所述細胞。下面將對各個步驟的細節進行描述。

在收集臍帶血的步驟中，在正常的自然陰道分娩(NSVD)的情況下，在嬰兒分娩之后，從排出的臍帶靜脈中收集臍帶血，而胎盤仍保留在子宮中；或者在剖宮產的情況下，在嬰兒分娩后胎盤也從子宮中排出的狀態下，從臍帶靜脈中收集臍帶血。

在本發明中，當從分娩后自子宮排出的臍帶靜脈中收集臍帶血時，在新生兒誕生之后，通過無菌操作從與胎盤和胎兒相連接的臍帶靜脈中收集臍帶血。一旦獲得臍帶靜脈，使用收集針將臍帶血收集到含有抗凝血劑的臍帶血收集袋(儲袋)中。

關于從由此收集的臍帶血中分離干細胞并進行培養的方法，可以使用包括韓國專利號10-0494265中公開的方法在內的任何常規方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)。

本發明人通過離心從由此收集的臍帶血中分離出單核細胞，漂洗數次以除去雜質，并將單核細胞以適當的濃度接種在培養容器中并進行培養。本文中，當在相差顯微鏡下觀察時，確認以具有長的均勻的紡錘體形狀的集落形式增殖的細胞為間充質干細胞。然后當細胞生長至融合時，將細胞進行傳代培養和增殖直至獲得適當數量的細胞。

另外，將來源于骨髓(LONZA，USA)和脂肪細胞(ATCC，USA)的間充質干細胞(MSC)進行培養，并用于進一步的實驗。下文中將該細胞分別描述為BM-MSC和AD-MSC。

(2)樣品條件培養基的制備

分別從hUCB-MSC、AD-MSC和BM-MSC制備樣品條件培養基。在保持于37℃和5％CO₂下的培養箱中，將儲存的細胞(儲存在LN2槽中)解凍并進行培養，特別地，將細胞在含有2％FBS的α-MEM(GIBCO)培養基中進行培養，直至細胞融合達到約90％。

然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細胞洗滌3次，在不添加酚紅的角質形成細胞培養基(KM)中培養24小時，收集培養基，并將整個過程重復3天。然后，將收集的培養基分別過濾(Top Filer System，Nunc)并冷藏保存及冷凍待用。

(3)經刺激的CM的制備

CM制備方法與前述方法幾乎相同，但當對來源于骨髓、臍帶血和脂肪的干細胞進行培養時，將所述細胞在不含酚紅的培養基中用TGF-β(10ng/ml)進行處理，并將干細胞刺激24小時。

用PBS對用TGF-β處理的培養基漂洗3次，并用不含酚紅的新鮮K-SFM培養基替換，重復所述24小時培養至3天并收集。將由此收集的用TGF-β處理的條件培養基分別過濾，并用于實驗用途，在不含酚紅的K-SFM培養基中稀釋至待使用的10％、25％和50％的終濃度。

2.用于觀察毛發生長的C3H小鼠的制備

實驗地點為Medipost(IRB批準編號：131021-1)和Gyeongi Biocenter(IACUC項目編號：IACUC2014-4-10)，C3H小鼠購自Saeronbio Inc.(韓國)，并在Jackson實驗室制備。

特別地，在本發明的實驗中使用的C3H小鼠(Jackson lab，日本)當它們的毛發被除去時開始休止期。不同于其它物種，C3H小鼠需要極長的時間才能轉變至生長期，因此將它們用作用于研究毛發生長作用的動物模型。也就是說，不同于其它小鼠物種，在不用誘導物藥物進行處理時，它們具有非常長的休止期，因此它們是用于確認毛發生長作用的出色的動物模型(Journal of Investigative Dermatology(2005)124，288-289)。

在作為毛發生長的一個時期的生長期期間，C3H小鼠皮膚表面的顏色變成黑色，而在退行期期間，它們的皮膚表面變成粉紅色，因此可以通過觀察它們的皮膚顏色來確認毛發生長的時期。

本發明人獲得了7周齡C3H小鼠，并使它們能夠通過1周的適應期來適應新環境。此外，本發明人用來源于臍帶血的間充質干細胞的條件培養基對小鼠進行接種，以觀察毛發生長周期的休止期(退行期)和進入生長期的轉變時間。在該實例中，將用PBS注射的小鼠用作陰性對照。

同時，對小鼠進行麻醉以除去毛發。通過將3.36ml甲苯噻嗪(Bayer Korea Ltd.，2094L，韓國)與5ml舒泰(zoletil)(條形碼#3UHC，韓國)混合并加入7.47ml鹽水(JW-Pharma，REG#10055，韓國)來制備量為15.83ml的麻醉劑，并使用胰島素注射器(BD Ultra-Fine^TM II，韓國)用20μl所述麻醉劑對小鼠進行麻醉。

然后，在確認小鼠被麻醉后，使用毛發修剪器除去小鼠的毛發。將小鼠置于干凈的紙上，以與毛發生長方向相反的方向進行首次毛發去除，將小鼠放置24小時，觀察任何剩余毛發的存在，然后將剩余毛發除去。

3.本發明的干細胞的條件培養基的局部施用

作為局部方法，將本發明的條件培養基以100μl的量以12小時的間隔施用于小鼠皮膚的外層上，并以相同方向擦洗8次，從而使它們可以被涂抹至皮膚中，同時注意不要污染鄰近區域。在4個點處以100μl的量施用條件培養基，并通過裸眼每天觀察毛發生長量、毛發厚度和局部顏色等。

4.MTT分析

為了測試細胞的增殖和毒性，在保持于37℃、5％CO₂下的培養箱中，將細胞在各自的培養基中培養24小時，置于饑餓下24小時，并在各自的實驗條件下培養24小時、48小時、72小時和96小時。

此外，使所完成的各自的實驗組通過MTT分析接受關于細胞毒性和細胞增殖使率的測定。實驗重復至少3次以確保實驗的可靠性。

用5mg/ml MTT試劑對各相應的實驗組(其以用于建立MTT分析實驗方法的培養而完成)進行處理至終濃度為1mg/ml，再培養另外的4個小時。然后，棄去上清液，將所得物溶解在DMSO中，將所得到的溶液以200μl/孔的量轉移至96孔板中，通過ELISA讀數器對570nm處的吸光度進行測量。

5.作為原始細胞的原始hDPC和原始ORS的分離

在鹽水中準備枕骨區的尸檢組織，并使用刀片將其分割成單個毛囊單位，以切割毛球，并去除毛干。將兩個注射器中的一個固定在毛球的下部(DP的下部)，而將另一注射器用于輕微接觸毛球的上部(DP的上部)，從而使真皮乳頭(DP)可以出來。

將真皮乳頭細胞放置在注射器的末端，并將混合物(DMEM+20％FBS+1％抗生素+1％兩性霉素B)和約10個真皮乳頭細胞加入至35mm的I型膠原涂布培養皿中，并當以不足的量添加而不更換培養基時培養10天。在確認真皮乳頭細胞粘附至培養皿后，3天更換一次培養基，當達到細胞融合時或當其變為第4周時進行傳代培養，以供使用。

6.斑片(patch)分析法

當C57BL/6小鼠出生時，將它們的皮膚剝離，洗掉血跡，用聚乙烯吡啶酮滅菌，并再次用鹽水洗滌以除去聚乙烯吡啶酮。

在從剝離的皮膚中除去脂肪層后，用膠原/分散酶對小鼠進行處理，并在4℃下培養過夜。使用鉗狀骨針(forcep)將真皮和表皮分離，渦旋15分鐘，用過濾器篩分組織，并通過離心進行分離(細胞下沉)。對細胞數進行計數，分開為1×10⁶個細胞，分別添加100μl培養基，并重懸浮以釋放細胞。使用胰島素注射器以在裸鼠背部上的4個部分進行皮下注射。注射2周后，對皮膚進行解剖，并確認內部形成的毛囊數。

7.初始毛發器官的培養

通過在枕骨區進行解剖來收集毛發器官，并在鹽水中制備，以毛囊單位進行修剪，并切割皮脂腺正下方的點。3天更換一次培養基，并對長度進行測量。

實施例1：經TGF-β激活的干細胞培養基的毛發生長作用的確認

由于在增殖和真皮乳頭(DP)的形成期間可能起始毛發生長，通過觀察經hUCB-MSC-CM增加DP生長的特征來檢查毛發生長的可能性。

對通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基和未刺激的條件培養基針對毛發生長的作用進行評價，從而使條件培養基的終濃度變成10％、25％和50％，并將它們用于體內和離體實驗。

1-1體外實驗

使用原始人真皮乳頭細胞(DPC)通過體外實驗對條件培養基的作用進行檢查。

首先，為了測試細胞的增殖和毒性，在保持于37℃、5％CO₂下的培養箱中，將細胞在各自的培養基中培養24小時，置于饑餓下24小時，并在各自的實驗條件下培養24小時、48小時、72小時和96小時，并通過MTT分析對細胞的增殖和毒性進行測量。

結果，如圖1所示，通過TGF-β刺激的臍帶血來源的干細胞的條件培養基顯示出最高的細胞存活率。

此外，還對AD-MSC和BM-MSC的增殖進行了測量(圖1和表1)。

[表1]

由這些結果，我們可以確認通過TGF-β刺激的干細胞比起未經刺激的培養基具有更優秀的增殖。

1-2蛋白免疫印跡

同時，為了確認與通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基進行的毛發組織分化相關的信號轉導系統，用條件培養基候選物對hDPC進行處理，并通過蛋白免疫印跡確認與毛發組織分化相關的蛋白質水平，結果示于圖2中。

結果，通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基顯示出Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1等(已知為毛發組織分化相關的信號轉導蛋白)的高表達。這些結果表明，本發明的TGF-β對與毛發組織分化相關的干細胞具有作用。

也就是說，通過TGF-β刺激的本發明的臍帶血來源的干細胞有效地分泌了Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1等(其為與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白)，因此，根據毛發生長，含有該干細胞的條件培養基顯示出最優異的毛發生長作用(圖2)。

1-3離體實驗

本發明人還通過培養原始毛發器官進行了針對毛發生長作用的離體實驗。

為這一目的，作為能夠觀察毛發生長可能性的離體模型，制備了來自從人頭皮組織收集的毛囊的人原始真皮乳頭(DP)，并在實驗培養板中進行培養。通過觀察，對就處理物質而言的DP長度生長的促進作用進行比較。也就是說，通過對實驗組和對照組進行處理，觀察原始DP長度的生長，并選擇有效的CM，或通過觀察比較CM對毛發生長的作用。

結果如圖3所示，與未處理的對照組相比，未經刺激的CM和用TGF-β刺激的CM均誘導了毛發增殖，特別地，通過TGF-β刺激的CM顯示出比未經刺激的CM更高的毛發生長作用(圖3A)。

此外，在毛囊生長長度的四重復實驗中，與未經刺激的條件培養基相比，通過TGF-β刺激的條件培養基顯示出更高的毛囊平均生長長度(圖3B)。

實施例2：斑片分析法

通過斑片分析模型對基于臍帶干細胞引發的條件培養基針對毛囊形成的作用進行檢查。

作為經由斑片分析模型進行的離體實驗的結果，與對照培養基或用未經刺激的條件培養基處理的組相比，通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基顯示出顯著更高的形成原始毛囊的作用。特別地，通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基在形成原始毛囊方面顯示出最高的數量(圖4A)。

此外，在通過立體顯微鏡進行的觀察中，與對照培養基或用未經刺激的條件培養基處理的組相比，通過TGF-β刺激的條件培養基顯示出顯著更高的形成原始毛囊的作用(圖4B)。

實施例3：針對小鼠的局部施用

通過將本發明的條件培養基局部施用于處于休止期的C3H/HeJ小鼠上對毛發生長作用進行評價。

為了對預防脫發和促進毛發生長的作用進行評價，使用通過各種因子刺激的條件培養基對動物實驗進行比較和評價。將條件培養基施用至各小鼠的背部上的四處位置，每天施用兩次，并且在約3周時對毛發生長特征進行檢查。

結果，與對照培養基或用未經刺激的條件培養基處理的組相比，確認了通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基顯示出更高的毛發生長作用，其中，甚至與已報道的研究結果相比，通過TGF-β刺激的干細胞的條件培養基在毛發生長的各個領域(例如毛發生長速度、毛發生長量和毛發厚度等)均顯示出最優異的作用(圖5)。

此外，在用AD-MSC和BM-MSC對CM和通過TGF-β刺激的CM進行約28天后，對C3H/HeJ小鼠的毛發生長特征進行檢查，在其中局部施用通過TGF-β刺激的CM的小鼠也顯示出優異的毛發生長作用(圖6)。

因此，經由體內模型可以確認通過TGF-β刺激的本發明的干細胞的條件培養基的毛發生長作用在毛發生長速率、量和厚度等方面均非常優異。

從這些結果確認了用已知為脫發誘導材料的TGF-β對臍帶血來源的干細胞進行處理，可以出乎預料地分泌對毛發生長有效的蛋白質。

特別地，本發明的用TGF-β刺激的臍帶血來源的間充質干細胞的條件培養基顯示出遠比現有的基于干細胞的物質更優異的毛發生長作用，并因此預期其非常有用地用于預防脫發和促進毛發生長。

工業實用性

通過包括TGF-β的毛發退行期誘導物刺激的干細胞的條件培養基含有已知為與毛發組織分化相關的信號轉導蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細胞周期蛋白D-1等。因此，干細胞的條件培養基縮短了毛發周期中的從休止期至生長期的轉變時間，促進了真皮乳頭細胞的長度增長、增加了毛囊的數量和大小以及頭皮的厚度，從而表現出優異的預防脫發和促進毛發生長作用，并因此預期在可以利用該培養基的領域中非常有用。