一種細胞培養基和培養羊膜間充質干細胞的方法與流程

本發明屬于干細胞
技術領域：
，具體涉及一種細胞培養基和培養羊膜間充質干細胞的方法。
背景技術：
：干細胞是一類具有自我復制能力和分化能力的多潛能細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界將其稱之為“萬用細胞”。近年來，隨著相關研究的不斷深入，干細胞的應用范圍也逐漸擴大，并日趨成熟，應用于保健及心血管、骨科等疾病的治療。干細胞在保健及再生醫學等領域的研究中具有廣闊的應用前景，但依然面臨著許多挑戰，細胞的來源就是其中之一，而細胞來源最關鍵的是干細胞的分離和培養。目前，人羊膜間充質干細胞(humanamnionmesenchymalstemcells，hAMSCs)的分離培養主要集中于原代分離的得率和原代細胞的指標檢測，但對于后續的體外培養方法研究的較少。忽略了后續的培養條件和方法會對細胞狀態造成的不利影響。技術實現要素：有鑒于此，本發明的目的在于提供一種細胞培養基和培養羊膜間充質干細胞的方法，用于解決羊膜間充質干細胞體外培養時細胞形態不規則、純度低等問題。本發明對培養基的配方以及細胞接種密度的對干細胞的生長及其純度進行了探究，最終確定了一個比較適合羊膜間充質干細胞體外培養的培養基配方和細胞接種密度，其具體技術方案如下：本發明提供了一種細胞培養基，包括：表皮生長因子、谷氨酰胺、非必須氨基酸、胎牛血清和基礎培養基。優選的，每100mL基礎培養基中包含：表皮生長因子0-1mL、谷氨酰胺1mL、非必須氨基酸1mL和胎牛血清8-10mL。優選的，所述谷氨酰胺的工作濃度為200mM。優選的，所述表皮生長因子的工作濃度為1μg/mL。優選的，所述基礎培養基為DMEM/F12培養基。本發明還提供了一種培養羊膜間充質干細胞的方法，具體為：采用上述培養基重懸羊膜間充質干細胞，然后接種于培養容器中進行傳代培養。優選的，所述接種的細胞密度為6.5×104-9×104個/mL。本發明提供了一種細胞培養基和培養羊膜間充質干細胞的方法，培養基中包含表皮生長因子、谷氨酰胺、非必須氨基酸和胎牛血清，各組分配伍合理，協同增效，共同促進細胞增殖以及維持良好細胞生長形態；將本發明所提供的一種細胞培養基應用于體外培養羊膜間充質干細胞的過程中，通過調整細胞接種密度和培養基中EGF的含量，促進了細胞增殖，并在更短的時間內得到指標合格的羊膜間充質干細胞，解決了羊膜間充質干細胞體外培養時細胞形態不規則、純度低等問題，促進細胞增殖，維持間充質干細胞的干性。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據提供的附圖獲得其他的附圖。圖1為實施例2的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞放大100倍的光學顯微照片；圖2為實施例3的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞放大100倍的光學顯微照片；圖3為實施例4的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞放大100倍的光學顯微照片；圖4為實施例5的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞放大100倍的光學顯微照片；圖5為實施例6的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞放大100倍的光學顯微照片；圖6為實施例2的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞的部分免疫表型鑒定結果；圖7為實施例3的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞的部分免疫表型鑒定結果；圖8為實施例4的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞的部分免疫表型鑒定結果；圖9為實施例5的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞的部分免疫表型鑒定結果；圖10為實施例6的培養基培養得到的P3代羊膜間充質干細胞的部分免疫表型鑒定結果。具體實施方式下面將結合本發明具體實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領域技術人員應當理解，對本發明的具體實施例進行修改或者對部分技術特征進行同等替換，而不脫離本發明技術方案的精神，均應涵蓋在本發明保護的范圍中。以下實施例中所使用的表皮生長因子(EGF)購自SIGMA，谷氨酰胺、非必須氨基酸(NEAA)、胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養基購自GIBCO。實施例1羊膜間充質干細胞的提取分離在無菌條件下，取產后棄置的新鮮羊膜，剝離羊膜，用細胞清洗液沖洗干凈，將羊膜組織剪成大小合適的組織碎片，加入3-5倍體積的0.25％胰酶，置于200r/min37℃恒溫振蕩器上進行消化15min；然后轉移至儲液瓶中，加入20mL的0.1％I型膠原酶，在37℃下進行酶解3h；再用PBS緩沖溶液稀釋消化后的組織液，離心，棄掉上清，用PBS緩沖溶液重懸沉淀，采用100μm過濾篩網過濾，濾液1500r/min，離心5min，獲得羊膜間充質干細胞。采用DMEM/F12培養基重懸得到的間充質干細胞，然后接種于培養皿中，轉移至5％CO2、37℃、飽和濕度為95％的CO2培養箱中培養，培養至72h后換液。實施例21、配制一種羊膜間充質干細胞培養基，其配方如下：1μg/mL表皮生長因子(EGF)：1mL；200mM谷氨酰胺：1mL；非必須氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培養基：100mL。以DMEM/F12培養基作為基礎培養基，然后往基礎培養基中分別添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混勻，即可配制得到該細胞培養基。2、待原代羊膜間充質干細胞生長至80％融合時，加入0.25％Trypsin進行消化，離心，然后采用上述配制的細胞培養基進行重懸細胞，再按4×104個/mL的細胞密度接種于培養皿中進行傳代培養。實施例31、配制一種羊膜間充質干細胞培養基，其配方如下：200mM谷氨酰胺：1mL；非必須氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培養基：100mL。以DMEM/F12培養基作為基礎培養基，然后往基礎培養基中分別添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混勻，即可配制得到該細胞培養基。2、待原代羊膜間充質干細胞生長至80％融合時，加入0.25％的Trypsin進行消化，離心，然后采用上述配制的細胞培養基進行重懸細胞，再按7.5×104個/mL的細胞密度接種于培養皿中進行傳代培養。實施例41、配制一種羊膜間充質干細胞培養基，其配方如下：1μg/mL表皮生長因子(EGF)：1mL；200mM谷氨酰胺：1mL；非必須氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培養基：100mL。以DMEM/F12培養基作為基礎培養基，然后往基礎培養基中分別添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混勻，即可配制得到該細胞培養基。2、待原代羊膜間充質干細胞生長至80％融合時，加入0.25％的Trypsin進行消化，離心，然后采用上述配制的細胞培養基進行重懸細胞，再按7.5×104個/mL的細胞密度接種于培養皿中進行傳代培養。實施例51、配制一種羊膜間充質干細胞培養基，其配方如下：1μg/mL表皮生長因子(EGF)：1mL；200mM谷氨酰胺：1mL；非必須氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：8mL；DMEM/F12培養基：100mL。以DMEM/F12培養基作為基礎培養基，然后往基礎培養基中分別添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混勻，即可配制得到該細胞培養基。2、待原代羊膜間充質干細胞生長至80％融合時，加入0.25％的Trypsin進行消化，離心，然后采用上述配制的細胞培養基進行重懸細胞，再按7.5×104個/mL的細胞密度接種于培養皿中進行傳代培養。實施例61、配制一種羊膜間充質干細胞培養基，其配方如下：200mM谷氨酰胺：1mL；非必須氨基酸(NEAA)：1mL；胎牛血清(FBS)：10mL；DMEM/F12培養基：100mL。以DMEM/F12培養基作為基礎培養基，然后往基礎培養基中分別添加上述含量的EGF、谷氨酰胺、NEAA、FBS，混勻，即可配制得到該細胞培養基。2、待原代羊膜間充質干細胞生長至80％融合時，加入0.25％的Trypsin進行消化，離心，然后采用上述配制的細胞培養基進行重懸細胞，再按1.25×105個/mL的細胞密度接種于培養皿中進行傳代培養。實施例7細胞指標的檢測分別記錄實施例2-6中細胞生長匯合度達90％時所需要的時間以及收集P3代羊膜間充質干細胞進行細胞指標的檢測，其中，觀察指標分別為：形態觀察、細胞存活率和細胞免疫表型。表1為細胞匯合度達90％所需生長天數，如表1結果所示，發現所需天數為3-6天，其中實施例4-5僅需要3.5天，說明了本發明方法有效促進了羊膜間充質干細胞的生長。表1細胞生長至匯合度達90％所需生長天數分組匯合度達到90％所需時間(天)實施例26實施例35實施例43.5實施例53.5實施例63圖1至圖5分別為實施例2至實施例6培養得到的羊膜間充質干細胞放大100倍的光學顯微照片，如圖所示，本發明方法培養得到的細胞形態規則，個體大小均勻。通過對實施例2-7培養條件下的羊膜間充質干細胞進行細胞計數，計算其細胞活率，發現各實施例的細胞存活率無顯著性差異，均在90％以上，說明本發明方法均能有效促進羊膜間充質干細胞的生長。在本發明的具體實施例2-7中，分別對細胞接種密度和培養基中的FBS含量進行了篩選，然后對培養得到的羊膜間充質干細胞采用流式細胞儀采用流式檢測其細胞免疫表型，結果圖6-10和表2所示，發現實施例4-5的流式合格率較為集中，說明本發明方法通過調整細胞接種密度和培養基中EGF的含量，可以在更短的時間內得到指標合格的羊膜間充質干細胞，細胞接種密度是影響羊膜間充質干細胞增殖的重要因素。其中，所述流式合格是指CD73+≥95％，CD90+≥95％，CD105+≥95％、HLA-DR+≤2％、CD45+≤2％、CD34+≤2％、CD11b+≤2％、CD19+≤2％。表2流式檢測結果組別流式實施例2不合格(CD105表達偏低，HLA-DR表達偏高)實施例3合格實施例4合格實施例5合格實施例6不合格(CD105表達偏低，HLA-DR表達偏高)當前第1頁1 2 3