具有腦靶向功能的多肽分子及其制備方法和應用與流程

本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其是涉及一種具有腦靶向功能的多肽分子及其制備方法和應用。

背景技術：

目前，腦部相關疾病的發病率正呈現逐年上升的趨勢，其中，腦瘤及腦轉移瘤、缺血性腦損傷以及各類病毒炎癥相關疾病的上升趨勢尤其明顯。

在對腦部相關疾病的治療方面，血腦屏障被認為是阻止化療藥物進入腦組織進而影響療效的主要原因。血腦屏障是指腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，是機體參與固有免疫的內部屏障之一，由介于血循環與腦實質間的軟腦膜、脈絡叢的腦毛細血管壁和包于壁外的膠質膜所組成，能阻擋病原生物和其他大分子物質由血循環進入腦組織和腦室。這種結構可使腦組織少受甚至不受循環血液中有害物質的損害，從而保持腦組織內環境的基本穩定，對維持中樞神經系統正常生理狀態具有重要的生物學意義。然而，正因如此，基本上100％的大分子藥物，包括多肽、重組蛋白、單克隆抗體、基于RNA干擾技術的藥物、基因治療相關藥物等都無法穿越血腦屏障，且大于98％的小分子藥物也無法穿過血腦屏障。因此，血腦屏障在阻擋有害物質的同時，也對應用藥物對腦部相關疾病的治療產生了巨大的障礙。

肽是α－氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，通常由三個或三個以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物都可以成為叫多肽。多肽也是蛋白質水解的中間產物。由于其具有極性末端和非極性末端，因此在體內有較高的利用度。由于多肽本身為內源性物質，所以毒性小，但是多肽直接作為藥物依然在很多方面受到較大的限制，例如，多肽易氧化，且多肽中的肽鍵易水解斷裂，導致其穩定性差，不能口服。近年來，多肽作為藥物輔助功能的應用逐漸成為了新藥研制的熱點之一。細胞穿膜肽是20世紀中期開始認識到的一類具特殊功能的多肽分子，它們通常由5～30個氨基酸組成，典型的一般由8～16個氨基酸構成，具有生物膜穿透功能，還可攜帶其它分子甚至超分子顆粒進入細胞中。正是因為這種特殊的功能，它們被看作生物活性分子有效的細胞內轉運工具，具有廣泛的應用前景。因此，近些年來多肽和藥物通過共價方式形成組合物的例子越來越多，例如：多肽Penetratin和阿霉素共價耦合用于治療乳腺癌；多肽TAT和藥物P53共價耦合用于治療眼癌轉移；多肽YTA4與甲氨蝶呤共價耦合治療乳腺癌。但是，目前對于能夠有效穿過血腦屏障并可作為釋藥載體，而對腦部相關疾病進行治療的多肽研究并不確切。

因此，開發一種能夠有效穿過血腦屏障，并通過化學合成的方法與多種能夠治療腦部相關疾病的藥物進行偶聯而作為釋藥載體，而達到藥物腦靶向釋放的目的多肽分子尤為重要。

有鑒于此，特提出本發明。

技術實現要素：

本發明的一個目的在于提供一種具有腦靶向功能的多肽分子，以克服現有技術中存在的大分子無法穿越血腦屏障的技術問題。

本發明的第二個目的在于提供一種具有腦靶向功能的多肽分子的制備方法。

本發明的第三個目的在于提供一種具有腦靶向功能的多肽分子作為釋藥載體的應用，以克服現有技術中存在的多肽直接作為藥物穩定性差，且治療腦部相關疾病的藥物不能夠完全達到腦靶向釋放的技術問題。

本發明提供的一種具有腦靶向功能的多肽分子，所述多肽分子由4個氨基酸或者所述4個氨基酸的重復序列組成，所述多肽分子的氨基酸序列為：(CXQK)_n，其中，X為氨基酸，n為正整數。

進一步地，所述X為丙氨酸A。

進一步地，所述X為甘氨酸G。

進一步地，所述n的值為1、2、3、4或5。

進一步地，本發明還提供一種制備上述多肽分子的方法，采用液相合成或固相合成的方法。

進一步地，本發明還提供一種上述的具有腦靶向功能的多肽分子作為釋藥載體的應用。

進一步地，所述應用為將所述多肽分子與抗腫瘤藥物，通過酸酐類化合物橋接為偶聯物。

進一步地，所述應用為將所述多肽分子與治療缺血性腦損傷的藥物，通過酸酐類化合物橋接為偶聯物。

進一步地，所述應用為將所述多肽分子與納米銀，通過酸酐類化合物橋接為偶聯物。

進一步地，所述應用為將所述多肽分子與小分子多肽藥物，通過酰胺鍵連接為偶聯物。

本發明通過液相合成或固相合成的方法合成的一種具有腦靶向功能的多肽分子，能夠穿過血腦屏障，且由于多肽分子不具有免疫原性，可避免引起人體不良免疫反應；本發明提供的多肽分子還可作為釋藥載體與治療腦部疾病的相關藥物偶聯為偶聯物，使治療腦部相關疾病的藥物能夠通過血腦屏障直接作用于患處，能夠有效提升腦部相關疾病的治愈率和治愈速度。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1a為本發明納米銀－多肽偶聯物穿越血腦屏障體內評價實驗中實驗組的結果圖；

圖1b為本發明納米銀－多肽偶聯物穿越血腦屏障體內評價實驗中對照組的結果圖。

具體實施方式

下面將結合附圖對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明提供了一種具有腦靶向功能的多肽分子，該多肽分子由4個氨基酸或者所述4個氨基酸的重復序列組成，氨基酸的序列為：

CAQK(SEQ ID NO 1)或

CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)或

CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)或

CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)或

CGQK(SEQ ID NO 5)或

CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)或

CGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 7)或

CGQKCGQKCGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 8)。

上述多肽分子本身不具有生理活性，但是具有透過血腦屏障的作用，此外，本發明還涉及該多肽分子的制備方法及其作為釋藥載體的應用。

本發明提供的具有腦靶向功能的多肽分子采用液相合成或固相合成兩種方式實現。

本發明提供的液相合成多肽的方法為：

選用的氨基酸為：H－Cys(Trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、H－Lys(Boc)－Ome；

選用的縮合劑為：HOAT(1－羥基－7－偶氮苯并三氮唑)或HOBT(1－羥基苯并三氮唑)或HOCT(1－羥基－1H－1，2，3－三唑－4－羧酸乙酯)或DIC(N，N＇－二異丙基碳二亞胺)；

選用的溶劑為：DCM(二氯甲烷)；

選用的縮合堿為：DIEA(N，N－二異丙基乙胺)或者DMAP(4－二甲氨基吡啶)；

選用的脫保護試劑為：哌啶；

C末端按照H－Lys(Boc)－Ome、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Gly－OH、H－Cys(Trt)－OH的順序進行縮合反應，氨基酸比例為1：1，從C末端到N末端依次偶聯，縮合劑與氨基酸的比例1：1－1：1.2，縮合劑與縮合堿比例為1：2，使多肽分子在合成的過程中依次從C末端向N末端延伸。

本發明提供的固相合成多肽的方法為：

選用的固相樹脂為：wang樹脂、2－cl－trt樹脂，樹脂替代度0.4－0.8；

選用的保護氨基酸為：Fmoc－Lys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH；

選用的脫保護試劑為：哌啶，哌啶在所使用溶液中的濃度為15％－50％；在一個優選的實施方式中，哌啶在所使用溶液中的濃度為20％；

選用的偶聯試劑為：

HATU(2－(7－氧化苯并三氮唑)－N，N，N＇，N＇－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、HBTU(O－苯并三氮唑－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、HCTU(6－氯苯并三氮唑－1，1，3，3－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、DIC/HOBT/DIEA(DMAP)，其中DIEA可由DMAP替代；

選用的切割試劑為：TFA(三氟乙酸)/TIS(三異丙基硅烷)/H₂O，比例為：95：2.5：2.5；

選用HPLC純化粗肽。

本發明提供的具有腦靶向功能的多肽分子可作為釋藥載體，如：將本發明提供的多肽分子通過酸酐類化合物與抗腫瘤藥物橋接為偶聯物；將本發明提供的多肽分子通過酸酐類化合物與治療缺血性腦損傷的藥物橋接為偶聯物；將本發明提供的多肽分子通過酸酐類化合物與納米銀橋接為偶聯物；將本發明提供的多肽分子通過酰胺鍵與小分子多肽藥物連接為偶聯物。

酸酐類化合物為丁二酸酐，戊二酸酐或馬來酸酐。

以本發明提供的多肽分子為釋藥載體，使治療腦部相關疾病的藥物能夠通過血腦屏障直接作用于患處，能夠有效提升腦部相關疾病的治愈率和治愈速度。

為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例對本發明做進一步的說明。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護范圍。實施例中所使用的氨基酸均購自上海吉爾公司，實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

實施例1

液相合成CGQK(SEQ ID NO 5)

合成所用試劑選擇：

(1)氨基酸：H－Cys(Trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、H－Lys(Boc)－Ome；

(2)縮合劑：DIC或者HOBT；

(3)溶劑：DCM；

(4)縮合堿：DMAP；

(5)脫保護試劑：哌啶；

(6)切割液：TFA/TIS/H₂O，比例為：95：2.5：2.5；

反應在圓底燒瓶中進行，用磁子攪拌，第一步反應：

將H－Lys(Boc)－Ome、Fmoc－Gln－OH，縮合劑、縮合堿按照1：1：1：1的比例同時加入到燒瓶中攪拌，控溫在25℃下反應4小時，加入脫保護劑至濃度為20％，反應30分鐘，旋蒸除去反應溶液，加入溶劑DCM進行下一步反應：將Fmoc－Gly－OH、縮合劑、縮合堿按照1：1：1的比例加入燒瓶中，控溫在25℃下反應4小時，旋蒸除去反應溶液后，再將H－Cys(Trt)－OH、縮合堿按照1：1的比例，和DCM加入到燒瓶中，控溫在25℃下反應4小時后旋蒸，加入切割液，攪拌2小時，旋蒸去除切割液，HPLC純化，純化條件：梯度液相，流動相A：1％TFA/乙腈；流動相B：1％TFA/H₂O，20min從10％流動相A到60％流動相B。

實施例2

固相合成CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用SyroII公司生產的Biotage型儀器進行CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)的合成。操作方法按照生產商的儀器說明書進行。

合成所用試劑選擇：

(1)固相樹脂：2－cl－trt樹脂，樹脂替代度0.75；

(2)保護氨基酸：Fmoc－Cys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH；

(3)脫保護試劑：哌啶，哌啶在所使用溶液中的濃度為15％－50％；在一個優選的實施方式中，哌啶在所使用溶液中的濃度為20％；

(4)偶聯試劑：HATU/HOBT/DIEA，比例為1：1：2

(5)切割試劑：TFA/TIS/H₂O，比例為：95：2.5：2.5；

選用HPLC純化粗肽。純化條件：梯度液相，流動相A：1％TFA/乙腈；流動相B：1％TFA/H2O，20min從10％流動相A到60％流動相B。利用MS確定所得純品分子量，用HPLC確定樣品純度，純度大于95％經脫鹽及冷凍干燥得到CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQIDNO 4)多肽分子凍干粉。

實施例3

固相合成CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用SyroII公司生產的Biotage型儀器進行CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)的合成。操作方法按照生產商的儀器說明書進行。

合成所用試劑選擇：

(1)載體樹脂：Fmoc－Lys－wang－rink，替代度：0.8

(2)保護氨基酸：Fmoc－Cys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH，反應中所用保護氨基酸5倍過量。

(3)脫保護試劑：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例為20：80。

(4)偶聯試劑：DIC/HOBT，比例為1：1.5。

(5)切割試劑：TFA/TIS/水，比例為：95：2.5：2.5。

將制得的多肽使用HPLCC18半制備柱進行純化，檢測條件為：檢測波長：214nm，流動相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流動相B：水(含0.1％三氟乙酸)，洗脫條件：30分鐘內由35％A－50％A，利用MS確定所得純品分子量，用HPLC確定樣品純度，純度大于95％經脫鹽及冷凍干燥得到CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)多肽分子凍干粉。

實施例4

本發明提供的多肽分子CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)與抗腫瘤藥物紫杉醇的偶聯方法

50mL反應瓶中加入1.50g(1.72mmol)紫杉醇，0.52g(5.20mmol)丁二酸酐，30mLTHF(四氫呋喃)，滴加0.66g(5.12mmol)DIEA，27℃攪拌6h，蒸干溶劑得蠟狀物，加水攪拌，有黃色固體析出，抽濾，水洗兩次，干燥，得黃色固體1.15g，所得黃色固體為紫杉醇－丁二酸酐偶聯物。

50mL反應瓶中加入0.22g(0.32mmol)紫杉醇－丁二酸酐偶聯物，0.10g(0.31mmol)O－苯并三氮唑－N，N，N＇，N＇－四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，5mLDMF，氮氣保護，滴加0.08g(0.62mmol)DIEA，27℃攪拌1h后，加入0.10g多肽，27℃攪拌3h后，終止反應。使用MS－IT－TOF確定分子量，使用HPLC純化粗產物，既得多肽分子與抗腫瘤藥物紫杉醇的偶聯物。

實施例5

本發明提供的多肽分子CAQK(SEQ ID NO 1)與治療缺血性腦損傷藥物洛伐他汀的偶聯方法

在本實施例中，CAQK(SEQ ID NO 1)采用固相合成的方法，載體樹脂選用Fmoc－Lys(Mtt)－wang，替代度為0.8，保護氨基酸選用Fmoc－Cys(trt)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH，本實施例所使用的脫保護試劑為：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例為20：80，本實施例所使用的偶聯試劑為：DIC/HOBT，比例為1：1.5。在本實施例中，固相合成CAQK(SEQ ID NO 1)后，先不進行整體切割，利用1％1TFA/DCM先切割Lys(Mtt)的側鏈Mtt，利用丁二酸酐與Lys暴露的氨基進行耦合，DCM洗滌5次后，使用HATU/HOBT與洛伐他汀偶聯，偶聯之后進行切割，所使用的切割試劑為：TFA/TIS/水，比例為：95：2.5：2.5。

實施例6

本發明提供的多肽分子與納米銀的偶聯方法

取6.1mg鞣酸和1g檸檬酸三鈉溶于50ml水中制備為緩沖液，待用。

取252mg AgNO₃粉末，溶解于2.5L水中，60℃下攪拌加熱，然后加入上述待用的緩沖液50mL。加熱至沸騰，并保持沸騰狀態20分鐘，制成納米銀溶液。

在本發明提供的多肽分子CAQK(SEQ ID NO 1)或CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)或CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)或CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)或CGQK(SEQ ID NO 5)或CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)或CGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 7)或CGQKCGQKCGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 8)的氨基上形成馬來酸酐修飾，利用賴氨酸側鏈與馬來酸酐直接耦合，比例為多肽：馬來酸酐：DIEA＝1：1：1，然后與納米銀進行反應，納米銀與多肽直接混合。反應物在UV－400nm下進行收集，得到納米銀－多肽偶聯物。

實施例7

本發明提供的多肽分子CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)與小分子多肽藥物胸腺五肽偶聯物的制備方法

在本實施例中，載體樹脂選用Fmoc－Lys(Trtt)－wang，替代度為0.65，所選用的保護氨基酸為Fmoc－Cys(trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Trtt)，本實施例所使用的脫保護試劑為：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例為20：80，本實施例所使用的偶聯試劑為：DIC/1－羥基苯并三唑(HOBT)，比例為1：1.5。固相合成CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)后，直接偶聯胸腺五肽，胸腺五肽購買自：上海吉爾生化有限公司，偶聯之后進行切割，所使用的切割試劑為：TFA/TIS/水，比例為：95：2.5：2.5。

為了有助于充分的說明本發明提供的具有腦靶向功能的多肽分子作為釋藥載體的效果，現結合具體的實驗詳細介紹如下。

需要注意的是，如未明確指出，本實驗例中提到的試劑、儀器或者設備均為常規的試劑、儀器或者設備，所用到的方法，均為常規的方法。

偶聯物透過血腦屏障的體外評價

本實驗中，采用的細胞為：Hela，SK－BR－3，NIH3T3(購自中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所)，將細胞接種于24孔板中，濃度為2×10⁵/孔，培養過夜，將實施例4、實施例5或實施例7提供的任意一種偶聯物用PBS溶解，與細胞孵育使其終濃度為10umol/L。

本實驗中，使用免疫熒光染色，染色步驟如下：

(1)用4％的甲醛在4℃下固定細胞10分鐘；

(2)用3％冷Triton－X100緩沖液在4℃滲透細胞20分鐘；

(3)用2％的BSA封閉緩沖液在室溫下封閉細胞30分鐘；

(4)羊抗人－FLAGmAb在室溫下孵育細胞1小時；

(5)用2mg/mL Streptavidin－Alexa499在室溫下孵育細胞1小時；

以上每步均用PBS沖洗至少兩遍。

(6)用0.3％Triton－X100緩沖液洗20分鐘；

(7)置細胞于顯微鏡及共聚顯微鏡下觀察。

實驗結果表明：細胞內均有染色，即表明偶聯物可通過細胞膜。

納米銀－多肽偶聯物穿越血腦屏障的體內評價

本實驗采用小鼠腦內熒光方法，進行納米銀－多肽偶聯物的血腦屏障穿越功能的評價。

實驗組小鼠尾靜脈注射實施例6提供的35nM的納米銀－多肽偶聯物，注射體積為1ml，6小時后，組織樣本進行HE染色及顯微鏡觀察。

對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，注射體積為1ml，6小時后，組織樣本進行HE染色及顯微鏡觀察。

觀察發現多肽偶聯后大大提高了納米銀在腦中的富集，實驗結果如圖1a和圖1b。

由本實驗結果可證實，本發明提供的具有腦靶向功能的多肽分子能夠介導納米銀穿越血腦屏障。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津世傳生物科技有限公司

<120> 具有腦靶向功能的多肽分子及其制備方法和作為釋藥載體的應用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Ala Gln Lys

1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5 10 15

Cys Ala Gln Lys

20

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Cys Gly Gln Lys

1

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5 10

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5 10 15

Cys Gly Gln Lys

20