啟動子PdoeR及其在指導cry基因表達中的應用的制作方法

本發明涉及一種新的強啟動子PdoeR，能指導蘇云金芽胞桿菌cry基因表達，其表達效率與cry8E基因啟動子(Porf1cry8E)相似。
背景技術：
：蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種革蘭氏陽性菌，屬于蠟樣芽胞桿菌族(Bacilluscereusgroup，Bc)(Vilas‐BoasGT,PerucaAP,ArantesOM(2007)BiologyandtaxonomyofBacilluscereus,Bacillusanthracis,andBacillusthuringiensis.CanJMicrobiol53(6):673‐687doi:10.1139/W07‐029)。蘇云金芽胞桿菌在形成芽胞的同時，也會產生具有殺蟲活性的伴胞晶體(BravoA,LikivivatanavongS,GillSS,SoberónM(2011)Bacillusthuringiensis:Astoryofasuccessfulbioinsecticide.InsectBiochemistryandMolecularBiology41(7):423‐431doi:10.1016/j.ibmb.2011.02.006)。這些晶體主要成分是由cry或cyt基因編碼的毒素蛋白，對包括鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目以及線蟲等在內的多種昆蟲都具有較高的殺蟲活性(SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。Cry或Cyt毒素的種類多樣性決定了蘇云金芽胞桿菌對不同昆蟲物種的殺蟲特異性。基于Bt殺蟲活性好、靶標特異性強、對環境友好等特點，蘇云金芽胞桿菌已經作為生防制劑在全世界商業化使用，且占據了現今快速增長的微生物殺蟲劑大約50％的市場份額(GerwickBC,SparksTC(2014)Naturalproductsforpestcontrol:ananalysisoftheirrole,valueandfuture.Pestmanagementscience70(8):1169‐1185doi:10.1002/ps.3744；LaceyLA,GrzywaczD,Shapiro‐IlanDI,FrutosR,BrownbridgeM,GoettelMS(2015)Insectpathogensasbiologicalcontrolagents:Backtothefuture.Journalofinvertebratepathology132:1‐41doi:10.1016/j.jip.2015.07.009)。Cry毒素和Cyt毒素的種類非常多，迄今為止，已經發現了825種cry和cyt基因(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。cry基因通常在細胞生長穩定期(stationaryphase)表達，蛋白在母細胞中積累并形成晶體內含物，其表達量非常高，能占細胞干重的20％到30％(SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。依據與芽胞形成的關系，cry基因可以分成兩類：依賴芽胞形成的cry基因(sporulation‐dependentcrygenes)和不依賴芽胞形成的cry基因(sporulation‐independentcrygenes)(AgaisseH,LereclusD(1995)HowdoesBacillusthuringiensisproducesomuchinsecticidalcrystalprotein？Journalofbacteriology177(21):6027‐6032doi:10.1128/jb.177.21.6027‐6032.1995；KroosL,ZhangB,IchikawaH,YuYT(1999)ControlofsigmafactoractivityduringBacillussubtilissporulation.Molecularmicrobiology31(5):1285‐1294doi:10.1046/j.1365‐2958.1999.01214.x；SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。不依賴芽胞形成的cry基因中的典型的例子就是cry3Aa。cry3Aa受σA控制，在營養生長時期就有一定量的表達(AgaisseH,LereclusD(1994)StructuralandfunctionalanalysisofthepromoterregioninvolvedinfullexpressionofthecryIIIAtoxingeneofBacillusthuringiensis.MolecularMicrobiology13(1):97‐107doi:10.1111/j.1365‐2958.1994.tb00405.x；DesouzaMT,LecadetMM,LereclusD(1993)FullexpressionofthecryIIIAtoxingeneofBacillusthuringiensisrequiresadistantupstreamDNAsequenceaffectingtranscription.Journalofbacteriology175(10):2952‐2960)。而大部分的cry基因屬于依賴芽胞形成的基因，在芽胞形成過程中轉錄水平較高，如cry1Aa,cry1Ba,cry1Ac,cry2Aa,cry4Aa,cry4Ba,cry11Aa,cry15Aa等(BravoA,AgaisseH,SalamitouS,LereclusD(1996)AnalysisofcryIAaexpressioninsigEandsigKmutantsofBacillusthuringiensis.Molecular&generalgenetics:MGG250(6):734‐741doi:10.1007/BF02172985；Brizzardetal.1991；Brown1993；Dervynetal.1995；Kroosetal.1999；Yoshisueetal.1993；Zhangetal.1998)。這些基因在母細胞中表達和積累，形成晶體。這是一個高度有序的細胞程序化過程，并受到一系列sigma因子的調控(如σE,σk)(AgaisseandLereclus1995；Kroosetal.1999；SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。例如，含有雙啟動子的cry1Aa基因的轉錄由σE和σK控制，σE和σK分別負責調控BtI和BtII兩個啟動子，使其分別在芽胞形成的早‐中期和中‐晚期具有活性(BravoA,AgaisseH,SalamitouS,LereclusD(1996)AnalysisofcryIAaexpressioninsigEandsigKmutantsofBacillusthuringiensis.Molecular&generalgenetics:MGG250(6):734‐741doi:10.1007/BF02172985；BrownKL,WhiteleyHR(1988)IsolationofaBacillusthuringiensisRNApolymerasecapableoftranscribingcrystalproteingenes.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica85(12):4166‐4170doi:10.1073/pnas.85.12.4166；BrownKL,WhiteleyHR(1990)IsolationofthesecondBacillusthuringiensisRNApolymerasethattranscribesfromacrystalproteingenepromoter.JBacteriol172(12):6682‐6688doi:10.1128/jb.172.12.6682‐6688.1990；SaxildHH,AndersenL,HammerK(1996)dra‐nupC‐pdpoperonofBacillussubtilis:nucleotidesequence,inductionbydeoxyribonucleosides,andtranscriptionalregulationbythedeoR‐encodedDeoRrepressorprotein.JBacteriol178:424‐434；WongHC,SchnepfHE,WhiteleyHR(1983)TranscriptionalandtranslationalstartsitesfortheBacillusthuringiensiscrystalproteingene.TheJournalofbiologicalchemistry258(3):1960‐1967)。另一個芽胞形成依賴型基因cry8Ea1(也稱為cry8E)的兩個啟動子Porf1和Pcry8E(Porf1啟動子是位于orf1基因的上游，Pcry8E啟動子是位于orf1和cry8Ea1基因之間的區域)的轉錄活性也是分別的受到σE和σH的控制(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。盡管蘇云金芽胞桿菌已用作殺蟲劑被廣泛使用，但是它僅占有全球殺蟲劑市場的2％。其占比與傳統的化學殺蟲劑相比還相差甚遠，主要原因是晶體蛋白的產量較低以及在田間的穩定性差(BradleyD,HarkeyMA,KimMK,BieverKD,BauerLS(1995)TheinsecticidalCryIBcrystalproteinofBacillusthuringiensisspp.thuringiensishasdualspecificitytoColeopteranandLepidopteranlarvae.Journalofinvertebratepathology65(2):162‐173doi:10.1006/jipa.1995.1024，BravoA,LikivivatanavongS,GillSS,SoberónM(2011)Bacillusthuringiensis:Astoryofasuccessfulbioinsecticide.InsectBiochemistryandMolecularBiology41(7):423‐431doi:10.1016/j.ibmb.2011.02.006；HuangD,ZhangJ,SongF,LangZ(2007)MicrobialcontrolandbiotechnologyresearchonBacillusthuringiensisinChina.Journalofinvertebratepathology95(3):175‐180doi:10.1016/j.jip.2007.02.016)。現在已經開發了一些可以增加殺蟲晶體蛋白的產量、藥效以及穩定性的技術。例如，用cry8E基因啟動子Porf1cry8E指導cry1Ac表達可以提高HDΔsigK突變體中Cry1Ac的產量(LiCR,DuLX,PengQ(2013)Constructionofhigh‐levelexpressionvectorforBacillusthuringiensis.MicrobiologyChina40(2):350‐361)。有趣的是，非cry類基因啟動子也可以成功指導cry1Ac表達。ExsY是炭疽芽胞桿菌(B.anthracis)芽胞外壁的基質結構蛋白(BoydstonJA,YueL,KearneyJF,TurnboughCLJ(2006)TheExsYproteinisrequiredforcompleteformationoftheexosporiumofBacillusanthracis.Journalofbacteriology188(21):7440‐7448doi:10.1128/JB.00639‐06)。研究表明，在芽胞形成晚期，exsY基因啟動子(PexsY)可以指導cry1Ac基因表達，但會導致Cry蛋白產量降低(ZhengQ,WangG,ZhangZ,QuN,ZhangQ,PengQ,ZhangJ,GaoJ,SongF(2014)Expressionofcry1AcgenedirectedbyPexsYpromoteroftheexsYgeneencodingcomponentproteinofexosporiumbasallayerinBacillusthuringiensis.ActamicrobiologicaSinica54(10):1138‐1145)。這一成果提供了非cry基因啟動子可以提高Cry蛋白產量以及穩定性的重要線索。技術實現要素：本發明發現了一個新的強啟動子PdoeR，它來自于一個潛在的DeoR轉錄調控因子家族成員。與強的cry類啟動子Porf1cry8E相類似，它可以高效地指導cry1Ac基因在蘇云金芽胞桿菌中表達。本發明構建了PdoeR驅動cry1Ac表達并產生晶體蛋白的菌株HD-PdeoR-1Ac。通過比較，發現HD-PdeoR-1Ac菌株的Cry1Ac產量以及對小菜蛾幼蟲的殺蟲活性均與野生菌株HD73類似。這些結果證明非cry基因啟動子PdeoR在構建蘇云金芽胞桿菌工程菌株方面有很好的應用前景。本發明為今后農業生產中改良晶體蛋白或其它殺蟲劑提供了新策略，為進一步開發和利用生物農藥帶來新的曙光。啟動子PdoeR，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。一種表達載體，含有上述啟動子PdoeR和cry基因。所述cry基因為cry1Ac基因。其骨架載體為pHT315載體，所述表達載體命名為pHT315-PdeoR-1Ac。一種工程菌株，由無晶體突變株HD73-轉入上述表達載體而得到。所述表達載體為pHT315-PdeoR-1Ac，其含有deoR啟動子與cry1Ac基因，人工菌株命名為HD-PdeoR-1Ac菌株。上述啟動子PdoeR在指導cry基因表達中的應用。所述cry基因為cry1Ac基因。本發明鑒定了一個新的非cry類的強啟動子PdeoR，它可以有效地指導cry1Ac表達。我們研究證明PdeoR指導表達Cry1Ac蛋白的效果與強cry基因啟動子Porf1cry8E指導的相似。這一結論得到以下證據的支持：首先，SDS-PAGE和Westernblot分析證明，deoR基因啟動子(PdeoR)與orf1cry8E基因啟動子(Porf1cry8E)和野生株中自身啟動子(nativepromoter)指導表達的Cry1Ac具有相似的產量(圖3)。其次，攜帶有PdeoR指導cry1Ac的菌株HD-PdeoR-1Ac也可以在母細胞中積累晶體蛋白(圖4)。最后，在對小菜蛾幼蟲殺蟲活性方面，PdeoR指導的Cry1Ac具有與Porf1cry8E指導的Cry1Ac以及野生株中Cry1Ac有相當的殺蟲活性水平(表3)。此前有許多研究致力于提高殺蟲蛋白的產量和穩定性，甚至是如何提高在多種環境脅迫條件下的穩定性(SanchisV,GoharM,ChaufauxJ,ArantesO,MeierA,AgaisseH,CayleyJ,LereclusD(1999)Developmentandfieldperformanceofabroad‐spectrumnonviableasporogenicrecombinantstrainofBacillusthuringiensiswithgreaterpotencyandUVresistance.Appliedandenvironmentalmicrobiology65(9):4032‐4039；YangJ,PengQ,ChenZ,DengC,ShuC,ZhangJ,HuangD,SongF(2013)TranscriptionalregulationandcharacteristicsofanovelN‐acetylmuramoyl‐L‐alanineamidasegeneinvolvedinBacillusthuringiensismothercelllysis.JBacteriol195(12):2887‐2897doi:10.1128/JB.00112‐13；ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。使用非天然啟動子來指導cry基因表達便是其中一種方法。Porf1cry8E是來自cry8Ea1基因的一個強啟動子，由σE和σH調節(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。該啟動子能夠增加Cry1Ac蛋白產量，尤其是在HDΔsigK中(LiCR,DuLX,PengQ(2013)Constructionofhigh‐levelexpressionvectorforBacillusthuringiensis.MicrobiologyChina40(2):350‐361；ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。exsY基因啟動子(PexsY)是第一個被報道能指導cry1Ac表達的非cry基因啟動子。然而，PexsY指導Cry1Ac的表達量低于野生型菌株HD73(ZhengQ,WangG,ZhangZ,QuN,ZhangQ,PengQ,ZhangJ,GaoJ,SongF(2014)Expressionofcry1AcgenedirectedbyPexsYpromoteroftheexsYgeneencodingcomponentproteinofexosporiumbasallayerinBacillusthuringiensis.ActamicrobiologicaSinica54(10):1138‐1145)。在此，本發明發現了另一個非cry基因啟動子PdeoR，在蘇云金芽胞桿菌的芽胞形成過程中，其轉錄活性與強cry基因啟動子Porf1cry8E處于同一水平(圖1中B)。雖然本發明只是PdeoR指導表達Cry1Ac蛋白，但本發明指出，deoR基因啟動子以特異依賴于σE的形式在芽胞形成過程中發揮作用，因此PdeoR應該可以指導所有cry基因的表達。總之，本發明為利用非cry基因的啟動子成功指導Cry1Ac表達提供了一個很好的例子。這個deoR基因啟動子也許還能用于其它cry基因的表達。我們的工作為今后Bt菌株改良，使用非cry基因啟動子增加Cry蛋白產量和殺蟲活性提供了重要線索。同時，也提示我們思考新的策略改良其它的殺蟲劑，以滿足農業生產的進一步開發和利用的需求。附圖說明圖1deoR基因啟動子在芽胞形成階段具有高轉錄活性圖中(A)融合deoR基因啟動子與lacZ，構建轉錄活性報告系統；(B)deoR和cry8E基因啟動子轉錄活性比較。3個獨立的克隆在SSM培養基中，30℃條件下培養，并按時間點(Tn)檢測β-半乳糖苷酶活性。圖中每個值代表3次以上重復實驗的平均值和標準誤。圖2deoR基因啟動子活性依賴于σE因子圖中(A)分析蘇云金芽胞桿菌HD73中deoR基因啟動子序列。圖中注釋了-35序列、-10序列以及轉錄起始位點，帶下劃線的TTG是deoR基因的起始密碼子，TAA為deoR基因的終止密碼子。(B)deoR基因啟動子在野生型(HD73)、sigK突變體以及sigE突變體中轉錄活性分析。3個獨立的克隆在SSM培養基中，30℃條件下培養，并按時間點(Tn)檢測β-半乳糖苷酶活性。圖中每個值代表3次以上重復實驗的平均值和標準誤。圖3deoR基因啟動子指導cry1Ac高效表達和積累圖中(A)質粒pHT315-PdeoR-1Ac的圖譜；(B)SDS-PAGE分析HD-PdeoR-1Ac、HD8E-1Ac、HD73和HD73-菌株中Cry1Ac蛋白表達水平。圖下標注的數值代表Cry1Ac蛋白產量，數值根據0.1μg/μlBSA計算；(C)Westernblot檢測各菌株中Cry1Ac特異性。使用Cry1Ac特異性抗體anti-Cry1Ac，三角形指示Cry1Ac特異性條帶。圖4不同啟動子驅動的Cry1Ac影響晶體形態圖中(A)-(D)不同菌株在SSM培養基中，30℃條件下培養至T24的透射電子顯微鏡(TEM)照片。(A)HD-PdeoR-1Ac菌株；(B)HD8E-1Ac菌株；(C)HD73,野生株(D)HD73-，受體菌株，陰性對照。(E)-(G)不同菌株中Cry1Ac晶體結構的原子力顯微鏡(AFM)照片。(E)HD-PdeoR-1Ac菌株；(F)HD8E-1Ac菌株；(G)HD73野生株具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明。材料方法:1、細菌菌株、質粒和生長條件蘇云金芽胞桿菌KurstakiHD73(文章中都稱為HD73)，和無晶體突變株HD73-(LereclusD,ArantesO,ChaufauxJ,LecadetM(1989)Transformationandexpressionofacloneddelta‐endotoxingeneinBacillusthuringiensis.FEMSmicrobiologyletters51(1):211‐217)在5mlLB培養基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％胰蛋白胨，固體LB培養基需要補充1.5％瓊脂)中活化。檢測啟動子活性時，選擇Schaeffer氏芽胞形成培養基(SchaefferP,MilletJ,AubertJP(1965)CatabolicrepressionofbacterialsporulationProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica54(3):704‐711doi:10.1073/pnas.54.3.704)，其中SSM培養基的成分是0.8％營養肉湯，0.012％MgSO4,0.1％KCl,0.5mMNaOH,1mMCa(NO3)2,0.01μMMnCl2,1μMFeSO4。此外，在實驗中使用到的大腸桿菌JM109菌株用于常規分子克隆實驗，而ET1菌株用于獲得非甲基化質粒DNA以便成功轉入蘇云金芽胞桿菌(MacalusoA,MettusAM(1991)EfficienttransformationofBacillusthuringiensisrequiresnonmethylatedplasmidDNAJBacteriol173(3):1353‐1356doi:10.1128/jb.173.3.1353‐1356.1991；WangG,ZhangJ,SongF,WuJ,FengS,HuangD(2006b)EngineeredBacillusthuringiensisGO33Awithbroadinsecticidalactivityagainstlepidopteranandcoleopteranpests.Appliedmicrobiologyandbiotechnology72(5):924‐930doi:10.1007/s00253‐006‐0390‐x)，大腸桿菌都是在LB培養基中，37℃，220rpm的條件下培養。用于蘇云金芽胞桿菌生長時所需的抗生素和使用濃度：紅霉素5μg/ml、卡那霉素50μg/ml。用于大腸桿菌的生長時所需的抗生素和使用濃度：氨芐青霉素100μg/ml。本研究中使用的細菌菌株和質粒總結在表1中。菌株和質粒均可以對外公開發放。表1用于本研究的菌株和質粒a抗生素抗性如下所示：ErmR，紅霉素抗性；AmpR，氨芐青霉素抗性。2、DNA的操作和轉化用質粒小量制備試劑盒(Axygen，杭州，中國)從大腸桿菌細胞中提取質粒DNA，根據說明書使用限制酶和T4DNA連接酶(寶生物工程有限公司，大連，中國)進行酶切和連接反應。用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶(寶生物工程有限公司，大連，中國)和普通TaqDNA聚合酶(BioMed，北京,中國)進行PCR擴增。從1％瓊脂糖凝膠中回收DNA片段使用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen，杭州，中國)。大腸桿菌的轉化用熱激法(SambrookBJ,RussellDW(2015)MolecularCloningALaboratoryManual.3rdededn.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)，蘇云金芽胞桿菌的轉化采用電激法(LereclusD,ArantesO,ChaufauxJ,LecadetM(1989)Transformationandexpressionofacloneddelta‐endotoxingeneinBacillusthuringiensis.FEMSmicrobiologyletters51(1):211‐217。)3、構建deoR啟動子與lacZ融合載體為了分析deoR啟動子的轉錄活性并與orf1-cry8E啟動子相比較(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)，首先從HD73菌株擴增deoR啟動子的序列。deoR啟動子是位于deoR基因起始密碼子上游長710bp的序列，使用特異性引物PdeoR-5/PdeoR-3(表2中)擴增。隨后通過PstI和BamHI兩個酶切位點融合到含有lacZ基因的pHT304-18Z載體上(AgaisseH,LereclusD(1994)StructuralandfunctionalanalysisofthepromoterregioninvolvedinfullexpressionofthecryIIIAtoxingeneofBacillusthuringiensis.MolecularMicrobiology13(1):97‐107doi:10.1111/j.1365‐2958.1994.tb00405.x)。將重組質粒pHT304-PdeoR通過電激轉化的方法轉入到HD73菌株中(GenePulserIIApparatus,BIO-RAD)。構建好的HDPdeoR菌株通過紅霉素抗性篩選和PCR方法鑒定。表2本研究中使用的特異性引物a限制性內切酶位點標有下劃線4、構建deoR啟動子與cry1Ac基因融合載體通過重疊PCR技術將deoR啟動子與cry1Ac基因融合。特異性引物pHTdeoR-5/pHTdeoR-3和pHT1Ac-5/pHT1Ac-3(見表2)分別用于擴增deoR啟動子和cry1AcORF(基因登錄號AAB46989.1)(WongHC,SchnepfHE,WhiteleyHR(1983)TranscriptionalandtranslationalstartsitesfortheBacillusthuringiensiscrystalproteingene.TheJournalofbiologicalchemistry258(3):1960‐1967)，擴增得到的特異性PCR產物經過凝膠回收，作為模板并用引物pHTdeoR-5/pHT1Ac-3進行第二輪PCR，擴增出重疊片段。得到的融合片段PdeoR-cry1Ac經過SalI和SphI位點構建到pHT315載體，得到pHT315-PdeoR-1Ac質粒。經測序驗證正確后，采用電激轉化的方法將其轉入到HD73-菌體中。構建好的HD-PdeoR-1Ac菌株通過紅霉素抗性篩選和PCR方法鑒定。此外，質粒pHT315-8E-1Ac和菌株HD8E-1Ac作為陽性對照(表1)(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。5、β-半乳糖苷酶活性測定為了測定β-半乳糖苷酶活性，將蘇云金芽胞桿菌菌株HDPdeoR和HD(Porf1-cry8E-lacZ)接種到SSM培養基中，在30℃、220rpm振蕩培養。以1小時為間隔從T1至T12各收集2ml菌液(T0表示指數生長期的結束，Tn表示T0后第n小時)。將菌液離心1min，棄去上清并將沉淀儲存在-20℃冰箱中備用。β-半乳糖苷酶活性的測定方法參見(YangH,WangP,PengQ,RongR,LiuC,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Weaktranscriptionofthecry1AcgeneinnonsporulatingBacillusthuringiensiscells.Appliedandenvironmentalmicrobiology78(18):6466‐74doi:10.1128/aem.01229‐12)，并且使用國際統一化的Miller單位(MillerJH(1972)ExperimentsinMolecularGenetics.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。6、Cry蛋白產量分析蘇云金芽胞桿菌接種到50mlSSM培養基中，在30℃、220rpm的條件下生長至T24時期，隨后離心8000×g，4℃10min收集菌體，并經冷凍干燥直至成凍干粉末。在每個樣品中加入適當體積的ddH2O重懸，使每個樣品生物量濃度(mg/ml)相同。準備含200μg石英砂(直徑為0.1mm)的2ml離心管，加入細胞細胞重懸液并破碎。離心12000×g，4℃5min，取上清液，作為總蛋白樣品。進而通過SDS-PAGE(4％聚丙烯酰胺濃縮膠，10％聚丙烯酰胺分離膠)和考馬斯亮藍染色來檢測Cry蛋白的產量。實驗結果經過ImageJ軟件(Version1.6.0_24,NationalInstitutesofHealth)和BSA進行定量分析。7、Cry蛋白特異性檢測蛋白樣品經SDS-PAGE分離后，轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜進行Westernblot實驗(WangG,ZhangJ,SongF,WuJ,FengS,HuangD(2006a)EngineeredBacillusthuringiensisGO33Awithbroadinsecticidalactivityagainstlepidopteranandcoleopteranpests.Appliedmicrobiologyandbiotechnology72(5):924‐30doi:10.1007/s00253‐006‐0390‐x)。用1：5,000稀釋的一抗anti-Cry1Ac(華大蛋白，北京，中國)與載有Cry蛋白的PVDF膜孵育，用PBST洗滌，隨后用HRP偶聯二抗羊抗鼠IgG(康為世紀，北京，中國)孵育。顯色方法參見已報到的文獻(NiD,XuP,GallagherS(2016)ImmunoblottingandImmunodetection.In:ColiganJE(ed)Currentprotocolsinimmunology.p8.10.1‐8.10.36).8、轉錄起始位點鑒定HD73菌株在SSM培養基中生長至T7階段，收集菌體，提取總RNA，通過逆轉錄PCR將其反轉錄成cDNA,方法參見(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。為了確定轉錄起始位點，按照cDNA擴增試劑盒(Clontech，MountainView，CA)使用說明書進行SMARTerRACE實驗。PdeoRRace和NestRace作為用于擴增PdeoRcDNA的5'末端的特異性引物。引物序列見表2。9、菌體形態和晶體結構觀察使用透射電子顯微鏡(TEM)和原子力顯微鏡(AFM)觀察蘇云金芽胞桿菌菌體形態和晶體結構。TEM的樣品的制備如下：蘇云金芽胞桿菌接種到SSM培養基中，在30℃下在培養至T24。離心收集20ml樣品，然后加入1ml3％戊二醛溶液進行固定。樣品經過固定，脫水，替換，浸泡，包埋，切片和染色等一系列操作之后用于觀察，儀器的操作過程參見(LiuR,YuG,ZouW,DuT(2008)Improvementsintechniqueofmaddingultrathinsectionfortransmissionelectronmicroscope.JiangxiForestryScience&Technology(1):41‐43；WeigelD,GlazebrookJ(2010)Transmissionelectronmicroscopy(TEM)freezesubstitutionofplanttissuesColdSpringHarborprotocols.vol7,)。AFM實驗中用到的樣品是將菌株培養到T24或更晚階段，直至90％以上晶體完成釋放。詳細的操作步驟參照儀器使用指南(BrukerMultiMode8SPM)。10、殺蟲活性測定殺蟲活性的測定方法參照文獻(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)，本專利中使用的菌株分別是HD-PdeoR-1Ac,HD8E-1Ac,HD73和HD73-。將四種菌液制備成相同生物量的殺蟲蛋白液，將這種殺蟲蛋白液分為七個濃度梯度(1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml和80μg/ml)，隨后分別將蛋白液均勻涂抹在相同面積的卷心菜葉片(直徑6cm)上，并且每個葉片上接種30只體型相近的二齡小菜蛾幼蟲(XueJ,LiangG,CrickmoreN,LiH,HeK,SongF,FengX,HuangD,ZhangJ(2008)CloningandcharacterizationofanovelCry1AtoxinfromBacillusthuringiensiswithhightoxicitytotheAsiancornborerandotherlepidopteraninsects.FEMSmicrobiologyletters280(1):95‐101doi:10.1111/j.1574‐6968.2007.01053.x.)。3天后計數幼蟲的存活數，并使用概率分析(ProbitAnalysis)計算LC50。每個濃度進行三次重復實驗。結果1、deoR基因啟動子在芽胞形成階段具有高轉錄活性為獲的可以高效指導cry基因表達的強啟動子，根據基因芯片數據(AccessionNo.GSE48410)(PengQ,WangG,LiuG,ZhangJ,SongF(2015)Identificationofmetabolismpathwaysdirectlyregulatedbysigma54factorinBacillusthuringiensis.FrontiersinMicrobiology6:407)，分析了蘇云金芽孢桿菌HD73菌株在T7時期各基因的表達水平，并挑選出前100個高轉錄活性的基因作為候選(表3)。然后利用RNA-seq數據(未發表)，進一步篩選在過渡時期(從營養生長到芽胞形成)和芽胞形成時期都高量表達的基因。最后，選取HD73_5014基因(DeoR轉錄子家族成員)，其啟動子作為候選強啟動子用于本研究，并標識為PdeoR。表3具有高表達的前100個基因的基因芯片數據已有報道cry8E基因啟動子(Porf1cry8E)是一個強的cry基因啟動子，可以高效指導cry1Ac基因表達(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。為了證實deoR啟動子(PdeoR)的高轉錄活性，本發明對PdeoR和Porf1cry8E的轉錄活性進行比較。通過構建啟動子融合lacZ的菌株(圖1中A)，并進行β-半乳糖苷酶活性測定。結果表明，在芽胞形成時期，特別是從T6到T12期，PdeoR和Porf1cry8E的轉錄活性非常高(圖1中B)。兩個啟動子的轉錄活性相似，都一直呈上升趨勢直至T8達到峰值，而后逐漸降低(圖1中B)。總體而言，PdeoR的轉錄活性與Porf1cry8E在各個時間段都很相似，表明在芽胞形成過程中，PdeoR也是強啟動子。2、deoR基因啟動子活性依賴于σE因子進一步，仔細分析了deoR基因啟動子序列(見SEQIDNO：1)。依據5'-RACE獲得的隨機克隆的序列，確定了轉錄起始位點，是位于deoR翻譯起始密碼子上游的55個核苷酸殘基位置的“A”(圖2中A)。對deoR啟動子區的分析顯示，-35區(GCATGA)和-10區(AGTACAAT)(圖2中A)與σE依賴型啟動子的保守序列(KHATANHT...MATANNHT)相似(ZhangJB,SchairerHU,SchnetterW,LereclusD,AgaisseH(1998)Bacilluspopilliaecry18Aaoperonistranscribedbysigma(E)andsigma(K)formsofRNApolymerasefromasingleinitiationsite.NucleicAcidsResearch26(5):1288‐1293doi:10.1093/nar/26.5.1288)。這表明deoR啟動子也可能依賴于σE。cry1Ac基因是依賴芽胞形成的cry基因，有兩個啟動子，分別受σE和σK識別和控制(WongHC,SchnepfHE,WhiteleyHR(1983)TranscriptionalandtranslationalstartsitesfortheBacillusthuringiensiscrystalproteingene.TheJournalofbiologicalchemistry258(3):1960‐1967)。在利用deoR基因啟動子指導cry1Ac基因表達前，需要確認deoR啟動子是否也由σE和σK調控。為此，我們構建含有PdeoR-lacZ融合的質粒pHT304-PdeoR，并轉入野生型菌株(HD73)，sigE突變體(HDΔsigE)和sigK突變體(HDΔsigK)中，測定和比較這三個株菌的β-半乳糖苷酶活性。如圖2中B所示，PdeoR-lacZ融合在sigE突變體中β-半乳糖苷酶活性降低，而在野生型和sigK突變體中，PdeoR的轉錄活性在T1至T8時期內快速增加(圖2中B)，從而證實deoR啟動子由σE調控。此外，在T9到T12時期內，PdeoR的轉錄活性在野生型中低于在sigK突變體中(圖2中B)，此結果與已報道Porf1cry8E的轉錄活性相一致(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。以上研究結果證實deoR基因啟動子以特異依賴于σE的形式在芽胞形成過程中發揮作用。3、deoR基因啟動子指導cry1Ac表達和積累為了檢測deoR啟動子能否指導cry1Ac在蘇云金芽胞桿菌中高效表達，我們首先構建了pHT315-PdeoR-1Ac質粒，其內含有PdeoR-cry1Ac融合(圖3中A)。同時，以pHT315-8E-1Ac質粒(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)作為對照。隨后將這兩個質粒導入HD73-菌株——該菌株無cry基因，不能形成晶體(LereclusD,ArantesO,ChaufauxJ,LecadetM(1989)Transformationandexpressionofacloneddelta‐endotoxingeneinBacillusthuringiensis.FEMSmicrobiologyletters51(1):211‐217)。相應的，得到菌株HD-PdeoR-1Ac和HD8E-1Ac(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。通過透射電子顯微鏡(TEM)對所得到的菌株進行檢測，觀察其晶體蛋白的形成情況。結果表明，與HD73-(圖4中D)相比，HD-PdeoR-1Ac(圖4中A)、HD8E-1Ac(圖4中B)和HD73(圖4中C)都能產生明顯的晶體內含物。有趣的是，HD-PdeoR-1Ac(圖4中A)和HD8E-1Ac(圖4中B)在芽胞形成過程中不能形成典型的雙錐體晶體，而在HD73中卻可清楚地觀察到(圖4中C)。為進一步確認這一現象，我們通過高分辨力的原子力顯微鏡(Atomicforcemicroscope，AFM)檢測了晶體形態。與HD73菌株產生的完美雙錐體晶體(圖4中G)相比，我們在HD-PdeoR-1Ac(圖4中E)和HD8E-1Ac(圖4中F)中都只能觀察到一些不規則的晶體。基于這些結果，推測Cry1Ac的轉錄后調節顯著影響雙錐體晶體結構形成。接下來，我們對HD-PdeoR-1Ac菌株的Cry蛋白產量進行檢測，以決定PdeoR啟動子能否高效指導Cry1Ac蛋白表達并且適合生產應用。SDS-PAGE實驗顯示HD-PdeoR-1Ac，HD8E-1Ac和HD73都產生～130kDa大小的Cry1Ac蛋白，且產率大致相同，而在在受體菌株HD73-中沒有檢測到該蛋白(圖3中B)。同時，我們用Cry1Ac抗體進行免疫印跡實驗驗證這幾個菌株產Cry蛋白的特異性。先將菌株在SSM培養基中培養至穩定期，隨后收集細胞并提取蛋白質進行檢測。與預期一致，在HD-PdeoR-1Ac，HD8E-1Ac和HD73中發現有～130-kDaCry1Ac，而在HD73-中沒有(圖3中C)。以上結果表明，deoR基因啟動子能夠正確、高效地指導cry1Ac基因表達。4、deoR啟動子指導表達的Cry1Ac具有殺蟲活性。盡管HD-PdeoR-1Ac不能和野生型(HD73)一樣產生典型的雙錐體晶體，但和HD73-相比，HD-PdeoR-1Ac有明顯的Cry1Ac蛋白積累(圖3和圖4)。那么，是否deoR啟動子指導表達的Cry1Ac具有與野生型和對照菌株HD8E-1Ac相似殺蟲活性？我們用HD-PdeoR-1Ac，HD8E-1Ac，HD73和HD73-預處理的卷心菜分別喂養二齡小菜蛾幼蟲，隨后計算半致死濃度(LC50)。結果發現HD-PdeoR-1Ac與HD8E-1Ac和HD73的殺蟲活性相似(表4)。這表明deoR啟動子指導表達的Cry1Ac具有良好的殺蟲活性，HD-PdeoR-1Ac菌株可以作為候選的生物防治劑使用。表4蘇云金芽孢桿菌菌株對小菜蛾的殺蟲活性菌株半致死濃度(μg/ml)95％置信區間HDdeoR1Ac‐31517.112.77‐22.93HD8E1A‐315c21.6318.74‐25.09HD7320.6318.3‐23.19HD73‐NANASEQUENCELISTING<110>中國農業科學院植物保護研究所<120>啟動子PdoeR及其在指導cry基因表達中的應用<130>PP17008－ZWB<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>912<212>DNA<213>啟動子PdoeR的核苷酸序列<400>1ctttccatcgcgaatatccgcactatatgcaggagtcgtccagccatctccttctggtac60aacatcaacgtgacaaagaatgcctactaactcttctccttgtcccatttcaagatgacc120tgcatatccttctaaatttttagaagcaaaaccttcagtttctcctttatgtaacatgaa180agataaagctttttctacaccttcaccgaatggtgcgccctctttcgccgattcttcttc240ccatacacttttaatttgtaaaaattgttgtgtatcacgaattaaatcatcttttcgttt300cgcaacttcttctgtccaattaattgctgacatcacgcatccatccttcactatattgtt360tctttcatcataacaaaccgaaatctcttatgccatacacgaaaactaaataccgaacaa420ttgtaatatttcagatatttcttattagtttttcttttattttttcaaaaaaatttgcag480gaatttggcgttttacgtagaattttatgtgttagttgactgaccatatatacaatgtca540actaccaatatttttctatatgaatatttgttaaatttctgtaaaatttaagtagattaa600agcatgaattttatcatgtagagtacaatggtagtaacgaccttctttcctgaatggggt660caaaaaaactagtagaggagtggttttctcttgaaacctacaactactcgtatgctaaca720cgcattaaatcaatttatatgtacatcaatgaaaacggaacggtaacgacgaaagacctt780gtagatgagttcgggatcacaccgcgaacgatacaacgtgatctaaatgtgttgcagttt840aatgaactcgtgtatagcccttgccgcggtaagtggacaacaacaggaaagaaagtgaga900atgacctcataa912當前第1頁1 2 3