文昌魚識別幾丁質的絲氨酸蛋白酶casp基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種文昌魚識別幾丁質的絲氨酸蛋白酶CASP基因、該基因編碼的蛋白質及該蛋白質的表達方法和應用。所述CASP基因是通過兼并引物擴增和RACE擴增的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到的一個MASP類似基因。由CASP基因編碼的蛋白質，通過重組表達載體PET-32a(+)-CASP，在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達。CASP編碼的蛋白在對抗外來病原中起著重要作用，具有成為高效天然抗菌藥物的開發價值。
【專利說明】文昌魚識別幾丁質的絲氨酸蛋白酶CASP基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及文昌魚特有的MASP類似基因(命名為CASP基因)及其編碼的CASP蛋白，以及該基因和蛋白在制備治療感染性疾病的藥物上的應用，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002]補體激活的凝集素途徑是先天性免疫的一種重要防御措施，在生物體內發揮著重要的生物學功能，如溶胞作用、溶菌作用、調理作用及介導炎癥反應。
[0003]激活凝集素途徑的復合物是由一系列的模式識別分子以及相關的絲氨酸蛋白酶家族決定的。最早報道的甘露糖結合凝集素(Mannose Bindig lectin, MBL)激活補體途徑的發現是在20多年前，從此，補體系統在先天性免疫中重要性重新被認識。而目前研究結果表明，MBL相關的絲氨酸蛋白酶(MASPs) =MASPland MASP2,是參與激活補體系統的重要組成部分。
[0004]在病原體的感染時期，MASP在凝集素途徑的產生和激活中扮演著重要角色，MASP-2是補體凝集素溶血途徑中的重要一員，激活補體凝集素溶血途徑中發揮著至關重要的作用。已有的研究表明:MASP2基因的突變和血清含量變化的多少與多種疾病密切相關(自身免疫性疾病，感染性疾病，腫瘤等)。MASP2缺陷，會導致凝集素途徑的溶血活性缺失，導致化膿性感染；炎癥性肺部疾病，也會導致MASP有關的補體途徑損傷。同樣的，MASPl缺陷，會導致胚胎細胞移行信息的潛在性喪失，表現為發育性綜合征，包括面部異常，唇裂或/腭裂，顱骨縫早閉，學習障礙，生殖器，四肢和泌尿系統畸形，即所謂的3MC綜合癥；MASPl突變，也會導致其有關的補體途徑損傷。
[0005]文昌魚(Branchiostoma belcheri),屬于脊索動物門(Chordate),頭索動物亞門(cephalochordate),是現存和脊椎動物親緣關系最近的無脊椎動物。本發明的發明人從文昌魚中克隆得到了全新的分子，將其命名為CASP (chitin-binding associated serineprotease)，該分子C端擁有和MASP同源的CCP和Tryp_SPc結構域，與MASP不同的是，其N端是一個幾丁質結合結構域(CBD)，這類分子在其他物種中從未報道，因此發明人推測其是文昌魚所特有的MASP家族成員， 并且擔負著模式識別的功能。本發明的發明人對其蛋白進行了表達并制備了單抗，結果發現CASP內源蛋白能夠結合幾丁質糖，免疫膠體金的結果顯示其能夠識別和結合到金黃色葡萄球菌和大腸桿菌上，并且重組表達的該蛋白具有絲氨酸蛋白酶活性，并且擁有調理素的功能，能夠顯著地促進巨噬細胞對金葡菌的吞噬率。因此以上結果提示CASP在對抗外來病原中起著重要作用，具有成為高效天然抗菌藥物的開發價值。
【發明內容】
[0006]本發明的一個目的在于提供一種新的類MASP家族免疫相關的基因，將其命名為CASP基因，同時還提供該基因所編碼的蛋白。
[0007]本發明的另一個目的在于提供CASP基因所編碼蛋白質的表達方法。[0008]本發明再一個目的在于提供該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應用。
[0009]一種文昌魚識別幾丁質的絲氨酸蛋白酶CASP基因，所述CASP基因是通過兼并引物擴增和RACE擴增的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到的一個MASP類似基因，其DNA序列如序列表中序列I所示。[0010]由CASP基因編碼的蛋白質，其氣基酸序列如序列表中序列2所不；該蛋白等電點為5.28，分子量為46834.0道爾頓。
[0011 ] 所述的蛋白質通過重組表達載體PET-32a (+) -CASP,在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達。表達方法具體包括以下步驟:
[0012](I)構建重組表達載體 PET_32a(+)-CASP ;
[0013](2)將重組表達載體PET-32a(+)_CASP轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，得到工程菌株;
[0014](3)對大腸桿菌BL21 (DE3)工程菌株進行培養；
[0015](4)純化重組的CASP融合蛋白，獲得CASP基因編碼的蛋白質。
[0016]所述步驟(1)中重組表達載體PET-32a(+)_CASP的構建包括以下步驟:
[0017]a)依據權利要求1所述的CASP基因的兩端序列合成一對引物，其中，上游引物 Pl 為 5’ -ccgGAATTCAAGCCCGTCCAAAAAACCC-3’，含有 EcoRI 切割位點；下游引物 P2 為5’ -ccgCTCGAGCACGTACGAA CCAATGGC-3’，含有 XhoI 切割位點；
[0018]b)以CASP基因的全長質粒為模板，以P1、P2為引物，進行PCR擴增；
[0019]c)將PCR擴增產物克隆到表達載體PET_32a (+)上，得到重組表達載體PET-32a(+)-CASP。
[0020]所述的表達載體PET_32a(+)以TRX為融合伴體，該系統使蛋白在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達。
[0021]所述步驟(3)的培養條件為:將單菌落接種于30ml含有100mg/L的氨卞2XYT液體培養基中，37°C、220rpm培養12小時，取培養物按1:100的比例接種于含有100mg/L氨卞的2 X YT培養基中，37°C、220rpm培養至0D600=0.6，加入終濃度為0.5mM的IPTG，18°C、180rpm誘導培養18小時后離心收集菌體。
[0022]所述步驟(4)為，將總菌體用TBS緩沖液洗滌后，再懸浮，超聲破碎處理后，高速離心，收集上清液，將上清液經N1-NTA Agarose親和色譜層析純化,收集目的蛋白的洗脫峰。
[0023]本發明所選擇的白氏文昌魚(Branchiostoma belcheri)采集于廣東省湛江東海島與硇洲島航線海域。
[0024]本發明通過兼并引物擴增從文昌魚的cDNA—鏈中克隆得到了 CASP基因的部分目標片段，并對這個片段進行了擴增，得到目標基因序列的全長克隆，命名為CASP (其DNA序列如序列表中序列I所示)。該基因編碼433個氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列2所示)，含有12個氨基酸的信號肽。去除信號肽的成熟蛋白等電點為5.22，分子量為45559.3道爾頓。
[0025]本發明通過設計一對引物，將編碼成熟蛋白序列的新基因CASP克隆到原核融合表達載體pET32a(+)上，連接轉化后得到大腸桿菌工程菌株BL21 (DE3)-pET32a (+)-CASP。此工程菌株中的重組表達載體pET32a(+)-CASP以T7為啟動子，trx為分子融合伴體，幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達，N端和C端各有6XHis結構作為標簽，便于利用固定化金屬螯合親和層析進行純化。然后再通過對培養時間，誘導時間，溫度等條件的摸索和優化，重組CASP融合蛋白的表達量得到提高。
[0026]本發明還摸索和優化了重組CASP蛋白的純化條件，表達產物的超聲破碎裂解液經N1-NTA Agarose親和色譜層析,得到純度較高的融合蛋白。
[0027]本發明的表達質粒復制方法:參照Sambrook (Sambrook, et al.1989, Moleculardoing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法,用 CaC12 的方法將質粒轉化E.col1.DH5a或BL21 (DE3)菌株，用含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養基培養轉化菌株,用Omega公司試劑盒提取質粒。
[0028]本發明對其CASP編碼的蛋白進行了表達，制備并篩選了蛋白的單克隆抗體，結果發現內源CASP蛋白能夠結合幾丁質糖，免疫膠體金的結果顯示其能夠識別和結合到金黃色葡萄球菌和大腸桿菌上，并且重組表達的該蛋白具有絲氨酸蛋白酶活性，并且擁有調理素的功能，能夠顯著地促進巨噬細胞對金葡菌的吞噬率。結果提示CASP編碼的蛋白在對抗外來病原中起著重要作用，具有成為高效天然抗菌藥物的開發價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為本發明文昌魚CASP蛋白與其它MASP家族成員蛋白的Tryp_SPc結構域序列同源性比較結果。以下是圖1所列到的其他物種名英文簡稱，全稱及拉丁文命名全稱(如斜體):
[0030]Bbe, Branchiostoma belcheriSh, Shark(Triakis scyIlium);
[0031]Hu, human;Lam, Lamprey (Lethenteroncamtschaticum);
[0032]Xe, XenopusAs, Ascidian(Halocynthia roretzi);
[0033]Ca, Carp;Nv, Nematostella vectensis.[0034]以下是圖1所列到的其他物種MASP全稱以及在NCBI等數據庫里的序號(如括號內標注):
[0035]HuMASPl(NP_001870);LamMASPl(AB089265.1);
[0036]HuMASP2(000187);LamMASPA(BAC41492.1);
[0037]HuMASP3(AAK84071);LamMASPB(AB089266.1);
[0038]XeMASPl(ΝΡ_001082340.1); AsMASPa(BAC41341.1);
[0039]XeMASP2 (BAA86865.1) ;AsMASPb (BAC41342.1);
[0040]XeMASP3a(AB078636.1);BbeMASPl(BAC75888.1);
[0041]XeMASP3b(AB078637.1);BbeMASP3(BAC75889.1);
[0042]CaMASP2(BAE44364.1);NvMASP(AB450044.1)
[0043]ShMASP (BAA86867.1);
[0044]圖2為擴增得到的CASP基因全長片段的電泳圖，其中M:DNA DL2000marker ；1:CASP基因全長片段。
[0045]圖3為CASP基因的重組表達質粒的構建圖。
[0046]圖4為重組蛋白CASP經誘導表達、親和層析純化后的SDS-PAGE和Western Blot檢測顯影圖。[0047]圖5重組蛋白酶切小肽活性結果圖。[0048]圖6A-圖6C為重組蛋白CASP的調理素活性實驗結果圖，其中，圖6A為:流式細胞分析結果圖；圖68為:吞噬率統計柱狀圖；圖6(:為:激光共聚焦結果圖。
[0049]圖7為文昌魚體液內源CASP蛋白結合幾丁質實驗結果。
[0050]圖8A-圖8E為內源CASP識別病原菌的免疫膠體金實驗結果，其中圖8A為:陰性對照；圖8B為:陽性對照；圖8C-E為:CASP陽性信號。
【具體實施方式】
[0051]下面通過實施例，對本發明的技術方案作進一步的說明。
[0052]實施例1:文昌魚總RNA的提取和CASP部分片段擴增。
[0053]總RNA的提取和RACE cDNA合成:取文昌魚全魚，采用Trizol試劑法提取總RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白質，獲得文昌魚總RNA。取I μ g總RNA，按照Τ0Υ0Β0公司的FirstStrand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace- α -TM(code N0.FSK-100)說明書操作進行逆轉錄合成第一鏈。取2μ1 cDNA—鏈產物，以根據佛羅里達文昌魚測序數據庫CASP基因預測序列設計的兼并引物 5 ' PCR Primer:5 ' -ACCCATCCCTCCCAGTCAC-3 '和 3 ' PCRPrimer:5/ -GTAGACACTCGGCTTGGCG-3'為引物，進行 RT-PCR擴增 CASP 的部分片段 899bp。將擴增得到的目的片段連接到pGEX T easy vector(promega)后轉化DH5 α大腸桿菌，挑選重組克隆測序。Blast同源分析表明，獲得的這個片段含有CCP和SP結構域，類似MASP家族成員。
[0054]實施例2 =RACE擴增CASP基因5'和3'末端。
[0055]按照Invitrogen的GeneRacerTM Kit進行RNA的去憐酸化RACE、脫帽反應、RNAoligo的連接及mRNA的逆轉錄,從而合成cDNA —鏈,采用Takara的LA Taq聚合酶,按照GeneRacerTM Kit的反應體系進行PCR擴增。其中，根據上面擴增得到的CASP部分片段的序列，設計進行5' RACE擴增的基因特異的外套引物為5' -gene-specific primer:5/ -GACCATCCAAGGCATCACCAGTT-3';內巢引物為 5' -nested primer: 5' -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3' ;CASP 的 3' RACE 擴增的基因特異的外套引物為 5' -gene-specific primer:5/ -GGAAGGAGACCACCCACGGCT-3';內巢引物為 5' -nested primer:5' -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'。將擴增得到的目的片段連接到pGEX T easy vector(promega)后，轉化DH5a大腸桿菌，挑選重組克隆測序。并與實施例1得到的目的片段進行拼接，得到CASP基因的全長EST序列，長度是1976bp，編碼434個氨基酸的CASP蛋白。
[0056]實施例3 =CASP全長的擴增及序列分析。
[0057]根據實施例2拼接得到的CASP基因的序列，設計引物5 ' -TCTGCATTTCACATCATCAAACG-3'和 5' -TTGGGTGAGGTTTCTAAGGCTAA-3 '，采用 Takara的LATaq聚合酶擴增CASP的全基因，擴增得到的1976片段的電泳圖譜如圖2所示。將擴增得到的目的片段連接到pGEX T easy vector (promega)后轉化DH5 α大腸桿菌,挑選重組克隆測序。Blast同源分析表明，獲得了編碼CASP全基因的EST序列。
[0058]實施例4:重組CASP表達質粒的構建
[0059]依據CASP基因全長序列，設計用于重組表達的引物P1、P2，其中，
[0060]上游引物(PI)含有EcoRI切割位點，下游引物(P2 )含有Xho I切割位點。[0061]上游引物(Pl):5’ -ccg GAATTC AAGC CCGTCCAAAA AACCC-3’
[0062]保護堿基EcoRI CASP基因序列
[0063]下游引物(P2):5’ -ccg CTCGAG CACGTACGAA CCAATGGC-3’
[0064]保護堿基XhoI CASP基因序列
[0065]利用含有CASP全長基因的pGEX T質粒為模板，PU P2為引物，進行PCR擴增，得到特異擴增的條帶，其大小為1302bp。將該PCR擴增產物切膠回收，用Xho I和EcoR I對目的片段和質粒pET32a(+)同時進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接(構建過程見圖3)，挑選陽性克隆測序，進行BLAST分析，確認目的片段重組連接成功。
[0066]實施例5:文昌魚CASP融合蛋白的表達
[0067]將重組表達載體pET32a(+)_CASP轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得工程菌株BL21 (DE3)-pET32a(+)-CASP。基因工程菌超聲破碎得到的裂解上清液，經SDS-PAGE電泳分析表明，菌株經誘導后有明顯的特異表達產物帶，分子量與用軟件seqt00lS84預測的理論值64kD相符。對培養時間，誘導濃度，溫度等條件的摸索得出，工程菌株BL21(DE3) -pET32a(+)-CASP的培養條件為:將單菌落接種于30ml氨芐抗性2XYT液體培養基中，37°C、250rpm培養過夜；(擴大培養)取過夜培養物按1:100的比例接種于含有100mg/L的氨卞的2 X YT培養基中，37°C、250rpm培養至0D600=0.6 ;(誘導目的蛋白大量表達)加入終濃度為0.5mM的IPTG，18°C、250rpm誘導培養20hr。離心，收集菌體，分析目的蛋白是否表達，經SDS-PAGE電泳分析表明，在該培養條件下，CASP融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的一半左右，處于可溶狀態。
[0068]實施例6:重組文昌魚CASP融合蛋白的純化
[0069]將總菌體用TBS緩沖液(50mMTris.Cl, 150mMNaCl, pH7.5)洗滌，再用適量的TBS緩沖液懸浮，超聲處理120min后，離心獲得上清液，進行親和色譜層析純化，SDS-PAGE分析融合蛋白的表達和層析的結果。從SDS-PAGE結果可以得出:CASP蛋白能被N1-NTA Agarose親和柱所吸附，用IOOmM咪唑洗柱時，能把重組的CASP目的蛋白洗下。收集得到重組蛋白的洗脫峰后，對應于目的蛋白洗脫峰處的洗脫液經凝膠柱除去蛋白中的咪唑，并用30KD的蛋白超濾柱(Millipore)濃縮。SDS-PAGE分析表明:濃縮后得到成份單一濃度較高的重組的CASP目的蛋白(如圖4所示)。
[0070]實施例7 =CASP重組蛋白酶切小肽活性分析
[0071]將濃度為400 μ g/ml的CASP重組蛋白與不同濃度的底物小肽Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Sigma)37°C避光孵育 30min,每組樣品重復三次，用酶標儀檢測A360nm/460nm (激發波長360nm,吸收波長460nm)變化，0rigin7.5軟件統計并擬合酶飽和曲線。結果如圖5所示，與陰性對照TRX相比，CASP隨著底物量的增加，其產物釋放吸光值也相應呈明顯增高趨勢，證明CASP重組蛋白具有絲氨酸蛋白酶活性。
[0072]實施例8 =CASP重組蛋白的調理素活性分析
[0073]將狀態良好的Raw264.7細胞系鋪至6孔細胞培養板內，過夜培養。FITC標記過的金黃色葡萄球菌(5X108cells ml-lin PBS)與等體積的CASP重組蛋白于室溫避光孵育2hr，之后將該混合樣品加入到6孔細胞板中。37°C搖床輕晃lhr，保證吞噬細胞發揮吞噬作用。之后，用5%PFA固定15min，用預冷的PBS洗三次。加入0.2mg/ml的臺盼藍以猝滅細胞表面及背景熒光，再用冷的PBS洗兩遍。最后重懸至500 μ IPBS中，用細胞流式分析技術進行檢測。同時處理并固定后的Raw264.7細胞系，通過蛋白單抗的處理，及免疫熒光的后續步驟，利用激光共聚焦的手段對吞噬過程進行捕捉。流式細胞術的原始數據如圖6A所示，將三組實驗中吞噬細胞對細菌的吞噬率利用GraphPad Prism5軟件進行統計比較，得到如圖6B的柱狀圖，可以顯示，CASP處理組吞噬率較對照組有明顯的提高，并且具有顯著性統計意義(P=0.0040)。而加入CASP單抗將目的蛋白屏蔽后，該吞噬率又明顯下降，這進一步表明CASP能特異地促進吞噬作用，具有調理素的活性。將上述吞噬作用用激光共聚焦顯微鏡觀察，紅色熒光標記為CASP，綠色熒光標記為金黃色葡萄球菌，藍色為吞噬細胞細胞核。結果發現CASP能夠識別金黃色葡萄球菌并幫助吞噬細胞吞噬病原菌(見圖6C)。
[0074]實施例9 =CASP內源蛋白結合幾丁質的活性分析
[0075]將幾丁質珠(chitin beads, NEB)用PBS平衡后，與300 μ I文昌魚體液室溫搖床孵育3hr。用PBS洗漆三次后,將幾丁質珠子煮樣,利用CASP單抗及western blot去檢測，結果表明文昌魚體液中CASP內源蛋白(圖7Lane3)能特異地結合幾丁質，而對照組為未處理的體液中CASP內源蛋白，表明了其模式識別的特性。
[0076]實施例10 =CASP內源蛋白結合病原菌的活性分析
[0077]將活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌加入到培養有文昌魚的海水中，4°C過夜后，將文昌魚的鰓、腸、肝盲囊解剖提取，用于免疫膠體金的后續處理。用配好的固定液(即:包含有多聚甲醛、苦味酸和戊二醛的NaPB溶液)固定3hr。液氮凍融一次后，山羊血清封閉
0.5hr, 4°C下用CASP單抗作為一抗孵育24hr，TBS洗滌三次后，在4°C下，用金顆粒標記的羊抗鼠二抗(Nanoprobe)孵育過夜。經NaPB洗滌后，用銀增強試劑盒處理，放大膠體金信號。將處理好的樣品送至中山大學醫學院電鏡教研室做進一步的包埋，脫水，切片處理，最后置于電鏡下觀察照相。結果如圖8A-8E，圖8A為陰性對照，即鼠源IgG作為一抗的處理組；圖8B為陽性對照，即文昌魚細胞核抗組蛋白的單抗處理組，黑色顆粒為陽性信號，如黑色箭頭所示，N為細胞核；圖8C-E為陽性結果，即`CASP單抗處理組，CASP在消化道上皮細胞表達(表皮細胞黑色箭頭a所示)，并能分泌至外，與病原菌結合(消化道腸腔病原菌表面，黑色箭頭b所示)，并且如圖8D呈吞噬中間狀態，表明內源的CASP蛋白能夠結合到病原菌上，并介導吞噬過程，提示了該分子在對抗病原菌時的重要作用。
【權利要求】
1.一種文昌魚識別幾丁質的絲氨酸蛋白酶CASP基因，其特征在于，所述CASP基因是通過兼并引物擴增和RACE擴增的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到的一個MASP類似基因，其DNA序列如序列表中序列I所示。
2.由權利要求1所述的CASP基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如序列表中序列2所/Jn ο
3.權利要求2所述的蛋白質的表達方法，其特征在于，通過重組表達載體PET-32a(+)-CASP，在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達。
4.根據權利要求3所述的表達方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)構建重組表達載體PET-32a(+)-CASP; (2)將重組表達載體PET-32a(+) -CASP轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，得到工程菌株； (3)對大腸桿菌BL21(DE3)工程菌株進行培養； (4)純化重組的融合蛋白，獲得CASP基因編碼的蛋白質。
5.根據權利要求4所述的表達方法，其特征在于:步驟(1)中重組表達載體PET-32a(+) -CASP的構建包括以下步驟: a)依據權利要求1所述的CASP基因的兩端序列合成一對引物，其中，上游引物Pl 為 5’ -ccgGAATTCAAGCCCGTCCAAAAAACCC-3，,含有 EcoRI 切割位點；下游引物 P2 為5’ -ccgCTCGAGCACGTACGAA CCAATGGC-3’，含有 XhoI 切割位點； b)以含有CASP全長基因的pG`EXT質粒為模板，以P1、P2為引物，進行PCR擴增； c)將PCR擴增產物克隆到表達載體PET-32a(+)上，得到重組表達載體PET-32a(+)-CASP。
6.根據權利要求4所述的表達方法，其特征在于:步驟(3)的培養條件為:將單菌落接種于30ml含有100mg/L的氨卞2 X YT液體培養基中，37 °C、220rpm培養12小時，取培養物按1:100的體積比接種于含有100mg/L氨卞的2 X YT培養基中，37°C、220rpm培養至0D600=0.6，加入終濃度為0.5mM的IPTG，18°C、180rpm誘導培養18小時后離心收集菌體。
7.根據權利要求4所述的表達方法，其特征在于:步驟(4)為，將總菌體用TBS緩沖液洗滌后，再懸浮，超聲破碎處理后，高速離心，收集上清液，將上清液經N1-NTA Agarose親和色譜層析純化，收集目的蛋白的洗脫峰。
8.權利要求2所述的蛋白質在制備治療感染性疾病藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK103509809SQ201310441421
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】徐安龍, 李銳, 黃盛豐, 趙紅晨, 張晗, 黃慧清 申請人:中山大學