冬蟲夏草中國被毛孢幾丁質酶f、編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與水解膠體狀幾丁質生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖的幾丁質酶(Chitinase)F，編碼這個酶基因及其應用。所述幾丁質酶F的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，編碼基因如SEQ?ID?No.2所示。本發明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節幾丁質水解以及N-乙酰-D-氨基葡萄糖合成基因的表達，賦予宿主幾丁質酶F的高表達性，為擴大幾丁質酶F的生物應用提供了有效途徑，具有重大應用前景。
【專利說明】冬蟲夏草中國被毛孢幾丁質酶F、編碼基因及其應用 (一）
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一個來自"百令"生產菌冬蟲夏草中國被毛孢幾丁質酶（Chitinase)F， 編碼這個酶的基因及其應用。 (二）
【背景技術】
[0002] 冬蟲夏草（Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲（Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸 體上的復合體（包括子座和蟲體）。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產 物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其 多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎 二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳 痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏 草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物 活性。
[0003] 冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段（無性型）和子囊孢 子階段（有性型）。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草 菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、 活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證 明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
[0004] 但是，對冬蟲夏草中國被毛孢機制機理的研究幾乎為空白，尤其在中國被毛孢侵 染蝙蝠蛾幼蟲的機制機理上。
[0005] 幾丁質（chitin)又稱甲殼素、甲殼質，為白色或灰白色無定型半透明固體， 溶于濃鹽酸、硫酸、冰乙酸和78-97 %磷酸及無水甲酸，也可溶于某些配合物熔劑中，如 LiCl/DMAC，不溶于水、稀酸、堿、醇及其他有機熔劑。它是由N-乙酰氨基葡萄糖（NAG)以 β_1，4-糖苷鍵聚合而成的直鏈大分子，其結構與纖維素相似，只是在纖維素的C(2)原子 上的-0H基被-NHC0CH取代，但二者的性質存在極大的不同。幾丁質自然界每年生物合成 的幾丁質約100億噸，在所有天然多聚物中儲量占第二位，僅次于纖維素。幾丁質廣泛分布 于甲殼類動物和昆蟲的外殼以及昆蟲的中腸圍食膜中，另外與其他物質一起構成大多數真 菌細胞壁的骨架，幾丁質酶是昆蟲體壁的主要組成部分，占體壁干重的17% -50%。
[0006] 幾丁質酶是分解幾丁質的一類蛋白質，許多動物、植物、微生物都可產生幾丁質 酶。1905年Becneck首次在蝕幾丁質內克氏茵Bacillus chitinovorus中發現幾丁質酶以 來，作為幾丁質主要的生物降解酶類，幾丁質酶的研究受到廣泛重視。迄今為止已建立了一 整套酶學研究方法。對各種幾丁質酶來源的理化性質、生物學結構包括幾丁質酶的高級結 構、一級結構和核苷酸順序以及酶作用機理等方面進行了大量研究。幾丁質酶以其兼具抑 制病原真菌生長和殺滅害蟲的雙重作用，且對動植物、人體無害，不污染環境的優勢，而在 植物病蟲害無公害防治方面極有研究和利用價值。
[0007] 絕大多數的細菌性幾丁質酶屬于第18家族，其主要功能是分解周圍環境中的幾 丁質，以滿足其自身對營養的需求，而對真菌的抑制能力較弱或無。植物產生的幾丁質酶大 部分為第19族糖基化水解酶類，其功能主要是抑制病原真菌的生長，進行自我防御。某些 鏈霉菌和土壤中的細菌也能產生具殺真菌活性的19族幾丁質酶。
[0008] 幾丁質酶是一種具有廣泛應用前景的酶類，對它的利用在很大程度上直接依賴于 幾丁質酶基因的結構及功能的研究。隨著DNA重組技術的發展，國際上廣泛開展了幾丁質 酶基因的分離工作。
[0009] 1905年Benecke首次分離了可利用幾丁質作為營養物質的微生物并命名為 Bacilus chhinovorus。1921年Folpmers首次發現分解幾丁質的真菌、細菌和放線菌在含 有幾丁質的瓊脂上形成透明圈，證明了培養物中含有水溶性的幾丁質酶。1929年Karrer 等用蝸牛腸道酶使幾丁質轉化成N-乙酰氨基葡萄糖，間接地表明幾丁質的組成成分。1931 年Grassmann等發現Aspergi lus的提取物能把幾丁質水解成碘可檢測出來的還原性物質。 1938年ZobeH等研究了海水中分解幾丁質酶的細菌，推測幾丁質的分解是由糖苷鍵斷裂或 氨基基團的脫落造成的。1938年Zechmeister等證明杏乳中含幾丁質酶等多種水解酶。 1961年Jeuniaux等從蝸牛腸道中分離的細菌和土壤中的放線菌也能產生胞外幾丁質酶。 2000年Hiramatsu等還發現一些病毒如Chlorella virus也能產生幾丁質酶，這樣把幾丁 質酶產生生物擴展到幾乎整個生物界。目前，人們已經從多種微生物、植物和動物體中分離 到幾丁質酶，并對其理化性質作了相關研究。
[0010] S. marcescens可以產生5種幾丁質酶，它們的分子量分別為21、36、48、52和 57kDa。1986年，Fuchs等用EcoR I內切酶不完全酶切pLAFRI質粒構建了粘端文庫，轉化 到E.coli后利用幾丁質平板篩選出能降解幾丁質的4個不同克隆。該克隆子（重組子） 插入片段為22?27kb，亞克隆后得到一個9. 5kb編碼75KDa幾丁質酶的基因。該研究開啟 了微生物幾丁質酶基因克隆的先河。1986年，Wortman等在對Vibrio vulnifiels的幾丁 質酶基因克隆時，采用了 [3H]標記的幾丁質為底物，利用液體閃爍計數器監測分解出的可 溶性產物。1988年，Robbins等用4-Methylumbelliferyl(4_MU)糖苷的氨基葡萄寡糖作為 底物，來檢測Streptomyces plicatus的幾丁質酶基因在E. coli中的表達。
[0011] 1993年，Tsujibo等通過將海洋中分離出Alteromonas sp. Strain〇-7的幾丁質 酶基因克隆到表達載體大腸桿菌JM109中，結果表明，產生的幾丁質酶不分泌到胞外培養 基中，而是在壁膜間隙中聚集。此外，該研究團隊利用定點誘變技術克隆到Aheromonas sp. StrainO-7的chi85基因中的保守序列，并研究了該保守序列的作用，結果表明， Asp-290和Glu-292對chi85幾丁質酶的作用是十分必要的。
[0012] 1993年，Miyashita等克隆了 S. lividans的幾丁質酶基因（ch/A)，在對其序列進 行分析后發現，該幾丁質酶的基因序列與其他Str印tomyces幾丁質酶的基因序列沒有任 何同源性，但該基因序列內包含的催化部位和類型III重復單位的C端與B. circulars幾丁 質酶D的基因序列有36%的同源性。1993年，Fujii等克隆的S. lividans幾丁質酶C基 因，得到2kb的片段包含2個方向相反的開放閱讀框（0RF1和0RF2)，Northern雜交后結果 表明，只有0RF1的互補mRNA才被轉錄，說明該基因在表達時受到幾丁質的誘導和萄萄糖的 抑制。
[0013] 1994 年，Ueda 等將 Aeromonas sp. No. 10S-24 的幾丁質酶 II 基因克隆得到 1626bp 的基因編碼序列，可編碼542個氨基酸，分析后發現該段序列含有一個信號肽。1997年， Chernin等從成團腸桿菌Enterobacter agglomerans中克隆得到的幾丁質酶基因，進行全 序列分析后發現，該序列包含一個編碼562個氨基酸的開放閱讀框，形成一個有引導多肽 的61kDa的蛋白前體，對該基因進行表達后發現能產生和分泌幾丁質酶。通過對Fusarium oxyspomm的孢子萌發抑制試驗證明了該轉基因菌在體外具有抗真菌活性，且可抑制平板上 的Rhizoctonia solani和溫室中引起棉花幼苗根腐病的真菌生長。
[0014] 1999 年，Tanaka 等發現嗜熱古細菌 Pyrococcus kodakaraensis K0D1 能產生胞外 幾丁質酶并克隆了幾丁質酶基因。對其序列分析表明，該序列長3645bp，可編碼1215個氨 基酸，分子量為134. 259kDa，這是目前已知產酶分子量最大的菌株。1997年，Morimoto等 克隆的Clostridium paraputriftcum的c基因，其核苷酸序列長2493bp，為一個獨立的開 放閱讀框，編碼831個氨基酸。該酶的分子量也較大，約為90kDa。
[0015] 2001年，Thiery等從南極冰蓋的海底分離得到的革蘭氏陽性菌Arthrobacter亞 種菌株TAD20中克隆得到幾丁質酶基因，通過研究該菌株主要分泌2種幾丁質酶chiF和 chiB〇
[0016] 2008年，Ζ· Η· Liu等從Chaetomium globosum中克隆到了一個新的幾丁質酶，并在 畢赤酵母中進行了表達。對這個新酶的酶學性質進行了研究，最適轉化溫度為45°C，最適 pH為5. 0,并且在5mmol/L的Cu2+條件下有最大酶活，可以達到1. 42U/ml。
[0017] 2009年，Chi-Yea Yang等從臺灣土豆中新分離到一株新的菌株Bacillus subtilis，并且中這株菌中克隆得到了具有抗真菌活性的幾丁質酶基因。這個基因的開放 讀碼框長度為1791bp，編碼595個氨基酸序列。構建重組質粒轉化至大腸桿菌中具有幾丁 質酶活性，并且能使水稻紋枯病菌致病活性下降90%以上。
[0018] 在國內，有關微生物幾丁質酶基因克隆研究較少。1998年，彭輝銀等將核型多角體 病毒（HaSNP:V)的幾丁質酶基因分別定位，獲得RXbal-H片段克隆。1998年，鄭洪武等克隆 了環狀芽孢桿菌C-2的幾丁質酶基因。2002年，周櫻等從廈門海域分離到了一株高效幾丁 質降解菌一豚鼠氣單胞菌CB101 (Aeromonas caviae)，它能產生并分泌多種分子量不同的 幾丁質酶。熊國如等通過將枯草芽孢桿菌XF-1的發酵液進行硫酸銨沉淀、高溫加熱處理、 SDS-PAGE電泳、氨基酸測序后發現一種耐熱幾丁質酶，并對該耐熱幾丁質酶進行了克隆，該 幾丁質酶對根腫病菌孢子有一定的裂解作用。
[0019] 2003年，中國農科院煙草所首次將來源于桿狀病毒的幾丁質酶基因構建在表達載 體上，并導入煙草，經PCR和Western Blot等方法檢測，得到了轉幾丁質酶基因的轉基因煙 草株系。酶活性測定的結果表明，外源幾丁質酶基因在煙草中得到了表達，并產生了生物學 活性，轉基因株系的幾丁質酶活性比未轉基因的親本高。
[0020] 但是，目前NCBI數據庫中目前還檢索不到中國被毛孢中幾丁質酶的基因相關信 肩、。 (三）
【發明內容】
[0021] 本發明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對"百令"生產菌冬 蟲夏草中國被毛孢侵染機制中的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了"百令"生產菌冬蟲 夏草中國被毛孢侵染機制幾丁質酶F、以及編碼的基因及其應用。
[0022] 本發明采用的技術方案是：
[0023] -種參與中國被毛孢侵染機制的幾丁質酶F，與SEQ ID No. 1所示序列具有90% 以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的肽蛋白 的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白 變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發明保護范圍之列。具體的所述改變 可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的 氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有 非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0024] 優選的，本發明述幾丁質酶F來自"百令"生產菌冬蟲夏草中國被毛孢，所述幾丁 質酶F氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示（記為chiF蛋白）；該酶可催化膠體狀幾丁質溶液 制備相應的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
[0025] 由膠體狀幾丁質獲得對應N-乙酰-D-氨基葡萄糖的路徑如下所示：
[0026]
【權利要求】
1. 一種冬蟲夏草中國被毛孢幾丁質酶F，其特征在于所述幾丁質酶F的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2. 如權利要求1所述的幾丁質酶F在生物催化膠體幾丁質生成N-乙酰-D-氨基葡萄 糖中的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用為：將含幾丁質酶F重組工程菌 經誘導培養后的濕菌體用PH8. 0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎，離心，取上清液作為催化 齊U，以膠體幾丁質溶液為底物，于pH值為4. 6的醋酸緩沖液中，37°C下反應，反應結束后，將 反應液離心，取上清液，獲得含N-乙酰-D-氨基葡萄糖的混合液； 所述膠體幾丁質溶液按如下方法制備：將幾丁質粉末加入丙酮中研磨至糊狀，在l〇°C 下邊研磨邊慢慢加入濃鹽酸，用濾紙過濾，然后將濾液緩緩加入到劇烈攪拌的體積濃度 50%乙醇水溶液中，析出沉淀，離心去上清液，收集膠體幾丁質，用蒸餾水a沖洗數次至中 性，混懸于蒸餾水b中即為膠體幾丁質溶液；所述濃鹽酸的體積用量以幾丁質粉末質量幾 為40mL/g，所述蒸饋水b的體積用量以幾丁質粉末質量幾為100mL/g。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述底物的體積用量以幾丁質粉質量計，終 濃度為3. 33mg/L ;所述催化劑的用量以超聲破碎前濕菌體的質量計，終濃度為8. 2g/L。
5. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將含幾丁質酶 F的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養基中，37°C、250r/min 培養過夜，取培養物，以體積濃度2%的接種量轉接于50mL含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液 體培養基中，37°C、250r/min培養至菌體濃度0D600為0. 6?0. 8,向培養物中加入終濃度 0. 05mmol/L的IPTG誘導培養8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下超 聲破碎，離心，取上清液即為催化劑。
6. -種編碼權利要求1所述幾丁質酶F的基因。
7. 如權利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
8. 如權利要求6或7所述的編碼基因在構建能夠生物催化膠體狀幾丁質生成N-乙 酰-D-氨基葡萄糖的基因工程菌中的應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的應用為：構建含有所述幾丁質酶F基 因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養， 培養液分離純化獲得含有幾丁質酶F基因的菌體細胞。
【文檔編號】C12N1/21GK104120116SQ201410307574
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】柳志強, 鄭裕國, 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 王鴻艷 申請人:浙江工業大學, 杭州中美華東制藥有限公司