狀、尺寸等，本領域技術人員可以根據需要合理設計，而不應當局限于本實施例所給出的具體結構。只是在一般情況下，主溝道的長度介于3_?10_之間，其高度介于20 μπι?500 μm之間。
[0038]本實施例中，基底采用透明玻璃片，溝道形成層由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，簡稱PDMS)制作。而在本發明其他實施例中，還可以采用有機塑料片、A1203片、MgO片作為基底，還可以采用玻璃、石英、聚甲基丙烯酸甲酯等材料制作溝道形成層。
[0039]圖3A為圖1所示微流控芯片的一條骨細胞培養溝道中主溝道的示意圖。如圖3A所示，在主溝道的底壁，即透明玻璃的上表面形成有二維網格圖案。
[0040]圖3B為圖3A所示主溝道表面二維網格圖案的示意圖。請參照圖3B，在網格節點(直徑范圍20 μπι?25 μπι)位置以及相鄰網格節點橫向和縱向連接位置的玻璃基底上修飾有膠原，而在主溝道底部網眼位置的玻璃基底上，沉積有金薄膜，并且在金薄膜上修飾有硫醇分子。
[0041]請參照圖3Β，有硫醇修飾金薄膜的基底位置，限制了骨細胞的貼附，如黑色部分所示。有膠原修飾的基底位置，骨細胞可以貼附其上，并且沿水平方向伸出細胞突觸，并在細胞突觸之間形成連接，如圖白色部分所示。
[0042]需要說明的是，為了保證膠原活性，做實驗之前再進行膠原修飾。若能保證其活性，商品化的產品可以事先進行膠原修飾。
[0043]請參照圖3C，在骨細胞培養溝道進口一側的PDMS溝道形成層上具有三個圓形的流體進口 -中流體進口、左流體進口和右流體進口。該三個流體進口可以通過滴管或者注射栗注入液體，并通過相應的從溝道匯流至主溝道中。
[0044]在不同階段，三個流體進口所起到的作用是不同的:
[0045](1)在細胞接種和換液階段，三個流體進口均可以通入相應的溶液；
[0046](2)在固化細胞階段，中間位置的中流體進口用于通入海藻酸鈉溶液，兩側的左流體進口和右流體進口用于通入氯化鈣溶液。海藻酸鈉與氯化鈣在通過各自的從溝道流入主溝道后發生反應生成海藻酸鈣聚合物，通過調節流速，使海藻酸鈣聚合物覆蓋在骨細胞上，填充于主溝道的中間位置并在兩側露出可供流體通過的通道，使靠近主溝道兩側的骨細胞突觸被露出，如圖4所示。
[0047]最終，前端中間的中流體進口以及后端的流體出口會被反應生成的海藻酸鈣聚合物填充封閉。
[0048]本領域技術人員應當清楚，海藻酸鈣聚合物固定層可以使海藻酸鈣聚合物選擇性覆蓋兩側細胞的細胞體并且露出突觸部分，這樣在突觸部位對流體應力就有了放大的作用，進而構成骨細胞的三維體外微環境。
[0049](3)在觀測階段，將PBS通過左流體進口和右流體進口通入主溝道，并通過抽吸液體形成振蕩流體對細胞提供流體沖擊，研究靠近溝道壁兩側的骨細胞在其影響下的細胞響應。
[0050]以下介紹如上所述重建骨細胞微環境的微流控芯片的制備方法。請參照圖5，本實施例微流控芯片制備方法包括:
[0051]步驟S102:制作溝道形成層；
[0052]該制作溝道形成層的步驟又可以包括:
[0053]子步驟S102a:光刻膠SU 8-5制作種子層:
[0054]載玻片依次經過丙酮、乙醇和去離子水清洗后，烘干表面均勻旋轉涂敷一層SU-85，經曝光后形成種子層，如圖6中A圖所示。
[0055]子步驟S102b:光刻膠SU 8-2100制作陽模:
[0056]在種子層上均勻旋涂一層SU 8-2100，放上掩模版后經紫外曝光，見圖6中子圖B ;顯影、堅膜得到細胞培養微溝道陽模，如圖6中C圖所示。
[0057]子步驟S102c:PDMS的澆注、翻模與打孔
[0058]細胞培養微溝道陽模在澆筑PDMS固化、翻模得到骨細胞培養溝道的PDMS翻模，在骨細胞培養溝道兩端打孔完成微流控芯片的溝道形成層的制作，如圖6中D圖、E圖、F圖所不ο
[0059]步驟S104:制作具有二維網格圖案的基底；
[0060]該制作具有二維網格圖案的基底的步驟又可以包括:
[0061]子步驟S104a:光刻膠AZ1500制作掩膜；
[0062]載玻片經過丙酮、乙醇和去離子水清洗后嗎，烘干表面并均勻旋轉涂覆一層AZ1500型光刻膠，放上掩膜版后經曝光顯影后制成光刻膠掩膜，如圖6中G圖、Η圖、I圖所不ο
[0063]子步驟S104b:鈦、金的濺射及剝離:
[0064]在具有光刻膠掩膜的載玻片表面先后濺射鈦層和金層，如圖6中J圖所示。將載玻片放入丙酮中超聲處理，光刻膠掩膜及其表面的金屬層被剝離，直接濺射在玻璃表面的金屬層被保留，用隊吹干后得到來了以金和玻璃為基底的二維網格圖案，如圖6中K圖所不ο
[0065]步驟S106:溝道形成層與基底鍵合，如圖6中L圖所示。
[0066]步驟S108:金表面硫醇修飾:
[0067]在微流控芯片的骨細胞培養溝道中的主溝道的二維網格圖案上金表面進行硫醇修飾。將硫醇/乙醇溶液加入溝道中，靜置24小時。用無水乙醇沖洗干凈，用37°C烘箱吹干，如圖6中Μ圖所示。
[0068]以下介紹如上所述重建骨細胞微環境的微流控芯片的使用方法。請參照圖7，本實施例微流控芯片使用方法包括:
[0069]步驟S202:微溝道基底表面修飾:
[0070]在進行實驗之前，在微流控芯片的骨細胞培養溝道中的主溝道的二維網格圖案上網格節點位置以及相鄰網格節點橫向和縱向連接的位置的表面上修飾膠原。
[0071]具體而言:用移液槍對準微溝道一側進口，向微溝道內包括兩端的液滴進口全部打滿70%的酒精溶液對微溝道進行滅菌處理；待酒精揮發干凈，在進口中全部打滿磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，清洗3次。再向芯片微流道中注入膠原溶液，靜置4小時，使溶液中的膠原分子沉降于微溝道底面，形成修飾層，最后使用培養液將微溝道沖洗干凈并浸泡、靜置過夜，以便于后期骨細胞的接種。
[0072]步驟S204:在骨細胞培養溝道內進行骨細胞接種；
[0073]具體而言:與修飾方法類似，依靠重力作用接種細胞。將培養在培養瓶中的骨細胞消化、離心，再加入新鮮培養液配置成濃度為5X105個/ml的細胞懸液。吸出培養基，用兩只移液槍同時吸取細胞懸液，左流體進口，中流體進口及右流體進口中加入20 μ 1，流體出口中加入15 μ 1。將芯片原地靜置約5分鐘，待主溝道內溶液穩定、細胞沉降，便可將芯片放于顯微鏡下觀察記錄接種的密度和均勻程度等情況，最后將芯片放入37°c、C02濃度為5%的培養箱中培養。
[0074]本實施例中，在主溝道的一側設置了位置標記，方形小標記的數量代表微溝道位置的序號。利用此標記可以清楚地分析微溝道內細胞的分布情況。
[0075]步驟S206:在骨細胞培養溝道內對骨細胞進行培養；
[0076]本實施例中，每間隔12小時，就用移液槍吸出三個流體進口和出口的舊溶液，并用移液槍在三個流體進口及出口中同時滴入20 μ 1新鮮培養基，為骨細胞提供必要的營養物質。兩端同時加入相同體積培養基可以消除微溝道兩端液面差，保證主溝道內沒有液體流動，消除流體剪切力作用而影響骨細胞生長的可能性。
[0077]步驟S208:海藻酸鈣聚合物固定:待細胞在主溝道內貼壁良好后，用管子將進口和注射栗相連，中流體進口通入海藻酸鈉，左流體進口和右流體進口通入氯化鈣，通過調整注射栗流速來調整液體流速，以使海藻酸鈉和氯化鈣反應生成的海藻酸鈣聚合物覆蓋在骨細胞上，填充于溝道的中間位置并在兩側露出可供流體通過的通道，使靠近溝道兩側的骨細胞的突觸被露出，如圖4所示。
[0078]以下述尺寸的芯片為例:通入氯化鈣以及海藻酸鈉的三條從溝道(中從溝道、左從溝道和右從溝道)的高度為100 μm，寬度為100 μm，主溝道高度100 μm，寬度300 μπι。氯化鈣流速每分鐘2 μ 1，海藻酸鈉流速每分鐘2 μ 1，可以在主通道中央形成寬度為100 μ m左右的海藻酸鈣聚合物。這樣海藻酸鈣聚合物可以蓋住一部分骨細胞的細胞體，露出細胞突觸，這樣就形成了類似生理環境中突觸周圍所需要的微尺寸溝道，加上骨細胞可以沿著金基底所形成的結構貼壁伸長構成二維網格，這樣就構成了類似生理條件的骨細胞的三維體外微環境。
[0079]步驟S210:結構表征:海藻酸鈣聚合物固定后，通過掃描電鏡檢查海藻酸鈣聚合物蓋住細胞的情況，觀察骨細胞微環境重建情況。在確定骨細胞突觸伸出海藻酸鈣聚合物而細胞體被海藻酸鈣聚合物包裹的情況下，進行后續實驗；
[0080]步驟S212:引入流體振蕩流觀測骨細胞響應:在步驟S208中海藻酸鈣聚合物固化后在兩側形成了通道，通過在左從溝道和右從溝道引入可控制流體，流體的沖刷可以對骨細胞產生應力刺激，進而使用免疫熒光或