一種增加免疫細胞得率的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種增加免疫細胞得率的方法。
【背景技術】
[0002] 免疫細胞具有自然殺傷和自我保護的特征，其中淋巴細胞具有免疫調節和自我復 制等特點，針對病毒、細菌、真菌感染的治療均起到關鍵的作用，應用免疫細胞進行的免疫 細胞療法在癌癥治療中具有很大的臨床應用價值。免疫細胞療法目前主要包括細胞因子誘 導的殺傷細胞(CIK)療法、樹突狀細胞(DC)療法、DC-CIK細胞療法、自然殺傷細胞(NK)療法、 DC-T細胞療法等。
[0003] 在健康人體的血液中含有豐富的免疫細胞，隨著老齡化、亞健康、患上各種疾病等 原因，血液中免疫細胞的數量會明顯呈下降趨勢，增殖分化能力降低;而異體的免疫細胞移 植則可能引起患者體內的免疫排斥反應;如何增加免疫細胞的得率直接影響了免疫細胞療 法的臨床應用，現有技術中一般通過以下兩個方面獲得免疫細胞，一是直接從血液中提取 免疫細胞，二是考慮通過后期誘導分化擴增免疫細胞。
[0004] 目前關于血液免疫細胞的分離和擴增方法不一，且大多步驟復雜，獲得較多數量 血液免疫細胞也存在一定難度，在患者患病時采集血液也給患者造成二次傷害，并且減少 身體的免疫細胞，降低抵抗力，所以在健康時采集的血液如何高效簡單的分離更多的免疫 細胞、保存和擴增成為免疫細胞治療必須解決的問題，現有技術中已經存在從血液中分離 免疫細胞的方法，但是該類免疫細胞分離過程中，對于細胞在凍存過程中的保護有限，細胞 在凍存過程中容易受到損傷，在培養過程中的擴增數量也有十分有限。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有技術中存在的問題，提供一種增加免疫細胞得率的方法，通過保 存健康時的細胞，并在凍存過程中有效的保持細胞的活性，在擴增培養中能得到較高倍數 的擴增和較高純度的細胞，從而增加了免疫細胞的得率。
[0006] 本發明通過以下技術方案實現該目的：
[0007] -種增加免疫細胞得率的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)采集人外周血，用生理鹽水稀釋，制得血液稀釋液，外周血與生理鹽水的體積比 為1:5~5:1;
[0009] 2)將Ficoll分離液加入sepmate離心管的底部，將步驟1)中的血液稀釋液緩慢的 加到Ficoll分離液上層，血液稀釋液與Ficoll分離液的體積比為1:5~5:1，離心機400~ 1000g離心10~30min，分離外周血免疫細胞，洗滌二次離心收集外周血單個核細胞；
[0010] 3)免疫細胞的凍存:將步驟2)收集的免疫細胞利用人血白蛋白重懸，向制得的細 胞懸液中加入細胞凍存液，搖勻分裝至凍存管后移至程序降溫儀，進行程序降溫，降至-80 °C后，轉移至液氮罐；所述細胞凍存液由茶多酚、人血白蛋白和DMS0組成，人血白蛋白與 DMS0的體積比為2~8:1;
[0011] 4)免疫細胞的復蘇:將步驟3)凍存的凍存管從液氮罐匯中取出，水浴溶解后將凍 存管中的細胞懸液轉移至X-VIV015培養基中，細胞懸液與X-VIV015培養基的體積比為1:4 ~10,混勻后洗滌離心，將洗滌離心后的PBMC用X-VIV015培養基重懸，接種于培養瓶中；
[0012] 5)免疫細胞的誘導擴增培養:對步驟4)的培養瓶中的細胞懸液進行誘導擴增培 養，在誘導擴增培養的過程中加入了海帶多糖。
[0013] 其中，步驟3)的細胞凍存液的配制方法:將茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的終 濃度為1~10mg/mL，按體積比人血白蛋白：DMS0 = 2~8:1，緩慢的加入DMS0，得到細胞凍存 液。
[0014] 其中，步驟3)的凍存過程具體為:將步驟2)收集的免疫細胞利用人血白蛋白重懸， 再將上述細胞凍存液緩慢加入到細胞懸液中，細胞凍存液中人血白蛋白與DMS0的體積比為 5~17:1，茶多酸的終濃度為1~10mg/mL。
[0015] 作為優選的，步驟3)的凍存管中免疫細胞的密度為2~6X106個/mL。
[0016] 其中，步驟4)的凍存管從液氮罐匯中取出后，置于37°C恒溫水浴，2min內完成溶 解，轉移至X-VIV015培養基中，混勻后200~600g離心5~15min。
[0017] 作為優選的，步驟4)的培養瓶中接種密度為1X106個/mL。
[0018] 其中，NK細胞的誘導擴增培養方法：
[0019] 6)向步驟4)的免疫細胞懸液中全量添加細胞生長因子IL-2JL-15JL-21、海帶多 糖，其終濃度分別為 200 ~1000U/mL、200 ~1000U/mL、200 ~1000U/mL、15 ~120ug/mL，按總 體積5~20 %的量添加胎牛血清；
[0020] 7)定期補充新鮮的X-VIV015培養基和11^-2、幾-15、幾-21、海帶多糖、胎牛血清，使 得免疫細胞的密度不大于3X106個/mL;
[0021] 8)連續培養12~16天。
[0022]其中，CIK細胞的誘導擴增培養方法：
[0023] 9)向步驟4)的免疫細胞懸液中全量添加細胞因子IFN-γ，使終濃度為200~ 10001]/11^，按總體積5~20%的量添加胎牛血清；
[0024] 10)第二天全量添加細胞生長因子IL-2、海帶多糖，使終濃度分別為200~1000U/ mL、15~120ug/mL;
[0025] 11)定期補充新鮮的X-VIV015培養基和IL-2、胎牛血清，使得免疫細胞的密度不大 于3X106 個/mL;
[0026] 12)連續培養12~16天。
[0027] 相對于現有技術，本發明的有益效果為:本發明的增加免疫細胞得率的方法，包括 人外周血稀釋、免疫細胞的分離、凍存、復蘇及誘導擴增培養步驟，通過提取、保存健康時的 細胞，并在后期誘導擴增培養，大大提高了免疫細胞的得率，在凍存的過程中采用特有的細 胞凍存液可有效的保持免疫細胞的活性，在誘導擴增培養的過程中加入了海帶多糖，能夠 得到較高倍數的擴增和較高純度的細胞，從而顯著增加了免疫細胞的得率。
【附圖說明】
[0028]圖1為實施例9擴增培養后的NK細胞形態觀察圖。
[0029]圖2為對照例1擴增培養后的NK細胞形態觀察圖。
[0030]圖3為實施例12擴增培養后的CIK細胞形態觀察圖。
[0031 ]圖4為對照例2擴增培養后的CIK細胞形態觀察圖。
[0032]圖5為擴增培養后的NK細胞增殖曲線圖。
[0033]圖6為擴增培養后的CIK細胞增殖曲線圖。
【具體實施方式】
[0034]以下結合附圖及具體實施例對本發明進行詳細描述。
[0035]實施例1、免疫細胞的分離
[0036] 1)采集人外周血，用生理鹽水稀釋，制得血液稀釋液，外周血與生理鹽水的體積比 為 1:5;
[0037] 2)將Ficoll分離液加入sepmate離心管的底部，將步驟1)中的血液稀釋液緩慢的 加到Ficο11分離液上層，血液稀釋液與Ficο11分離液的體積比為1: 5，離心機4 0 0g離心 30min，分離外周血免疫細胞，洗滌二次離心收集外周血單個核細胞。
[0038]實施例2、免疫細胞的分離
[0039] 1)采集人外周血，用生理鹽水稀釋，制得血液稀釋液，外周血與生理鹽水的體積比 為5山
[0040] 2)將Ficoll分離液加入sepmate離心管的底部，將步驟1)中的血液稀釋液緩慢的 加到Ficoll分離液上層，血液稀釋液與Ficoll分離液的體積比為5:1，離心機700g離心 20min，分離外周血免疫細胞，洗滌二次離心收集外周血單個核細胞。
[0041]實施例3、免疫細胞的分離
[0042] 1)采集人外周血，用生理鹽水稀釋，制得血液稀釋液，外周血與生理鹽水的體積比 為 1:1;
[0043] 2)將Ficoll分離液加入sepmate離心管的底部，將步驟1)中的血液稀釋液緩慢的 加到Ficoll分離液上層，血液稀釋液與Ficoll分離液的體積比為1:1，離心機1000g離心 10min，分離外周血免疫細胞，洗滌二次離心收集外周血單個核細胞。
[0044] 實施例4、免疫細胞的凍存
[0045] 細胞凍存液:將茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的終濃度為lmg/mL，按體積比人 血白蛋白：DMS0 = 2:1，緩慢的加入DMS0，得到細胞凍存液。
[0046] 將收集的免疫細胞利用人血白蛋白重懸，再將上述細胞凍存液緩慢加入到細胞懸 液中，細胞凍存液中人血白蛋白與DMS0的體積比為5:1，免疫細胞凍存密度為2X106個/mL。
[0047] 實施例5、免疫細胞的凍存
[0048]細胞凍存液:將茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的終濃度為10mg/mL，按體積比 人血白蛋白：DMS0 = 8:1，緩慢的加入DMS0，得到細胞凍存液。
[0049] 將收集的免疫細胞利用人血白蛋白重懸，再將上述細胞凍存液緩慢加入到細胞懸 液中，細胞凍存液中人血白蛋白與DMS0的體積比為17:1，免疫細胞凍存密度為6X106個/ mL〇
[0050] 實施例6、免疫細胞的凍存
[0051 ]細胞凍存液:將茶多酚加入人血白蛋白中，茶多酚的終濃度為5mg/mL，按體積比人 血白蛋白：DMS0 = 5:1，緩慢的加入DMS0，得到細胞凍存液。
[0052] 將收集的免疫細胞利用人血白蛋白重懸，再將上述細胞凍存液緩慢加入到細胞懸 液中，細胞凍存液中人血白蛋白與DMS0的體積比為10:1，免疫細胞凍存密度為3X106個/ mL〇
[0053] 實施例7、免疫細胞的復蘇誘導擴增NK細胞
[0054]取實施例4、5或6的凍存管水浴溶解后，將凍存管中的細胞懸液轉移至X-VIV015培 養基中，細胞懸液與X-VIV015培養基的體積比為1:4,混勻后200g離心5min，將洗滌離心后 的PBMC用X-VIV015培養基重懸，接種于培養瓶中；
[0055]向上述免疫細胞懸液中全量添加細胞生長因子11^-2、幾-15、幾-21、海帶多糖，其 終濃度分別為2001]/11^、2001]/1^、2001]/1^、151^/1^，按總體積5%的量添加胎牛血清；定期 補充新鮮的X-VIV015培養基和11^-2、幾-15、幾-21、海帶多糖、胎牛血清，使得免疫細胞的密 度不大于3X106個/mL;連續培養12~16天。
[0056]實施例8、免疫細胞的復蘇誘導擴增NK細胞
[0057]取實施例4、5或6的凍存管水浴溶解后，將凍存管中的細胞懸液轉移至X-VIV015培 養基中，細胞懸液與X-VIV015培養基的體積比為1:10,混勻后600g離心15min，將洗滌離心 后的PBMC用X-VIV015培養基重懸，接種于培養瓶中；
[0058]向上述免疫細胞懸液中全量添加細胞生長因子11^-2、幾-15、幾-21、海帶多糖，其 終濃度分別為10001]/11^、10001]/11^、10001]/11^、1201^/1^，按總體積20%的量添加胎牛血清 ； 定期補充新鮮的X-VIV015培養基和11^-2、幾-15