級聯激活的免疫細胞、制備方法以及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種級聯激活的免疫細胞、制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]CD3體外活化T細胞在特定細胞因子環境下會引起其他細胞，特別是抗原呈遞細胞(APC)的激活。抗原呈遞細胞，也被稱為信息細胞，在血液中循環，并提呈外源蛋白，腫瘤蛋白作為變異的非自體抗原也可被其提呈。在APC中，樹突狀細胞(DC)是抗原提呈效力最高的一種細胞，DC可通過特定細胞因子(如IL-4、GMCSF)活化外周血中的單細胞(monocytes)獲得，腫瘤抗原加DC現正作為腫瘤疫苗在腫瘤治療方面進行實驗。如果未經活化的T細胞被加入到活化的呈遞腫瘤抗原的APC中，T細胞的活化和啟動可通過特異性I細胞受體完成，從而獲得特異性識別和殺傷腫瘤的能力。這種利用抗原呈遞細胞結合抗CD3單克隆抗體及特定細胞因子的兩步法鏈式反應激活的細胞被稱為CAPRI細胞。CAPRI細胞療法的效應細胞(具有殺傷腫瘤細胞能力的細胞)有兩種:以CD4+和CD8+為主的T輔助細胞和T殺傷細胞(細胞毒細胞)，約占80 %，以⑶3+和⑶56+為主的NKT細胞、以及NK細胞和樹突狀細胞(DC)，這部分效應細胞約占20%。
【發明內容】
[0003]本發明的目的之一在于提供一種新的激活的免疫細胞的制備方法。
[0004]實現上述目的的技術方案如下:
[0005]一種激活的免疫細胞的制備方法，包括以下步驟:
[0006]分離得到外周血單核細胞；
[0007]分離后的單核細胞與⑶3抗體共培養2?4小時后，加入干擾素γ共培養20?24小時，初級刺激單核細胞，進入初級刺激孵育期；
[0008]加入11-2(白細胞介素-2)、11^-4(白細胞介素-4)、11^-1(白細胞介素-1)和巨噬細胞集落刺激因子，進一步活化培養70?72小時，從而進入連續刺激效應細胞表達，得到級聯激活的免疫細胞。
[0009]在其中一個實施例中，進行培養時單核細胞的接種密度為I?2xl09/L，0.5ml/孔，所述⑶3的加入量為I?2ug，干擾素γ的加入量為1000?2000IU。
[0010]每孔中加入的所述IL-2、IL-4、IL-1和巨噬細胞集落刺激因子的量分別為:1000 ?2000IU、100 ?200ng、40 ?60ng 和 300 ?500ng。
[0011]本發明的另一個目的是提供一種級聯激活的免疫細胞。
[0012]具體技術方案如下。
[0013]一種級聯激活的免疫細胞，其通過上述制備方法得到。
[0014]本發明的另一目的是提供所述級聯激活的免疫細胞的應用。
[0015]具體技術方案如下。
[0016]上述級聯激活的免疫細胞，在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。
[0017]本發明的另一目的是提供一種治療乳腺癌的藥物。
[0018]具體技術方案如下。
[0019]一種治療乳腺癌的藥物，其活性成分包括有上述級聯激活的免疫細胞。
[0020]本發明的另一目的是提供一種治療惡性黑色素瘤的藥物。
[0021]具體技術方案如下。
[0022]上述活化后的級聯激活的免疫細胞，在制備治療惡性黑色素瘤的藥物中的應用。
[0023]具體技術方案如下。
[0024]一種治療惡性黑色素瘤的藥物，其活性成分包括有上述級聯激活的免疫細胞。
[0025]本發明的發明人通過長期的實驗，發現初級刺激外周血單核細胞過程中，CD3抗體和干擾素γ的加入順序和濃度的不同會對結果有較大影響，本發明的方案會對免疫細胞的增殖速率會有顯著的提升；且本發明提供方案所得到的免疫細胞(CAPRI)的效應細胞CD3+CD56+的比值也有顯著提升。鏈式激活的免疫細胞對乳腺癌細胞能有較好的裂解，且對惡性黑色素瘤細胞的增殖也有較好的抑制作用。CAPRI細胞用于臨床上，整個治療過程是安全的，沒有負面效果。在一周內即可獲得大量具有癌癥特異性CAPRI細胞，可用以對不同類型的癌癥進行有效的過繼性細胞治療。
【附圖說明】
[0026]圖1為實施例1中級聯激活的免疫細胞的制備步驟示意圖；
[0027]圖2為實施例2中CAPRI細胞培養過程中細胞狀態示意圖；
[0028]圖3為實施例2中細胞流式檢測示意圖；
[0029]圖4為實施例3中細胞增殖和流式檢測結果比對圖；
[0030]圖5為實施例4中級聯激活的CAPRI細胞對乳腺癌細胞的裂解測試結果示意圖；
[0031]圖6為實施例5中級聯激活的CAPRI細胞對惡性黑色素瘤細胞增殖的MTT抑制實驗檢測示意圖。
【具體實施方式】
[0032]實施例1
[0033]本實施例所述的級聯激活的免疫細胞通過以下方法得到。
[0034]1.單核細胞的獲得(見附圖1)
[0035]1.1新鮮乳腺癌患者外周血(山東省某醫學院附屬醫院患者提供)(肝素抗凝20u/ml)取樣(供后續檢測備用)，將剩余外周血與生理鹽水照按1:1稀釋；
[0036]1.2在50ml離心管中預先加入淋巴細胞分離液15ml，再加入稀釋好的外周血25ml ；
[0037]1.3小心的將稀釋后的血液加到分離液的上面；
[0038]1.4 離心:轉速:1500r/min，溫度 20。。?28。。，時間:20min ；
[0039]1.5離心管內順次為血漿一一單個核細胞層一一分離液一一紅細胞；
[0040]1.6用移液管吸出單個核細胞層，重懸于2?5倍體積的生理鹽水中；
[0041]1.7 離心:轉速:2000 ?2300r/min，時間:10min，溫度:4°C ；
[0042]1.8離心后，棄上清液，細胞沉淀重懸于Iml完全培養基中(含10 % FCS的RPM-1640 培養液)。
[0043]2.CD3抗體和干擾素γ，初級刺激單核細胞(見附圖1)
[0044]2.1調整細胞密度為I?2x109/L，放入48孔培養板，0.5ml/孔，⑶3的加入量為lug，置于37°C，5% C02的恒溫二氧化碳培養箱中培養4小時；
[0045]2.2每孔加入1500IU干擾素γ再次活化效應細胞；
[0046]2.3將初次激活的細胞置于37°C，5% C02的恒溫二氧化碳培養箱中培養20小時。
[0047]3.單核細胞的第二步激活(見附圖1)
[0048]3.1將2.3中培養20小時后培養物收集到50ml離心管中，750G離心8分鐘，去上清，用50ml RPMI1640重懸細胞，計數，離心。
[0049]3.2用完全培養基將所有細胞重懸，調整細胞密度為I?2xl09/L，放入48孔培養板，0.5ml/孔，加入IL-2、IL_4、IL-1和巨噬細胞集落刺激因子，每孔加入量分別為:1500IU、1500ng、50ng和 400ng。
[0050]3.3將培養板放置于37°C，5% C02的恒溫二氧化碳培養箱中培養72小時。
[0051]4.級聯激活的免疫細胞的擴增培養和收獲(見附圖1)
[0052]4.1將經72小時培養的培養物(CAPRI細胞)收集到50ml離心管中，750G離心8分鐘，去上清，用生理鹽水重懸細胞，計數，離心。
[0053]4.2再次離心后可得有活性的級聯激活的免疫細胞(CAPRI細胞)，用鹽水重懸后備用O
[0054]實施例2
[0055]1.按上述實施例1中方法獲得級聯激活的免疫細胞(CAPRI細胞)，期間進行細胞狀態觀察(