輔酶Q₁₀高產菌株選育快速篩選的方法

專利名稱：輔酶Q₁₀高產菌株選育快速篩選的方法
技術領域：
本發明涉及輔酶Qltl，尤其是涉及一種輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法。
背景技術：
輔酶Qltl是人類生命中不可缺少的重要元素之一。它是一種能激活人體細胞的能量、提高人體免疫力、增強細胞抗氧化能力和延緩衰老的重要生理活性物質，已經成為世界生物醫藥領域研究的熱點。近年來廣泛應用在保健品、化妝品和食品行業中。隨著輔酶Qiq需求的日益增長，各國學者都紛紛聚焦在輔酶Qltl的生產研究。目前的生產方法主要包括直接提取法、化學合成法和微生物發酵法，其中微生物發酵法最具有發展前途，是最可能實現工業化生產規模的生產方法。菌種篩選是提高菌種質量和穩定發酵水平的重要手段。由于菌株選育要經過初篩和復篩兩個階段，初篩的單菌落眾多，一般在500 1000個，如果采用比較繁瑣的測定方法勢必影響菌株篩選的效率。輔酶Qltl通常采用常規紫外分光光度法和高效液相色譜法進行檢測，這兩種檢測方法的缺點是:(1)常規的紫外分光度法因核酸和蛋白質等雜質的影響造成測定結果偏高，誤差大；(2)高效液相色譜法工序復雜耗時，無法測定大量樣品，效率較低，從而影響整體育種周期。((60Co Y射線對輔酶Qltl產生菌三孢布拉氏霉的誘變選育》(《西北農林科技大學學報》第34卷第4期)公開了一種輔酶Qltl產生菌三孢布拉氏霉的誘變選育方法，其篩選測定采用的方法是紫外分光光度法，通過蒸餾回流、石油醚萃取減壓濃縮，然后用薄層層析分離濃縮液中的輔酶Q10，并采用紫外分光光度法測定輔酶Qltl的含量。該方法雖然測定結果準確，但是輔酶Qltl樣品處理步驟繁瑣，處理大批量的樣品費時費力，篩選的效率較低，其中薄層層析其色澤深淺與樣品質量濃度呈正相關，只能半定量測定比較各突變菌株相對產量。《發酵菌體中輔酶Qltl的提取及其測定方法》(《無錫輕工大學學報》第22卷第2期)公開了一種提取及測定發酵菌體中輔酶Qltl的方法，該方法采用皂化提取純度較高的輔酶Qltl,通過紫外分光光度法測定具有很好的重現性和穩定性，但其提取步驟繁瑣，處理大量樣品耗時耗力，從而篩選的效率較低。《利用空間誘變選育輔酶Qltl高產菌》(《科技導報》第24卷第14期)公開了采用衛星空間育種獲得誘變菌株，通過菌體大小和顏色作為初篩的主要標準，發酵液用石油醚等溶劑萃取輔酶Qltl,然后通過旋轉蒸發儀獲得輔酶Qltl樣品，提取耗時近2h，輔酶Qltl樣品采用HPLC檢測。該方法能通過顏色和菌體大小對誘變菌體進行快速的初篩，但肉眼分辨有局限性，往往會遺漏一些高產菌株，其提取和檢測方法都比較的耗時，影響整體的篩選效率。本申請人在中國專利CN102154182A中公開一種輔酶Qltl生產的固料母種發酵培養的方法。米用的菌種為類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides(保藏號CGMCCN0.4497)。米用斜面菌種傳代，斜面培養基培養；將固料培養基蒸煮后晾干，分裝滅菌，所述固料培養基包含固料組分與液體組分；將新鮮斜面菌種類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides加無菌水制成菌懸液，倒入固料培養基，培養后作為一級發酵的母種。在種子工藝中使用，有效提高輔酶Qltl發酵水平，節省發酵級數縮短了周期，簡化生產環節，降低生產成本。

發明內容
本發明的目的在于針對現有輔酶Qltl菌株選育篩選方法的不足，提供一種輔酶Qki高產菌株選育快速篩選的方法。本發明包括以下步驟:I)從發酵液中超聲波提取輔酶Qltl樣品；2)通過酶標儀初篩高含量輔酶Qltl菌株；3) HPLC 復篩。在步驟I)中，所述從發酵液中超聲波提取輔酶Qltl樣品的方法可為:取輔酶Qltl發酵液，輔酶Qltl發酵液與提取溶劑按體積比為I 2: 10混勻后進行超聲波提取，所述提取溶劑為乙醇和丙酮的混合溶液，所述乙醇與丙酮的體積比可為(5 10): 1，提取的溫度為30 35°C，超聲處理，震蕩后，靜置，再用濾膜過濾收集濾液，即得到氧化型輔酶Qltl樣品；所述超聲處理的時間可為30 40min，所述濾膜可采用0.22 μ m的濾膜。在步驟2)中，所述通過酶標儀初篩高含量輔酶Qltl菌株的方法可為:吸取相同體積的氧化型輔酶Qltl樣品于酶標板中，通過酶標儀測定氧化型輔酶Qltl樣品在275nm波長下的吸光值，再加入還原劑溶液，震蕩后，測定還原型輔酶Qltl在275nm波長下的吸光值，根據氧化型輔酶Qltl和還原型輔酶Qltl吸光值差值的大小，通過查詢標準曲線判斷輔酶Qltl濃度的大小；所述還原劑溶液可選自硼氫化鈉溶液、硼氫化鉀溶液、氫化鋁鋰溶液、氯化亞錫溶液等中的一種；所述標準曲線的制作方法可為:吸取相同體積不同濃度梯度的氧化型輔酶Qki標準品溶液于酶標板中，通過酶標儀測定其在275nm波長下的吸光值，然后加入還原劑，在275nm波長下測定其還原型的吸光值，以輔酶Qltl標準品的氧化型與還原型在275nm波長下的吸光度差值對氧化型輔酶Qltl標準品濃度做回歸曲線，即得到標準曲線；所述還原劑選自硼氫化鈉、硼氫化鉀、氫化鋁鋰、氯化亞錫等中的一種；所述還原劑的加入量最好是至少能使全部的輔酶Qltl還原，還原劑的加入量的確定方法可為:吸取3mL濃度為80 150mg/L輔酶Qltl標準品溶液加入到石英比色皿中，然后分別加入不同劑量梯度的還原劑溶液，均勻振蕩，無水乙醇作為對照，待氣泡消失后測定275nm波長下吸光值，當輔酶Qltl漸漸被還原時，吸光值逐漸下降，當275nm波長下的吸光值不變時，說明添加的還原劑劑量足夠使氧化型輔酶Qltl標準品被完全還原，更進一步，可通過HPLC法來驗證輔酶Qltl是否已經完全還原。在步驟3)中，所述HPLC復篩的方法可為:將初篩得到的吸光值差值大的輔酶Qiq樣品用高效液相色譜法進行復測，最終篩選出輔酶Qltl高產菌株；HPLC色譜條件可為:色譜柱為不銹鋼柱Inertsil.0DS-SP、規格為4.6X 100mm，直徑為5 μ m，檢測波長275nm，流動相為無水甲醇:無水乙醇=65: 35 (V/V)，流速:1.1 1.3mL/min，柱溫:35°C，進樣量:20 25 μ L，洗脫時間:20min ;所述輔酶Qltl高產菌株選自類球紅細菌屬(Rhodobactersphaeroides)及其誘變菌株，優選為類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) JDW-610,已于2010年12月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏中心登記入冊編號為CGMCCN0.4497。本發明的有益效果:在常規的紫外分光光度法的基礎上進行了改進，菌株發酵液通過超聲波破碎法獲得輔酶Qltl樣品，利用還原劑將輔酶Qltl樣品轉化為還原型輔酶Qltl,以還原型輔酶Qltl做對照來消除提取液中蛋白質、核酸等雜質所造成誤差，同時結合酶標儀批量快速測定輔酶Qltl樣品，既提高了測定的效率，又保證該方法的可靠性，最后通過HPLC法對少量初篩的高產菌株進行復篩獲得輔酶Qltl高產菌株，從而大大縮減了育種的周期，提高篩選輔酶Qltl高產菌株的效率。


圖1為氧化型輔酶QltlHPCL檢測圖譜。圖2為部分還原型輔酶QltlHPLC檢測圖譜。圖3為完全還原型輔酶QltlHPLC檢測圖譜。圖4為輔酶Qltl濃度一吸光差值標準曲線圖。
具體實施例方式
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實施例1:還原劑最適用量的確定以還原劑為硼氫化鈉為例:配制濃度為80mg/L氧化型輔酶Qltl標準品，精確吸取3mL加入到石英比色皿中，然后分別加入 2 μ L、6 μ L、12 μ L、16 μ L、20 μ L、32 μ L、40 μ L、50 μ L 濃度為 9mg/mL 硼氫化鈉溶液，均勻振蕩，無水乙醇做為對照，待氣泡消失后測定275nm吸光值，記錄最終穩定數值，結果如表I所示。表1還原劑最適用量
權利要求
1.輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于包括以下步驟: O從發酵液中超聲波提取輔酶Qltl樣品； 2)通過酶標儀初篩高含量輔酶Qltl菌株； 3)HPLC 復篩。
2.如權利要求1所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于在步驟I)中，所述從發酵液中超聲波提取輔酶Qltl樣品的方法為:取輔酶Qltl發酵液，輔酶Q1O發酵液與提取溶劑按體積比為I 2: 10混勻后進行超聲波提取，所述提取溶劑為乙醇和丙酮的混合溶液，所述乙醇與丙酮的體積比可為(5 10): 1，提取的溫度為30 35°C，超聲處理，震蕩后，靜置，再用濾膜過濾收集濾液，即得到氧化型輔酶Qltl樣品。
3.如權利要求2所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于所述超聲處理的時間為30 40min，所述濾膜采用0.22 μ m的濾膜。
4.如權利要求1所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于在步驟2)中，所述通過酶標儀初篩高含量輔酶Qltl菌株的方法為:吸取相同體積的氧化型輔酶Qltl樣品于酶標板中，通過酶標儀測定氧化型輔酶Qltl樣品在275nm波長下的吸光值，再加入還原劑溶液，震蕩后，測定還原型輔酶Qltl在275nm波長下的吸光值，根據氧化型輔酶Qltl和還原型輔酶Qltl吸光值差值的大小，通過查詢標準曲線判斷輔酶Qltl濃度的大小。
5.如權利要求4所述輔酶Qltl 高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于所述還原劑溶液選自硼氫化鈉溶液、硼氫化鉀溶液、氫化招鋰溶液、氯化亞錫溶液中的一種。
6.如權利要求4所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于所述標準曲線的制作方法為:吸取相同體積不同濃度梯度的氧化型輔酶Qltl標準品溶液于酶標板中，通過酶標儀測定其在275nm波長下的吸光值，然后加入還原劑，在275nm波長下測定其還原型的吸光值，以輔酶Qltl標準品的氧化型與還原型在275nm波長下的吸光度差值對氧化型輔酶Q10標準品濃度做回歸曲線，即得到標準曲線。
7.如權利要求6所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于所述還原劑選自硼氫化鈉、硼氫化鉀、氫化鋁鋰、氯化亞錫中的一種；所述還原劑的加入量是至少能使全部的輔酶Qltl還原，還原劑的加入量的確定方法為:吸取3mL濃度為80 150mg/L輔酶Qiq標準品溶液加入到石英比色皿中，然后分別加入不同劑量梯度的還原劑溶液，均勻振蕩，無水乙醇作為對照，待氣泡消失后測定275nm波長下吸光值，當輔酶Qltl漸漸被還原時，吸光值逐漸下降，當275nm波長下的吸光值不變時，說明添加的還原劑劑量足夠使氧化型輔酶Qki標準品被完全還原，更進一步，可通過HPLC法來驗證輔酶Qltl是否已經完全還原。
8.如權利要求1所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于在步驟3)中，所述HPLC復篩的方法為:將初篩得到的吸光值差值大的輔酶Qltl樣品用高效液相色譜法進行復測，最終篩選出輔酶Qltl高產菌株；HPLC色譜條件為:色譜柱為不銹鋼柱Inertsil.0DS-SP、規格為4.6X100mm，直徑為5μπι，檢測波長275nm，流動相為無水甲醇:無水乙醇=65: 35 (V/V)，流速:1.I 1.3mL/min，柱溫:35°C，進樣量:20 25yL，洗脫時間:20mino
9.如權利要求8所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于所述輔酶Qw高產菌株選自類球紅細菌屬(Rhodobacter sphaeroides)及其誘變菌株。
10.如權利要求9所述輔酶Qltl高產菌株選育快速篩選的方法，其特征在于所述輔酶Qici高產菌株為類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) JDW-610,已于2010年12月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCN0.4497。 ·
全文摘要
輔酶Q10高產菌株選育快速篩選的方法，涉及輔酶Q10。1)從發酵液中超聲波提取輔酶Q10樣品；2)通過酶標儀初篩高含量輔酶Q10菌株；3)HPLC復篩。在常規的紫外分光光度法的基礎上進行了改進，菌株發酵液通過超聲波破碎法獲得輔酶Q10樣品，利用還原劑將輔酶Q10樣品轉化為還原型輔酶Q10，以還原型輔酶Q10做對照來消除提取液中蛋白質、核酸等雜質所造成誤差，同時結合酶標儀批量快速測定輔酶Q10樣品，既提高了測定的效率，又保證該方法的可靠性，最后通過HPLC法對少量初篩的高產菌株進行復篩獲得輔酶Q10高產菌株，從而大大縮減了育種的周期，提高篩選輔酶Q10高產菌株的效率。
文檔編號G01N30/02GK103196860SQ20131007078
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者鄭毅, 朱志春, 陳金卿, 陳俊煌, 吳美瓊 申請人:廈門金達威集團股份有限公司, 內蒙古金達威藥業有限公司