一種富鉬釀酒酵母及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種富鉬釀酒酵母及其制備方法，屬于人體健康和發酵工程領域。本發明富鉬釀酒酵母為能組成型表達SEQ ID NO.1所示基因的釀酒酵母，其可用于制備預防和/或治療癌癥、心腦血管疾病和/或肝臟疾病的藥物。通過將SEQ ID NO.1所示基因連接到酵母組成型表達載體上構建重組表達載體，再將重組表達載體轉入釀酒酵母中得到富鉬釀酒酵母。本發明的富鉬酵母鉬富集能力較高，具有良好的經濟效益和社會效益。
【專利說明】
[0001] 一種富鉬釀酒酵母及其制備方法
技術領域
[0002] 本發明涉及人體健康和發酵工程領域，具體涉及一種富鉬釀酒酵母及其制備方 法。
【背景技術】
[0003] 鉬是動物、微生物及人體所必需的微量營養元素之一，是固氮酶、硝酸還原酶、黃 嘌呤氧化酶、醛氧化酶、亞硫酸氧化酶等多種酶的重要組成成分。鉬參與并影響機體內的多 種代謝過程;鉬能抑制乳腺癌的生長，控制食道癌及其它癌癥的死亡率;鉬能保護心肌，預 防心腦血管疾病和肝臟疾病；同時鉬對克山病、齲齒、小細胞低色素性貧血以及區域性脫發 等地方病有很好的防治作用。鉬能增加機體抵抗病菌的能力，提高機體免疫能力;對動物的 生長有明顯的促進作用。
[0004] 酵母可通過吸收轉化，將培養基中所含微量元素富集于自身細胞組織中，將無機 微量元素改變成毒性低的有機形態，提高生物利用率和安全性；同時，酵母本身的生物活性 物質對生物體也有保健作用，是富集微量元素的有效載體之一。成人每日膳食中微量元素 鉬需求量大約是o.lmg，因此富鉬酵母作為機體鉬源的補充，尤其是作為預防和治療癌癥、 心腦血管疾病和肝臟疾病藥物的重要功效成分已引起人們極大重視。
[0005] 目前富營養元素酵母品種選育所采用的方法主要包括紫外線、微波以及化學試劑 誘變等獲得具有富營養元素較高的突變體酵母。以上育種方法存在一定的盲目性和隨機 性，過程較為繁瑣。例如，紫外線誘變雖然操作比較簡單，但是操作不當會對人體產生傷害， 并且此方法還需要進行大量的無目的性的篩選鑒定工作。
[0006] 綜上所述，發明出一種可以快速準確地提高酵母鉬含量的方法是非常必要的，并 通過這種方法進行制備其他以酵母為載體富集多種微量元素酵母新品種也是具有十分重 要的意義。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種富鉬釀酒酵母，其對鉬的吸收富集能力強，能夠提高 釀酒酵母相關產品的鉬含量，有效安全的補充人們所需要的必須微量元素鉬。本發明的目 的還在于提供所述富鉬釀酒酵母的制備方法，該方法準確、生態安全、簡潔實用、費用低廉、 適用性廣、可操作性強。
[0008] 為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案： 一種富鉬釀酒酵母，為能組成型表達Glym08g22300基因的釀酒酵母，所述的 Glym08g22300基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009] 優選的，所述的富鉬釀酒酵母為轉化可組成型表達Glym08g22300基因的重組載體 的釀酒酵母INVSC1;所述的重組載體以pAG306Gro-ccdB作為骨架載體。
[0010] 所述的富鉬釀酒酵母的制備方法，包括如下步驟:將Glym08g22300基因連接到酵 母組成型表達載體上構建重組表達載體，再將重組表達載體轉入釀酒酵母中得到富鉬釀酒 酵母。
[0011] 所述的富鉬釀酒酵母富鉬能力強，可用于制備預防和/或治療癌癥、心腦血管疾病 和/或肝臟疾病的藥物。
[0012] -種富鉬釀酒酵母的篩選方法，包括如下步驟： (1) 通過blast得到鉬轉運子同源基因； (2) 將同源基因連接到酵母組成型表達載體上構建重組表達載體； (3) 將重組表達載體轉入釀酒酵母中；所得轉化子在含鉬培養基中培養后收集酵母細 胞，測定鉬含量。
[0013] 酵母本身具有將培養基中營養元素其富集于自身細胞組織中的功能，本發明利用 轉基因技術把具有鉬吸收功能的目的基因轉入酵母中，通過測定酵母鉬吸收量，獲得一種 可具有較高鉬富集能力的釀酒酵母。本發明與現有技術相比，具有以下優點和積極效果： (1) 本發明篩選周期短，可以在較快時間內獲得具有較高鉬富集能力的突變體菌株； (2) 本發明生態安全，不需要物理、化學等方法進行誘變處理； (3) 本發明所獲得的富鉬酵母鉬富集能力較高，可以有效的滿足生物體所需要的鉬營 養。
[0014] 因此，本發明具有良好的經濟效益和社會效益。
【附圖說明】
[0015] 圖1是轉化含不同目的基因的表達載體的酵母中鉬含量的柱狀統計圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0017] 實施例！ 1、候選基因的確定及引物的設計 利用擬南芥鉬轉運子AtMOTl和AtM0T2蛋白序列blast大豆基因組數據庫（http:// www.soybase.org/)，得到大豆鉬轉運子同源基因共7個;對7大豆鉬轉運子同源基因以及擬 南芥鉬轉運子AtMOTl和AtM0T2進行同源性分析，以其中3個大豆鉬轉運子同源基因作為試 驗對象，分別為Glym08g22300(SEQ ID N0.1)、Glyma06g07780(SEQ ID N0.2)、 Glymal4gl6610(SEQ ID 1^0.3)。根據口1171:〇2〇1116上公布的大豆候選基因序列 (Glym08g22300、Glyma06g07780、Glymal4gl6610)及pENTR/D-TOPO cloning kit(Gateway 技術)的要求設計引物。
[0018]擴增各基因的引物序列如下： 擴增Glyma06g07780基因的引物： 正向引物5 ' -3 ' ： CACCATGGCACCACCGAACCCCCCA， 反向引物5'_3' MACTTGCTCATCAGGGCCTTCATGCTGCTTCCAJnFSSr，GC=68%; 擴增Glym08g22300基因的引物： 正向引物5 ' -3 ' ： CACCATGGCACCCTCAATCTCCGAC， 反向引物5'_3' ：GGCAATCAAGCTAGCTTGTTC，Tm=60°C，GC=57%; 擴增Glymal4gl6610基因的引物： 正向引物5 ' -3 ' ： CACCATGGGTGACCTTGGCACTTATA， 反向引物5'_3' MACTTGCTCAGGTCTTTTCTGCATCCAJnFesr，GC=50%。
[0019] 2、入門載體和酵母表達載體構建 (Ugateway入門載體構建：采集大豆葉片或根的樣品，采用RNeasy Plant試劑盒 (QIAGEN)和RNA，同時反轉錄RNA獲得cDNA。以cDNA為模板使用Phusion高保真酶進行PCR擴 增，并按照pENTR/D-TOPO cloning kit說明書說明進行連接、測序、構建入門載體(pEnter 載體)。
[0020] 其中，PCR擴增反應體系為：5XPhusion HF Buffer IOyUlOmM dNTPs 1μL，20μΜ 正向引物 1·25μL，20μΜ 反向引物 1.25yL，DMS0 1.5yL，Phusion DNA Polymerase lyL，模板 DNA 4pL〇
[0021] PCR擴增反應程序為：98°C 30s-個循環；98°CIOs，66°C20s，72°C45s，30個循環； 72 0Clmin,一個循環。
[0022] (2)酵母表達載體構建 利用Gateway? LR Clonase ? II Enzyme mix LR 酶試劑盒（Invitrogen 美國）將入門 載體中的目的基因連接到pAG306GPD-ccdB(組成型）或pAG306GAL-ccdB(半乳糖啟動子誘 導型)上構建酵母異源表達載體。
[0023] 3、酵母表達載體向釀酒酵母INVSCl中轉化 米用Frozen-EZ Yeast Transformation II?試劑盒（ZYM0，USA)，將帶有目的基因的 酵母異源表達載體轉化至酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)INVSCl中，以不帶鉬轉運子 候選基因的空質粒作對照;利用尿嘧啶缺陷型SD固體培養基進行篩選，篩選出轉化成功的 酵母。
[0024] 4、酵母鉬吸收功能的驗證 挑取轉化成功的酵母單菌落在無鉬尿嘧啶缺陷型葡萄糖或半乳糖SD液體培養基 (0.77gCSM-URA，20g葡萄糖或者半乳糖，6.7g無鉬YNB，去離子水定容至1000 mL)上培養到對 數中期，即OD 6qq=I . 0;隨后將菌液轉入含有250nM Mo的尿嘧啶缺陷型葡萄糖或半乳糖SD液 體培養基中，30°C、220轉/分鐘培養45分鐘。離心機4°C、3000轉/分鐘離心2分鐘，棄上清液， 并用去離子無菌水洗2遍，烘干稱重，加入優級純濃硝酸硝化，利用Expec 7000型ICP-MS測 定酵母中的鉬含量。
[0025] 5、數據分析 數據處理及繪圖采用Excel軟件。
[0026]將含有不同基因 Glym08g22300、Glyma06g07780、Glymal4gl6610 的酵母表達載體 轉入釀酒酵母INVSCl中，酵母表達載體包括pAG306GPD(組成型）和pAG306GAL(半乳糖啟動 子誘導型）兩種不同類型的表達載體。酵母在含葡萄糖或半乳糖兩種不同碳源的無鉬尿嘧 啶缺陷型SD液體培養基上培養至對數中期，然后轉移至含有250nM Mo的尿嘧啶缺陷型SD液 體培養基中進行培養45分鐘，進行測定細胞中的鉬含量。如圖1所示，pAG306GPD類型的酵母 表達載體在釀酒酵母INVSCl異源表達試驗中比pAG306GAL類型具有較高的鉬累積能力，表 明半乳糖啟動子對鉬轉運子基因不能進行誘導其表達從而表現出較高的鉬累積能力;而當 酵母異源組成型表達Glym08g22300基因時，其鉬含量遠高于其他兩個基因。
[0027]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種富鉬釀酒酵母，其特征在于：為能組成型表達SEQ ID NO.1所示基因的釀酒酵 母。2. 根據權利要求1所述的富鉬釀酒酵母，其特征在于：為轉化可組成型表達SEQ ID NO. 1所示基因的重組載體的釀酒酵母INVSC1。3. 根據權利要求1所述的富鉬釀酒酵母，其特征在于：所述的重組載體以PAG306GPD-ccdB作為骨架載體。4. 權利要求1所述的富鉬釀酒酵母的制備方法，其特征在于包括如下步驟:將SEQ ID NO. 1所示基因連接到酵母組成型表達載體上構建重組表達載體，再將重組表達載體轉入釀 酒酵母中得到富鉬釀酒酵母。5. 權利要求1-3任一項所述的富鉬釀酒酵母在制備預防和/或治療癌癥、心腦血管疾病 和/或肝臟疾病的藥物中的應用。6. -種富鉬釀酒酵母的篩選方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 通過blast得到鉬轉運子同源基因； (2) 將同源基因連接到酵母組成型表達載體上構建重組表達載體； (3) 將重組表達載體轉入釀酒酵母中；所得轉化子在含鉬培養基中培養后收集酵母細 胞，測定鉬含量。
【文檔編號】C12R1/865GK105861350SQ201610429223
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月16日
【發明人】孫學成, 胡承孝, 譚啟玲, 徐守俊
【申請人】華中農業大學