專利名稱：一種重組人干擾素α1b的純化工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組人干擾素的純化工藝。
背景技術：
干擾素作為一種廣譜的抗病毒藥物越來越廣泛的應用于臨床上，具有很大的市場價值。自從人α1b干擾素通過基因工程的辦法獲得高效表達成功以后，為了保證高純度，該蛋白的純化工藝一直都采用以單抗親和層析柱為主結合其他層析柱的方法進行分離純化，(專利申請號93114639.9)，這類方法具有高選擇性的特點，通過一個柱子即可達到較高的純度。但是該工藝存在層析介質價格昂貴、單抗容易脫落造成蛋白藥物污染、介質使用壽命短等這些單抗親和層析自身不可回避的缺陷。
發明內容
本發明的目的在于在純化工藝中避開單抗親和層析柱，并使操作環節的銜接更為簡便，同時保證相應的高純度和收率。本工藝包括細菌裂解，包涵體變性和復性等過程，其特征在于還包括以下步驟(1)疏水柱層析；(2)陽離子柱層析；(3)體積排阻層析。
上述3種柱層析使用的層析介質可從多家公司購買，每一種介質都有多種選擇。僅以Amersham Biosciences公司為例，其出售的疏水介質有PhenylSepharose FF、Butyl Sepharose FF、Qctyl Sepharose FF等；陽離子介質有CMSepharose FF、SP Sepharose FF、S Sepharose FF等；體積排阻層析介質有Sepharose、Sephacryl、Sephadex、Superdex等。本發明的主要內容在于將上述不同種類的柱層析相互組合，從而達到純化人干擾素α1b的目的。本領域的普通技術人員很容易做到將同一種類的介質互相替換，以達到相同的純化效果，所以這種同一類型純化介質之間的簡單替換，仍然包括在本發明的保護范圍之內。
上述純化工藝中，疏水柱層析使用Phenyl Sepharose FF，其中洗脫液使用10-40％(v/v)的乙二醇溶液，優選20％的乙二醇溶液；陽離子柱層析使用CMSepharose FF，其中平衡液使用pH4.4-5.0的醋酸緩沖液；體積排阻柱層析使用Sephacryl S-100。
本發明應用到實際生產中能產生以下的積極意義本發明涉及的工藝沒有采用單抗親和層析柱，而采用了疏水柱層析和陽離子交換層析為主的分離方法，節約了生產成本并避免了單抗脫落帶來的污染問題。
本發明采用疏水柱層析作為柱層析的第一步，無需將蛋白液進行大體積的透析，簡便了操作過程，節約了時間。同時疏水柱具有高結合量、能承受較高流速的優點，作為第一步柱層析能起到很有效的濃縮效果。此外，更重要的是，經過這一步就能使目的蛋白純度達到90％以上。
CM柱層析能使目的蛋白純度達到95％以上，同時進一步濃縮了目的蛋白。
采用本工藝，重組人干擾素α1b的收率、純度和比活性不低于單抗親和層析的方法，相應于10％目的蛋白表達量的菌種，每1克菌最終可收獲1mg干擾素純品。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1(1)超聲波裂解取40g工程菌菌體，按菌體的質量每克用20-40ml的TE溶液(pH8.0)懸浮菌體，超聲波的輸出功率設置為600W以上、破碎時間為10分鐘以上。12,000rpm，4℃離心20分鐘收集包涵體沉淀，用TE溶液或Tris-HCl溶液(pH8.0)洗滌一次，12,000rpm，4℃離心20分鐘收集沉淀。
(2)包涵體的變性按照包涵體的質量，每克包涵體加入10ml的6N鹽酸胍充分溶解，室溫下變性2小時以上。
(3)包涵體的復性4,000rpm離心收集上清，蛋白的變性液用0.15M硼酸溶液(pH9.0)稀釋100倍，4℃過夜復性。
(4)Phenyl Sepharose疏水柱層析將復性后的蛋白液對0.44μm的膜抽濾以去除不溶性雜質顆粒，向抽濾液中加入適量體積的濃(NH4)2SO4溶液使蛋白液中最終的(NH4)2SO4濃度至1.5mol/L。用1.5M濃度的(NH4)2SO4溶液平衡好層析柱，上樣后用3-5個柱體積的平衡液沖洗，用10％(v/v)的乙二醇溶液洗脫，收集洗脫峰組分。
(5)CM Sepharose FF陽離子交換柱層析將上一步收集的洗脫組分對5mM醋酸緩沖液(pH4.4)透析后上樣到用80mM醋酸緩沖液(pH4.4)平衡好的CM層析柱上，用50mM NaCl/80mM醋酸緩沖液(pH4.4)洗脫，收集洗脫峰組分。
(6)Sephacryl S-100柱層析用0.1N NaOH將上一步洗脫組分的pH值調至7.0，上樣到用PBS(pH7.0)平衡好的層析柱上，用PBS(pH7.0)洗脫，收集洗脫峰組分即為重組人α1b干擾素純品。
40g菌體經上述處理，共得到39mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為98％，經常規WISH-VSV系統測定，比活性為1.3×107IU/mg。整個工藝過程共用28個小時。
實施例2將Phenyl Sepharose疏水柱層析中10％的乙二醇溶液換成20％的乙二醇溶液，將CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱層析各緩沖液的pH值調成4.6，其余步驟同實施例1。
40g菌體經上述處理，共得到45mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為98％，經常規WISH-VSV系統測定，比活性為1.2×107IU/mg。整個工藝過程共用28個小時。
實施例3將Phenyl Sepharose疏水柱層析中10％的乙二醇溶液換成40％的乙二醇溶液，將CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱層析各緩沖液的pH值調成5.0，其余步驟同實施例1。
40g菌體經上述處理，共得到48mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為96％，經常規WISH-VSV系統測定，比活性為1.1×107IU/mg。整個工藝過程共用28個小時。
對照實施例超聲波裂解、包涵體變性和復性同實施例1，然后按以下步驟處理(1)DEAE Sepharose FF陽離子交換柱層析復性液用25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)透析，用Tris-HCl溶液(pH7.5)平衡好層析柱，上樣后用3-5個柱體積的平衡液沖洗，用0.2M NaCl/25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)洗脫，收集洗脫峰組分。
(2)單克隆抗體親和層析將上一步收集的洗脫組分對25mM pH7.0PB緩沖液透析后上樣到用25mM pH7.0PB緩沖液平衡好的親和層析柱上，用PBSpH7.0緩沖液沖洗，用50mM pH2.5的甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，收集洗脫峰，立即調pH至7.0。
(3)Sephacryl S-100柱層析將上一步洗脫組分上樣到用PBS(pH7.0)平衡好的層析柱上，用PBS(pH7.0)洗脫，收集洗脫峰組分即為重組人α1b干擾素純品。
40g菌體經上述處理，共得到42mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為98％，經常規WISH-VSV系統測定，比活性為1.2×107IU/mg。整個工藝過程共用38個小時。
以上結果表明，使用本發明純化工藝的實施例1、2、3與對照實施例相比，沒有使用傳統的單克隆抗體親和層析，獲得的干擾素α1b純品的質量相當，而工藝過程明顯縮短。
權利要求
1.一種重組人干擾素α1b的純化工藝，包括以下步驟(1)疏水柱層析；(2)陽離子柱層析；(3)體積排阻柱層析。
2.如權利要求1所述的工藝，其中疏水柱層析為Phenyl Sepharose FF。
3.如權利要求2所述的工藝，其中疏水柱層析的洗脫液是10％-40％的乙二醇溶液。
4.如權利要求1所述的工藝，其中陽離子柱層析是CM Sepharose FF。
5.如權利要求4所述的工藝，其中陽離子柱層析的平衡液是pH 4.4-5.0的醋酸緩沖液。
6.如權利要求1所述的工藝，其中體積排阻柱層析是Sephacryl S-100。
全文摘要
本發明涉及一種重組人干擾素α1b的純化工藝，包括疏水柱層析、陽離子柱層析、體積排阻柱層析。該工藝無需采用單抗親和層析柱，避免了單抗脫落造成的污染，產品純度、收率及活性與傳統親和層析方法相當，同時各純化步驟之間的銜接更為合理，縮短了工藝過程。
文檔編號C07K1/00GK1724568SQ20041006939
公開日2006年1月25日 申請日期2004年7月22日 優先權日2004年7月22日
發明者楊大軍, 梁天鳳, 劉金毅, 劉永全, 孫儉波, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發展有限公司