專利名稱：表達糖基化干擾素的酵母表達系統及制備重組糖基化干擾素的方法
技術領域：
本發明涉及新的表達糖基化干擾素(IFN)的重組載體及其酵母表達宿主，本發明 還涉及利用該酵母表達系統的制備重組糖基化干擾素的方法。
背景技術：
干擾素(簡稱IFN)干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病 毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復制；同 時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作 用，并增強抗病毒能力干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，是一種 由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞 生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。利用基因工程技術，以微生物為載體，生產外源蛋白具有廣闊的應用前景。到目前 為止，已發展了多種蛋白表達系統。大腸桿菌表達系統是研究得最清楚的一套原核表達系 統，人們對它的遺傳背景和生化特性了解得很透徹，而且大腸桿菌因其具有容易操作，生長 迅速，營養需求簡單等優點，得到了廣泛的應用。但是這一系統本身也存在著若干缺陷① 缺少真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等；②表達的蛋白多 以包涵體形式存在，需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性；③背景雜蛋白很多，純化較 麻煩；④表達量一般不是很高。為了克服大腸桿菌表達系統的缺點，從二十世紀80年代開 始，人們發展了酵母細胞表達系統。酵母作為一種最簡單的單細胞真核生物，兼有原核生物和真核生物的某些優點。 酵母表達系統的優點酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長繁殖速度迅 速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產品時，可以大規模生產，有效降低了生 產成本。酵母表達外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質具有一定程度 上的折疊加工和糖基化修飾，性質較原核表達的蛋白質更加穩定，特別適合于穩定表達真 核生物基因和制備有功能的表達蛋白質。酵母表達系統具有外分泌信號序列，能夠將所表 達的外源蛋白質分泌到細胞外，因此很容易純化。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最早用于表達外源蛋白的酵母菌。它 具有繁殖速度快，能高密度發酵，可以進行蛋白翻譯后的修飾、加工等優點。自1981年 Hitzemom等用釀酒酵母表達人干擾素獲得成功后(Hitzemom RA,Hagie FE，et al,Nature, 1981，293 717 722)，釀酒酵母還表達了多種原核和真核蛋白。但此系統也有其局限性， 如缺乏強有力的啟動子；分泌效率差；表達菌株不夠穩定；表達質粒易于丟失；糖基化程度 高；核心多糖末端存在α-1，3糖苷鍵，從而使得蛋白具有高度的抗原性，不適宜作治療制 劑等等。為了解決這些問題，人們發展了甲醇酵母表達系統。甲醇酵母是一種甲醇營養型酵母，在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油時，能利用甲 醇作為唯一碳源，它是在釀酒酵母的基礎上發展起來的一種新型表達宿主。包括Pichia、Hansenula、Torulopsis、Candida等，其中以Pichia pastoris (巴氏畢氏酵母)為宿主建立的外源基因表達系統，近年來得到迅速發展和廣泛應用。作為真核表達系統，甲醇酵母具有 許多其他蛋白表達系統所不具有的優點，如具有強有力的乙醇氧化酶基因(AOXl)啟動子， 可嚴格調控外源蛋白的表達；可對表達的蛋白進行翻譯后的加工和修飾，即二硫鍵的形成、 脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折疊、信號序列加工、N-糖基化、0-糖基化，從而使表達出的蛋白 具有生物活性；在蛋白質誘導表達的過程中雖然以甲醇作為唯一的碳源，但不存在象細菌、 動物細胞培養中的內毒殘留問題；營養要求低，生長快，培養基廉價，便于工業化生產；可 高密度發酵培養，蛋白產量高；表達量高；糖基化程度低；甲醇酵母自身分泌的蛋白少，表 達產物較易分離純化。中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell, CHO)是用于真核生物基因表 達較為成功的宿主細胞。與其它表達系統相比，它具有許多優點①準確的轉錄后修飾功 能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白分子； ②表達產物胞外分泌，便于分離純化；③具有重組基因的高效擴增和表達能力；④貼壁生 長，有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可進行懸浮培養或在無血清培養基中達到高密度， 培養體積能達到1000L以上；⑤CHO細胞屬于成纖維細胞，很少分泌內源蛋白，利于外源蛋 白的分離純化。根據CHO細胞表達系統的特點，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高 效表達，部分藥物已投放市場，如EPO、G-CSF等。但是，利用該表達系統進行蛋白表達時也 存在著許多缺陷，如構建的重組CHO細胞生產效率低，表達產物濃度低；某些糖基化表達產 物不穩定，不易純化；重組CHO細胞上游構建與下游分離純化易脫節，純化較麻煩；表達周 期長；重組細胞培養費用昂貴等等。因此，目前利用CHO細胞表達外源基因的技術尚不能滿 足生物藥品的開發和生產的要求。糖基化干擾素，在國內外已經研究多年，國內基本上是從人血白細胞中直接提取 DNA，進行克隆和表達。鑒于IFN具有廣闊的臨床應用前景，因而受到醫學界與企業界的重 視。在異源蛋白的表達中，大腸桿菌因其具有容易操作，生長迅速，營養需求簡單等優點，已 成功地表達了多種外源蛋白，但是，由于IFN分子包含二硫鍵，若用大腸桿菌進行表達，存 在肽鍵不能有效折疊及二硫鍵容易錯配等因素，而且，純化時需經過變性和復性步驟，復性 率很低。在rIFN的復性體系中加入一定比例的PDI，可以使rIFN中錯誤配對的二硫鍵打開 并形成正確的二硫鍵，從而提高復性率，降低異構體比例，提高rIFN產率。然而，純化仍然 困難，成本居高不下，其產量和應用受到限制。雖然目前國內外對利用CHO細胞表達糖基化 干擾素進行了研究，但是由于CHO細胞表達系統存在的諸多缺陷而受到限制。研究證明IFN 雖然為一種糖蛋白，其功能同其N端糖基有關，但其糖基僅作為識別信息存在，許多基因工 程產品證明不含糖基的亞基有較高的活性，在本發明的一個實施例中，在設計IFN的引物 時加上Nde I和BamH I兩個酶切位點及終止密碼子和一些保護性堿基，有利直接克隆或改 變堿基序列。但是，酵母表達產量極低(一般低于lmg/L)，進一步提高蛋白的表達量，是降 低成本和大規模生產的首要條件，也是目前酵母表達IFN難以實現產業化的原因。
發明內容
針對現有技術存在的問題，為了提高IFN的表達產率，本發明提供了新的表達載 體及其轉化的酵母表達系統(也稱為表達宿主)來分泌表達重組IFN。目前，尚未見有IFN分子在酵母表達體系分泌表達的報道。本發明的另一個目的在于提供一種利用本發明的表達系統制備糖基化干擾素的 方法。根據本發明的一方面，提供表達IFN的表達載體，其中所用到的質粒PPIC3、 pPIC3. 5K、pPHIL-D2、pA0815、pPICZ、pPHWO 10、pGAPZ、pPIC9、pPIC9KL、pPHIL-SUpPICZa(A、 B、C)、pGAPZa、YAM7SP6、pVT 102U/ α等等，優選pPIC9KL質粒進行IFN表達載體的構建， 其構建的表達IFN的表達載體(pPKLIFN)如
圖1所示，它是將合成的IFN基因序列插入 PPIC9KL質粒中構建而成。
本發明采用酵母載體，即所謂的穿梭載體，其具有的細菌質粒和酵母質粒的復制 原點，以及在兩種宿主系統中分泌的基因。此外，該類型載體還含有表達外來基因所必需的 啟動子順序，以及最好有可改善產率的終止順序，從而即可使利于同分泌信號融合的異源 基因定位于啟動子和終止密碼子之間。將本發明構建的表達載體轉化酵母宿主即可獲得本發明的表達IFN的酵母表達 系統，由酵母細胞中表達的優點不僅因為可以分泌IFN，而且還因為它在實際上是呈準確折 迭形式的并具有高度活性的。酵母宿主可以從例如巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris), 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、漢森酵母(H. Polymorpha)、假絲酵母(Candida) 和球擬酵母(Torulopsi)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等中選擇，最優選 的酵母宿主為巴斯德畢赤酵母，常用的畢赤酵母宿主菌有GS115、KM71、KM71H、SMDl 168和 SMD1168H等等，其中優選畢赤酵母GS115。根據本發明的另一方面，提供了利用本發明表達IFN的酵母表達系統制備IFN方 法，其包括下述步驟A、將編碼糖基化干擾素的基因可操作地連接于表達載體，優選pPIC9KL，構建表達 IFN的重組表達載體；B、用所述重組表達載體轉化酵母宿主，優選畢赤酵母GS115，構建表達IFN的酵母 表達系統；C、培養所述酵母表達系統，獲得重組糖基化干擾素。在本發明的制備方法中，還可以進一步包括對獲得的重組糖基化干擾素進行純化 的步驟。本發明針對酵母表達系統設計構建表達載體，制備出了表達IFN的酵母表達系 統，在酵母表達系統中不僅可以高效表達酵母表達質粒上的外源基因并將表達的外源蛋白 IFN分泌至細胞壁外的培養基中，而且表達產物具有天然蛋白結構和天然活性。酵母培養體 系經濟、簡便，高密度發酵可得100克/升干重酵母，可提高產率，降低生產成本，比較適合 于大規模工業化生產。本發明選用的甲醇酵母表達體系以醇氧化酶為啟動子，通過同源雙交換使外源基 因穩定地整合于酵母染色體，有效地避免了外源基因丟失。甲醇酵母不但能使表達產物糖 基化，避免釀酒酵母的超糖基化作用，更重要的是它可將表達產物分泌于胞外，而且自身蛋 白的分泌卻很少，非常有利于下游的純化設備。甲醇酵母能大量分泌異源蛋白。在甲醇酵 母中，質粒也能發生高頻整合，用一系列方法可增加拷貝數，提高產量。本發明提供了一種用酵母分泌表達具天然蛋白結構和生物活性的rIFN的新的表達系統。它與其它表達體系，如大腸桿菌表達體系和真核細胞表達體系相比具有以下優占.
^ \\\ ·①表達產率高；②產物具天然結構和生物活性，無需變性和復性；③培養基簡單、價廉；④熱源性物質減少；⑤產率顯著提高，生產成本大幅度降低。上述優勢使本發明具有明顯的技術創新性與工藝先進性，更適合于工業化生產重 組糖基化干擾素。按照本發明的表達系統和方法可以制備得到純度大于99%，生物比活性 高于106U/mg蛋白的重組IFN。對比實驗表明，酵母表達系統表達的rIFN純度達98%以上，生物學活性高于 lX106U/mg，而現有的大腸桿菌表達系統表達的IFN，其純度只能達到95%，生物學活性只 有 2X105U/mg。為了更好地理解本發明的本質，下面結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的描 述，詳細說明但不限制本發明。說明書附圖的簡要說明圖1為本發明構建的表達質粒pPKIFN的結構圖；酵母表達載體質粒pPIC9KL作為表達載體，它含有誘導分泌表達的啟動子AOXI及 終止子TT，組氨酸脫氨酶基因His4，以及卡那霉素抗性基因。含AOXI和His4的片段通過同 源重組整合到酵母基因組中的His4基因上。卡那霉素抗性基因，能使酵母細胞對418產生 抗性。AOXI下游Polylinker處含有XhoI和NotI酶切位點，可以插入目的基因。rIFNcDNA 用XhoI和NotI雙酶切后的片段插入質粒pPIC9KL的XhoI和NotI之間，構建成表達質粒 pPKLIFN。載體質粒pPIC9KL中在S和TT之間可以插入另外的片段即目的基因，插入后對載 體質粒表達沒有影響，其他位置插入或替換片斷則對載體質粒表達有較大影響。載體質粒pPIC9KL含有Ampicilin和Kanamycin抗性基因，Kanamycin抗性基因 可以換用四環素抗性基因。
具體實施例方式下面通過對本發明的較佳的實施方案進行描述，詳細說明但不限制本發明。本發明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品，各種試劑和培養基的成 分和配制方法可以參見常規實驗手冊中的描述。實施例1重組糖基化干擾素畢赤酵母表達系統(PKLN-2)的構建與表達畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種甲醇酵母，同動植物系統相比，它具有操作簡 單的優點；和原核生物大腸桿菌等不一樣，畢赤酵母能對要表達的蛋白質進行正確折疊因 而具備天然生物活性；此外，這種甲醇酵母能夠實現高密度發酵，而且其轉化子能夠非常穩 定地表達外源蛋白質，更適應工業化生產。因此本發明中選擇畢赤酵母作為rIFN的表達宿 主菌。
1. IFN基因的PCR擴增1. 1人血白細胞基因組DNA的提取方法按常規提取方法進行用右旋檸檬酸處理新鮮血液后，離心沉淀白細胞。將白細胞懸浮在抽提緩沖液中，37°C保溫lh。加蛋白酶K水解蛋白質，酚抽提，乙醇沉淀。提取 的 DNA 溶于 TE (ρΗ8· 0)，_20°C保存。1. 2引物設計合成及PCR反應為了獲得IFN的cDNA，本發明人采用全基因合成的方法進行克隆。序列設計參考 文獻報道的 IFN 的基因序列(Ullrich A,Gray A,Berman C，et al,Nature, 1983,Vol. 303, 821-825)。本發明人設計的5'和3'端序列分別含有酶切位點Xho I及酵母α因子信號 肽切割位點AAA AgA, 3'端序列含有酶切位點Not I及終止密碼TGA TAA，以適應酵母表達 載體pPIC9KL，及保持閱讀框架正確。設計5'和3'端序列分別如下引物 1 :5' CTCGAG AAA AGA TCT TCT TCT CAC CCA ATC 3'Xho I 引物 2 :3' CGCCGGCG AAT AGT AGA CTG TCG GAA AGA 5'Not I取上述提取的正常人血白細胞基因組DNA為模板，以引物PI、P2分別進行PCR擴 增，擴增條件為94°C變性50sec，55°C退火60sec，72°C延伸90sec，共進行35個循環。PCR 產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收。回收合成的rIFN DNA片斷，插入載體pPIC9KL(本實驗
室改建)。2.表達質粒pPKLIFN的構建酵母表達質粒選用本實驗室改建的PPIC9KL。pPIC9KL是經我實驗室從質粒pPIC9K突變衍生而來。pPIC9K原為Invitrogen公 司產品(Cat. No. VI75-20)。pPIC9K質粒原在AOXI 3’端及3’ AOXI基因處各有一個XhoI 位點，無法用XhoI位點插入。我實驗室將質粒pPIC9K用Xho I酶酶切，經klenow酶補平后，該位點由5' CTCGAG 3'5' -C—G-3'3' GAGCTC 5'變為 3' -G-C-5‘用T4DNA Iigase連接，轉入大腸桿菌DH5 α。這樣切割補平后可能得到四種產物 兩個相同的Xho I同時切開補平；兩個相同的Xho I同時都沒有切開；兩個酶切位點各只切 開一個補平。用含100ug/ml AMP的LB液體培養基，37°C條件下振蕩培養至OD6tltl約0. 5，離 心收集菌體，提取質粒，測序，選擇非polylinker 5’端的Xho I酶酶切位點切開并補平的 質粒(polylinker 5，端的Xho I酶酶切位點未切開)為pPIC9KL質粒。這樣AOXI 3，端 WPpolylinker 5’端)的XhoI位點就成為單酶切位點，使得rIFN基因可以從此位點插入 質粒載體，保證了閱讀框架正確，酵母α因子信號肽切割后的第一個氨基酸即為rIFN的第 一個氨基酸ATG，從而酵母表達分泌的rIFN為完整的與天然IFN N端氨基酸序列一致的蛋 白質產品。我們改造后的質粒PPIC9K具有單一 XhoI酶切位點，我們將其命名為PPIC9KL。 質粒結構圖見圖1。所用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統，它由野生型石油酵母Yl 1430 突變而來，常用的3株宿主菌是GS115、KM71和MC100-23。GS115和KM71是Y11430的組氨醇脫氫酶基因(histidinol dehydrogenase gene，his4)缺失突變體，不能合成His4，因此 質粒載體需攜帶his4，轉染后的陽性重組子可以用his4缺陷(his4)平板進行篩選，GS115 的啟動子為PA0X1，在含甲醇的培養基中可以快速生長。本發明中優選畢赤酵母GS115。甲醇營養型酵母KM71的啟動子為PARG4，除了 his4外，其精氨酰琥珀酸裂解酶基 因(argininosuccinate lyase gene, arg4)也被缺失突變，不能在缺乏Arg的培養基上生 長。KM71的基因型為his4arg4aox 1 :ARG4，由于野生型ARG4基因插入截斷了 A0X1，KM71 只有依賴較弱的A0X2基因進行甲醇代謝，生長速度較為緩慢。MC100-23的兩個AOX基因 都被剔除，其基因型為his4arg4a0X 1 SARG4A0X2 :Phis4，完全不能在含甲醇的培養基上 生長。但是，蛋白酶缺失型菌株生長緩慢，導致外源蛋白質產量上不去。巴斯德畢赤酵母包 括自我復制型游離載體和整合型載體，前者極不穩定，因此一般采用整合型載體。常見整 合型載體如 pPIC3、pPIC3. 5K、pPHIL_D2、pA0815、pPICZ、pPHWOlO、pGAPZ、pPIC9、pPIC9K、 pPHIL-Sl、pPICZa (A、B、C)、pGAPZa、YAM7SP6。構建好的巴斯德畢赤酵母表達載體被相應的內切酶消化變成線狀，用電穿孔法將 線性化載體轉化到宿主菌中。線性化的位置不同使載體有兩種方式與宿主菌染色體整合。 當消化載體產生的DNA片段與5' AOXl和3' AOXl兩端同源時，線性化載體DNA可以直接 替代基因組A0X1，即發生了單位點置換，產生Muts表型的陽性重組菌株；當酶切位點發生 在AOXl的5'端或HIS4標記內時，線性化載體DNA將在基因組的同源位點發生整合，Mut 表型由宿主菌決定。巴斯德畢赤酵母具有翻譯后修飾功能，如信號肽加工、蛋白質折疊、二 硫鍵形成和糖基化作用等，特別適合于生產醫藥用重組蛋白質。
3. cDNA序列測定分別用pPIC9K 的測序引物 5，AOXI Pichia 禾Π 3，AOXI Pichia sequencing primer(購自Irwitrigen公司)進行正、反向測序。將上述測序圖譜用計算機讀序并整合 正、反向測序結果，得到cDNA序列并翻譯成對應氨基酸。測序結果與文獻報道(Ullrich A, Gray A, Berman C, et al, Nature, 1983，Vol. 303,821-825)的 rIFN 的 cDNA 堿基和氨基酸 序列一致。表明本發明人克隆得到的rIFN cDNA是正確的。4.酵母轉化宿主菌優選畢赤酵母GS115。GS115(購自Invitrogen公司)的基因型為 his4mut+0感受態細胞的制作方法如下用GS115單菌落接種5mL YPD(Yeast Extract 1%, Peptone 2%,Dextrose 2% )液體培養基，30°C過夜培養，取ImL轉接到200mL YPD培養基 中繼續培養，當其OD6tltl達到1. 5左右時，停止培養，離心(5000rpm)收集菌體，然后分別用去 離子水和lmol/L山梨糖醇(D-Sorbitol，Sigma)各洗滌2次，最后加入ImL預冷的lmol/L 山梨糖醇，按每管100 μ L分裝成備用的畢赤酵母感受態細胞，保存于-70°C。酵母轉化采用電穿孔的方法。電穿孔操作方法如下用SalI酶切質粒pPKLIFN， 再將線性化的酵母表達載體質粒轉入GSl 15感受態細胞。取線性DNA0. 3 μ g與100 μ L感 受態細胞混合后，注入預冷的0.2cm電擊杯(Bio-Rad)中，輕敲電擊杯，使混合物落入電擊 杯底部，在電擊儀(Bio-Rad)上設定電壓為1.5kV，電容為25 μ F，電阻為400 Ω，進行電穿 孔操作。電穿孔后，立即加入0.9mL預冷的lmol/L山梨糖醇于電擊杯中，混勻后從中吸出 200 μ L，立即涂布 MDS 轉化培養基(1. 34% YNB, (4X1(T5) % Biotin, 1% Dextrose, lmol/LD-Sorbitol)，然后倒置平板于30°C，培養2天后轉化子開始出現。5.酵母轉化子的篩選含AOXl-IFN基因和His4 (組氨酸脫氨酶基因)序列的片段通過同源重組插入或 置換整合到酵母基因組中His4基因上。由于表達載體含有卡那霉素抗性基因，它能使酵母 細胞對G418產生抗性。對G418抗性程度基本取決于卡那霉素抗性基因整合到酵母基因組 中的數目。因此本發明人通過不同濃度的G418篩選來獲得多拷貝轉化子。轉化子涂板MD 培養基上，30°C培養3天后，將MD培養基上生長的轉化子用牙簽刮下，用無菌水稀釋到每 毫升IO5個細胞，再取200μ 1涂布于不同濃度的G418-MD平板，G418濃度分別為1. 0、2. 0、 4.0mg/ mL。培養48h篩選出多拷貝轉化子。結果在4mg/mL G418的MD平板上篩選到3個 多拷貝轉化子。PCR驗證及多拷貝數估計挑取多拷貝轉化子單菌落，提取轉化子的基因組DNA， 分別以 5，A0XI Pichia 和 3，AOXI Pichia sequencing primer 為引物進行 PCR 擴增。PCR 擴增產物瓊脂糖電泳檢查，3個多拷貝轉化子均產生1. Ikb的DNA條帶，即均為陽性。上述 操作參照Invitrogen公司multicopy expression kit manual說明書進行。將上述轉化 子用搖瓶表達，選取表達水平較高的2號轉化菌作為rIFN酵母工程菌，命名為PKLN-2。6. rIFN酵母工程菌(PKLN-2)的檢定和表達6. 1甲醇利用表型分析對酵母工程菌PKLN-2克隆進行甲醇利用表型分析。經MM和MD培養基生長比較， 確定酵母工程菌pPKLN-2的甲醇利用表型為Mut+。6. 2抗生素抗性特征未轉化的宿主菌GS115在YPD培養基上生長，在G418-YPD培養基上(4mg/mL G418)不生長。轉化后的工程菌PKLN-2在YPD培養基上和G418-YPD培養基上都生長良好。上述結果表明酵母工程菌PKLN-2具有卡那霉素(G418)的抗性。6. 3工程菌的表達與表達產物分析PKLN-2 菌落接種 IOml 酵母完全培養基(1. 18% KH2PO4,0. 3% K2HPO4 ·3H20，1 %甘 油，1. 34% YNB，4X 10_7生物素)，于28°C振蕩培養8h，然后加入90mL新鮮培養基。再振蕩 培養20h。加入甲醇進行48h誘導，培養液離心后，取上清進行SDS-PAGE分析，并檢測上清 中IFN的生物活性。PKLN-2的分泌表達量約為每毫升培養上清分泌表達160 μ g，IFN占細 胞總蛋白量的28. 7%,Western blotting檢測表明具有免疫活性.經純化后其純度可達到 98%以上。用8 9d齡的雞胚背根神經節測定其生物學活性，結果表明它具有明顯的促進 DRG突起生長的作用，通過計算其生物學活性高于lX106U/mg。電泳和生物活性結果均表 明rIFN被畢赤酵母分泌到培養液中，并且具有天然生物活性。經疏水層析柱和CM-S印harose層析柱純化，即得純化的rIFN，純化的rIFN做免疫 印跡鑒定，結果與抗IFN抗體呈陽性反應。使用酵母工程菌PKLN-2，在上述培養條件下，所分泌表達的目的蛋白純化產物N 端序列測定表明符合所設計的rIFN的N端氨基酸序列，即信號肽切割正確。根據以上檢定結果，表明工程菌PKLN-2是rIFN的酵母表達工程菌，由此而建立 的表達純化工藝是可行的。
實施例2重組糖基化干擾素畢赤酵母表達系統(PPIC9K)的構建與表達1. IFN基因的PCR擴增1. 1人血白細胞基因組DNA的提取制備方法同實施例一。1. 2引物設計合成及PCR反應參考文獻報道的IFN 的基因序列(Ullrich A, Gray A, Berman C, et al, Nature, 1983，Vol. 303,821-825)，我們設計合成了一對引物，以便于克隆表達，在其兩端分別引入 T EcoRI和Xba I酶切位點，引物如下Pl :5，CCGAATTCTTATCTCACAGCCTTCCTGCT 3，P2 5' CGTCTAGATCAGGCTCTTCTCACAGC 3'取上述提取的正常人血白細胞基因組DNA為模板，以引物PI、P2分別進行PCR擴 增，擴增條件為94°C變性50sec，55°C退火60sec，72°C延伸90sec，共進行35個循環。PCR 產物經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳回收。2.重組質粒pPIC9K-IFN的構建將上述PCR擴增片段克隆到pGEM-T easy載體上(實驗過程按Promega說明書)， 采用氯化鈣法轉化轉化大腸桿菌JM109，得到重組質粒，命名為pT-IFN。將質粒pT-IFN和 酵母表達質粒PPIC9K分別用EcoR I和Xho I雙酶酶切后，回收片段，在T4DNA連接酶的作 用下進行連接，得到重組表達質粒，命名為PPIC9K-IFN。3.畢赤酵母轉化本實施例中宿主菌優選畢赤酵母GSl 15(購自Invitrogen公司)。感受態細胞的制備制備方法同實施例一。畢赤酵母電轉化酵母表達質粒pPIC-IFN用Sac I酶切后，電轉化畢赤酵母 GSl 15，電轉化方法同實施例一。4.酵母轉化子的篩選由于構建的表達載體含有Kanamycine抗性基因，可直接根據抗藥性進行篩 選。因此本發明人通過不同濃度的Kanamycine進行篩選，來獲得多拷貝轉化子。實驗中 Kanamycine的濃度分別為10 μ g/mL、20 μ g/mL、30 μ g/mL、40 μ g/mL，實驗方法同實施例 一。結果在30 μ g/mL Kanamycine的MD平板上篩選到6個多拷貝轉化子。PCR驗證及多拷貝數估計同實施例一。將上述轉化子用搖瓶表達，選取表達水平較 高的5號轉化菌作為rIFN酵母工程菌，命名為PPIC-5。5. rIFN酵母工程菌(PPIC-5)的檢定和表達5. 1甲醇利用表型分析實驗方法同實施例一，結果表明酵母工程菌PPIC-5的甲醇利用表型為Mut+。5.2抗生素抗性特征實驗方法同實施例一，結果表明酵母工程菌PPIC-5具有Kanamycine的抗性。5.3工程菌的表達與表達產物分析實驗方法同實施例一。取發酵上清進行SDS-PAGE分析，可以看見一條明顯的表達帶，分子量為28kD，在 完全解聚的誘導表達菌株樣品中有一明顯條帶對應著14kD，這同IFN單體的分子量相當。經電泳掃描分析，IFN占細胞外泌總蛋白量的12.6%，Western blotting檢測表明具有免 疫活性。使用構建的工程菌PPIC-5表達rIFN，經疏水層析柱和CM-S印harose層析柱純化 后，即得純化的rIFN，經分析，rIFN的純度可達95%以上。純化的rIFN做生物活性分析， 其活性約為8X 103U/mg。電泳和生物活性結果均表明rIFN被畢赤酵母分泌到培養液中，并 且具有天然生物活性。根據以上檢定結果，表明工程菌PPIC-5是rIFN的酵母表達工程菌，由此而建立 的表達純化工藝是可行的。但是，與實施例三相比，用構建的工程菌PPIC-5表達糖基化干 擾素其純度和生物學活性均要低。實施例3重組糖基化干擾素畢赤酵母(PKLN-2)的發酵、純化制備本實施例優選實施例一中構建的酵母工程菌PKLN-2進行rIFN的發酵表達。1、菌種活化取凍存甘油菌株，劃YPD平板，28°C溫育活化48h。2、一級種子培養取50mL BMG搖瓶培養基，接入YPD平板活化的菌落，28°C、250rpm振蕩培養24h， 至菌液OD6c 為11左右。3、二級種子培養取新鮮BMG培養基(體積為上罐基礎料體積的10% )，按1 2%向二級種子液中 接入一級種子液，接種前向種子液中加入10XYNB和500XBiotin，28°C、250rpm振蕩培養 24h，至菌液OD6tltl為20左右。4、高密度發酵表達發酵過程中，溫度設定為28°C，溶解氧量(DO)控制在30%以上，pH在培養期間設 定為5. 2，在準備誘導之前2 3h逐漸降低pH至5. 0，并使誘導過程中的pH維持在5. 0左
右ο補加甘油的前提應該是罐內甘油消耗完全(表現為DO急速上升至70 80% )， 此時通過調節甘油速度來控制D0，使其維持在30%以上。補加甘油的最佳時間一般為發酵 培養18 20h。當甘油流加完畢，罐內碳源消耗完全，DO快速上升，即可開始誘導表達。先用手動 補加少量甲醇，待這部分甲醇被消耗完畢，酵母菌已適應甲醇作為營養碳源后，開始從低速 度流加甲醇。誘導過程中通過調節甲醇的流加速度，維持DO在30%以上。最佳誘導時間為 48 72h。5、上清液分離發酵結束，于4°C條件下經5，OOOrpm離心30min，取上清，棄沉淀菌體，保留上清液。6、超濾濃縮離心后的發酵上清液經5，000MWC0超濾膜超濾濃縮至發酵液體積的1/5，加入3倍 體積pH為4. 5的20mmol/L醋酸緩沖液，繼續超濾濃縮，重復上述操作3次。然后取濃縮液 于4°C條件下經10，OOOrpm離心20min除去沉淀，取上清液，置于4°C保存備用或直接用于 下一步純化。7、疏水層析
疏水層析純化的條件為填料為S^harose C4 ；環境溫度為4°C ；緩沖液 為濃度1. Omol/L (NH4) 2S04/20mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 5)；洗脫液分別為0. 5 0. 2M(NH4) 2S04/20mmol/L 醋酸緩沖液(pH4. 5)、20mmol/L 醋酸緩沖液(pH4. 5)。8、離子交換離子交換純化的條件為填料為CM Sepharose F. F.；環境溫度為4°C ；緩沖液為 20mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 5)；洗脫液分別為0. 1 0. 15mol/L NaCl/20mmol/L醋酸緩沖 液(ρΗ4· 5)、0· 3 0. 5mol/L NaCl/20mmol/L 醋酸緩沖液(pH4. 5)。9、脫鹽收集離子交換純化洗脫樣品，以20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH4. 5)為緩沖液，過 G-25凝膠，收集紫外吸收峰，即得到純度> 99%，生物比活性高于105U/mg的IFN純品。通過實驗表明，酵母表達系統可以用于表達重組糖基化干擾素。質粒pPIC9KL與 PPIC9K相比較，質粒pPIC9KL具有明顯的優勢改造后的質粒pPIC9K具有單一 XhoI酶切位 點，保證了酵母表達分泌的rIFN為完整的與天然IFN N端氨基酸序列一致；而pPIC9K質粒 具有兩個XhoI位點，插入IFNcDNA后酵母表達分泌的rIFN比天然的IFN多出或者減少幾個 氨基酸，分泌的IFN生物活性較低。由于實施例一引入了酵母α因子信號肽切割位點AAA AgA,具有更穩定、更高效的外泌表達。pPIC9KL-IFN所表達的rIFN核心寡聚糖鏈上無末端 α 1，3甘露糖，抗原性較低，對活性基本無負面影響，特別適合于醫藥生產用重組蛋白。 對比實驗發現，用畢赤酵母表達系統pPIC9KL-IFN表達的rIFN純化后純度達98 % 以上，生物學活性高于1 X 106u/mg,。而用PPIC9K-IFN表達系統表達的IFN純化后純度只 能達到95%，生物學活性也只有8X103U/mg。因此畢赤酵母表達系統表達的IFN與大腸桿 菌表達系統及其它的酵母表達系統表達的IFN相比，表達效率高，蛋白活性好，即畢赤酵母 表達系統PPIC9KL-IFN具有明顯的優越性。以上實施例均能得到正確高效表達IFN的工程菌株，獲得高生物學活性的IFN。我 們將巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris)，表達載體質粒pPIC9KL、宿主菌GSl 15作為最優 選擇。不限制本發明對其他表達系統的權利要求。以上對本發明的詳細描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變和變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求所定義的范圍。
權利要求
一種表達糖基化干擾素的表達載體，將編碼糖基化干擾素的基因插入酵母表達質粒而構建，其具有圖1所示的結構。所用的酵母表達系統包括甲醇營養型酵母表達系統(包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統、漢森酵母(Hansenula.Polymorpha)表達系統、假絲酵母(Candida)和球擬酵母(Torulopsi)表達系統等)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表達系統、裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表達系統等等。表達載體可分為胞內表達載體和分泌型表達載體。常見的表達載體有pPIC3、pPIC3.5K、pPHIL-D2、pAO815、pPICZ、pPHWO10、pGAPZ、pPIC9、pPIC9K、pPHIL-S1、pPICZa(A、B、C)、pGAPZa、YAM7SP6、pVT 102U/α等等。
2.一種表達糖基化干擾素的表達系統，其含有由權利要求1所述的表達載體。
3.權利要求2所述的表達系統，其特征在于所述表達系統由所述表達、載體轉化酵母 宿主構建而成。
4.權利要求3所述的表達系統，其特征在于所述酵母宿主為巴斯德畢赤酵母 (PichiaPastoris)0
5.一種制備重組糖基化干擾素的方法，包括下述步驟A、將編碼糖基化干擾素的基因可操作地連接于表達載體pPIC9K，構建表達糖基化干擾 素的重組表達載體；B、用所述重組表達載體轉化酵母宿主，構建表達糖基化干擾素的酵母表達系統；C、培養所述酵母表達系統，獲得重組糖基化干擾素。
6.權利要求5所述的方法，其中所述的酵母宿主為巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris)0
7.權利要求5所述的方法，其中進一步包含將獲得的重組糖基化干擾素純化的步驟。
全文摘要
本發明提供了一種新的表達糖基化干擾素的酵母表達系統，其具有表達產率高；產物具天然結構和生物活性，無需變性和復性；培養基簡單、價廉；熱源性物質減少；產率顯著提高，生產成本大幅度降低等優點。本發明還提供了利用該表達系統制備糖基化干擾素的方法。
文檔編號C07K14/555GK101831455SQ20101015066
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月20日 優先權日2010年4月20日
發明者劉振平, 張大偉, 王加旺 申請人:劉振平