具有改進的穩定性和快速發光的親水高量子產率吖啶酯的制作方法
【專利說明】具有改進的穩定性和快速發光的親水高量子產率吖啶酯
[0001] 1.對相關申請的交叉引用 本申請要求2013年7月8日提交的美國臨時申請序列號No. 61/843, 528的優先權， 其全文經此引用并入本文。
[0002] 2.發明領域 本發明涉及具有提高的光輸出、改進的穩定性、快速發光和低非特異性結合的親水、高 量子產率化學發光吖啶鑰化合物。這些化合物因其提高的量子產率和親水性質而可用于改 進檢測靈敏度。這些化合物的改進的穩定性有助于延長使用這些化合物的試劑的貯存壽命 以及使檢測性能隨時間的變化最小化。它們的提高的發射動力學尤其在自動化分析儀中的 檢測中還能實現更快的光測量。
[0003] 3.發明背景 化學發光的吖啶酯（AE)是已廣泛用于免疫測定和核酸測定的極其有用的標記物。 Pringle, M. J. JoyraaJ ο/1 第忍卷，第 105-122 頁（1999)的 綜述概括了這類化學發光化合物過去和當前的發展。
[0004] McCapra, F.等人在 TfeiraAeiimw Zeii.第丈?卷，第 3167-3172 頁（1964)中和 Rahut等人在J (5/芯CAe?第卷，第3587-3592頁（1965)中公開了可通過堿性過氧 化物觸發來自吖啶鑰鹽的酯的化學發光。自這些開創性研究以來，由于它們作為標記物的 效用，對吖啶鐵化合物的興趣已經增加。Simpson, J.S.A.等人，Tfe tore,第276卷，第 646-647頁（1979)公開了吖啶酯9-羧基苯基-N-甲基吖啶鑰溴化物在免疫測定中的應用。 但是，這種吖啶酯相當不穩定，由此限制其商業應用。這種不穩定性來源于酚和吖啶鑰環之 間的9-羧基苯基酯連接基的水解。
[0005] 已經描述了用于提高吖啶鐵化合物的穩定性的不同策略。Law等人，JoyraaJ ο/1 組第 4卷，第 88-89 頁（1989)將兩個甲基引入 吖啶酯部分的側面以穩定這種連接基。發現所得空間穩定的吖啶酯，DME-NHS [10-甲基 吖啶-9-甲酸2'，6'-二甲基-4'-(N-琥珀酰亞胺氧基羰基）苯基酯]具有與不含這兩個 甲基的吖啶酯相同的光輸出。前一化合物在結合到免疫球蛋白上時的穩定性極優并且甚至 在37°C下在pH 7下一周后也沒有表現出化學發光活性的損失。相反，未取代的吖啶酯在 經受相同處理時僅保留其活性的10%。美國專利No. 4, 918, 192和5, 110. 932描述了 DMAE 及其應用。
[0006] 授予Law等人的美國專利No. 5, 656, 426公開了 DMAE的一種親水形式，被稱作 NSP-DMAE-NHS酯，其中N-甲基基團已被N-磺丙基（NSP)所替代。下面圖解這兩種化合物 的結構和吖啶鑰環的編號系統。
[0007] Natrajan等人在美國專利No. 6, 664, 043 B2中公開了具有連接到 酚上的親水改性劑的NSP-DMAE衍生物。在上文中圖解了 一種這樣的化合物， NSP-DMAE-HEG-Glutarate-NHS (縮寫為HEG-AE)的結構。在這種化合物中，二氨基六（乙 二醇）（diamino hexa(ethylene) glycol，二氨基-HEG)部分連接到酸上以提高該吖啶酯 的水溶性。戊二酸酯部分附加到HEG的末端并轉化成NHS酯以便能標記各種分子。
[0008] Kinkel 等人, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 第 4卷， 第 136-139 頁（1989)和 Mattingly, Journal of Bioluminescence and 〇￡7??_/知^?_//76'6^6'/^6'，第^卷，第107-114頁（1991)和美國專利1'1〇.5,468,646描述了不 同的一類穩定的化學發光吖啶鑰化合物。在這類化合物中，酚酯連接基被磺酰胺部分所替 代，這據報道提供水解穩定性而不損害光輸出。在吖啶酯中，酚是"離去基"，而在吖啶鑰磺 酰胺中，磺酰胺是與堿性過氧化物的化學發光反應過程中的"離去基"。
[0009] 通常通過堿性過氧化物觸發來自吖啶鑰化合物的發光。總光輸出--也可被稱作 化學發光量子產率，是該化學反應導致形成激發態吖啶酮的效率和激發態吖啶酮的熒光量 子產率的組合。
[0010] 最近，Natrajan等人在美國專利No. 7, 309, 615 B2 (其公開內容經此引用并入本 文）中描述了在吖啶鑰環的C2和/或C7上含有親水烷氧基（0R*)的親水、高量子產率吖啶 鑰化合物，其中R*是包含磺丙基部分或乙二醇部分或其組合的基團。來自此類化合物的提 高的光輸出和它們的親水性質使它們可用于改進免疫測定的靈敏度。下面圖解一種這樣的 化合物 NSP-2, 7-(0MHEG)2-DMAE-AC-NHS (縮寫為 HQYAE)的結構。
[0011] 4.發明概述 已經令人驚訝地發現，在吖啶鑰環的C2和/或C7上具有-OG形式的給電子官能團的 親水、高量子產率化學發光吖啶酯提供提高的光輸出、改進的穩定性、快速發光和/或在檢 測中的低非特異性結合，其中G代表支鏈親水的取代基。
[0012] 在本發明的一個方面中，提供了親水、高量子產率吖啶酯，其具有式（I)的結構：
其中，R1是甲基或磺丙基；G是支鏈基團，其在每次出現時獨立地選自：
其中R2、R3、R4、R5、iaP R7在每次出現時獨立地為甲基或基團-(CH2CH2O)bCH 3,其中是 1至5的整數；且R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物 的結合分子上的親電子或親核基團。
[0013] 在根據式（I)的一些實施方案中，G在一處或在兩處出現時是基團：
其中私和R3在每次出現時獨立地為甲基或基團-(CH2CH2O) bCH3,其中是1至5的整 數；且特別地，G可以在一處或在兩處出現時是基團：
;或在另一實施方案中G可以在一處或在兩處出現時是基團：
[0014] 在一個相關實施方案中，G在一處或在兩處出現時是基團：
[0015] 在根據式（I)的其它實施方案中，G在一處或在兩處出現時代表基團：
其中HRjP R7在每次出現時獨立地為甲基或基團-(CH2CH2O)bCH 3,其中是1至5 的整數。在根據這一實施方案的一個變體中，R4-R7可代表甲基，以使G在一處或在兩處出 現時是基團：
[0016] 在根據式（I)的一個實施方案中，G在一處或在兩處出現時是基團：
[0017] 在根據式（I)的吖啶酯中，R12可以例如選自： (1) -OH ； (2) -O-N-琥珀酰亞胺基； (3) -NH- (CH2) 5-C (0) -O-N-琥珀酰亞胺基； (4) -NH- (CH2) 5-C00H ； (5) -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C (0) -O-N-琥珀酰亞胺基，其中/? = 1 至 5; (6) -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C00H，其中 λ = 1 至 5 ; (7) -NH-(C2H4O)b-C 2H4NH2，其中 /? = 1 至 5 ;和 (8) -NH-R-NHR，其中R獨立地為氫、烷基、烯基、炔基或芳烷基；其中R任選包含最多20 個雜原子。
[0018] 在各種不例性實施方案中，R12是_〇Η，或R 12是基團： -NH-(C2H4O)b-C2H4NH 2,其中刀=1 至 5， 或Ri2是基團： -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C (0) -0-R' '，其中 /?= 1 至5;且其中 R'' 是氫 或-N-琥珀酰亞胺基。
[0019] 一種根據式（I)的吖啶酯具有下列結構：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。
[0020] 另一根據式（I)的吖啶酯具有下列結構：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。
[0021] 又一根據式（I)的吖啶酯具有下列結構：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。
[0022] 另一根據式（I)的吖啶酯具有下列結構：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。
[0023] 再一根據式（I)的吖啶酯具有下列結構：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。
[0024] 在根據式（I)的吖啶酯的一個示例性實施方案中，R12代表-OH。
[0025] 在本發明的另一方面中，提供了一種用于檢測或量化被分析物的測定法，其包括 步驟：(a)提供一種綴合物，其包含：（i)被分析物的特異性結合分子；和（ii)根據式（I) 的親水、高量子產率和快速發光的吖啶酯；(b)提供具有固定在其上的被分析物的第二特 異性結合分子的固體載體；(C)混合所述綴合物、所述固相和懷疑含有所述被分析物的樣 品以形成結合復合物；（d)分離捕獲在所述固體載體上的結合復合物；（e)通過添加化學 發光觸發劑觸發來自步驟（d)的結合復合物的化學發光；（f)用光度計測量發光量；和（g) 通過將來自反應混合物的發光量與將發光量與被分析物的已知濃度相關聯的標準劑量響 應曲線比較，來檢測被分析物的存在或計算被分析物的濃度。
[0026] 在一個相關方面中，提供了一種用于檢測或量化被分析物的測定法，其包括步驟： (a)提供被分析物與根據式（I)的親水、高量子產率和快速發光的吖啶酯的綴合物；(b) 提供固定有被分析物的特異性結合分子的固體載體；（C)混合所述綴合物、固體載體和懷 疑含有所述被分析物的樣品以形成結合復合物；（d)分離捕獲在所述固體載體上的結合復 合物；（e)通過添加化學發光觸發劑觸發來自步驟（d)的結合復合物的化學發光；(f)用 光度計測量光量；和（g)通過將反應混合物的發光量與將發光量與被分析物的已知濃度 相關聯的標準劑量響應曲線比較，來檢測被分析物的存在或計算被分析物的濃度。
[0027] 通過參考以下發明詳述和所附權利要求書更清楚地理解本發明的這些和其它方 面。
[0028] 5.附圖簡述 圖1圖解了具有適用于制備蛋白質或其它含親核官能團的分子的綴合物的親電子 N-羥基琥珀酰亞胺基（NHS)官能團的B-AE的結構。
[0029] 圖2圖解了具有可用于使該吖啶鑰化合物與含親電子官能團的分子綴合的親核 六乙二醇胺（HEG-NH 2)官能團的B-AE結構。
[0030] 圖3顯示使用圖2的B-AE制備的雌二醇綴合物(縮寫為B-AE-E2)的結構。
[0031] 6.優選實施方案的描述 在口丨z陡鐵環的C2和/或C7上引入給電子官能團如0R*提尚相應的化學發光卩丨z陡鐵化 合物的量子產率。當該R*基團為親水的，如磺丙基或甲氧基聚（乙二醇）時，相應的吖啶 鑰化合物不僅表現出提高的光輸出，還表現出在免疫測定中降低的非特異性結合。這兩種 性質共同導致免疫測定的靈敏度提高。
[0032] 本發明的主要目的是確認導致（a)與NSP-DMAE和衍生物以及HQYAE相比時更快 的發光；(b)尤其與HQYAE相比時改進的穩定性；（c)與HQYAE相當的高光輸出和（d)與 HQYAE相當的低非特異性結合的吖啶鑰化合物的結構特征。
[0033] 根據本發明的親水吖啶鑰化合物，縮寫為B-AE (支鏈-吖啶酯)，不僅表現出提高 的光輸出，還表現出改進的穩定性和更快的發光。穩定性是指吖啶鑰化合物的化學發光活 性。穩定性的提高因此表現為化學發光活性的提高的經時保持性。吖啶鑰化合物的提高的 穩定性是有用的，因為衍生自此類化合物的試劑較不可能表現出檢測性能的經時劣化，此 外，可能延長衍生自此類化合物的試劑的貯存壽命，由此造成較少浪費。通常，衍生自吖啶 鑰化合物的檢測試劑包括蛋白質或小分子的綴合物。該吖啶鑰化合物的第二種性質是更快 的發光，這意味著這些化合物與缺乏本發明的吖啶鑰化合物的獨特結構特征的吖啶鑰化合 物相比在