錄質譜并使用未標記抗體作為基準。將大 約2微升的綴合物溶液與2微升芥子酸（sinnapinic acid)基質溶液（HP)混合并點涂在 MALDI板上。在完全干燥后，記錄質譜。可以由未標記抗體和綴合物的質量值的差值測量 AE并入程度。通常，在這些標記條件下，在抗體中并入3-6 AE標記物。
[0110] 實施例10 穩定性的測暈。吖啶酯的穩定性的最大化是用于提高檢測精確度的一種參數。就吖啶 酯的分子結構與在4°c的標稱儲存溫度和37°C的升高的儲存溫度下的化學發光穩定性的 相關性分析共價連接到抗-TSH抗體上的幾種吖啶酯的化學發光穩定性。將各自綴合到不 同吖啶酯上的等量的吖啶酯標記的抗TSH (促甲狀腺激素)抗體在由0.1 M N-(2-羥乙基） 哌嗪-Ν' -2-乙磺酸鈉 （HEPES)、0. 15 M氯化鈉、7. 7 mM疊氮化鈉、I. 0 mM乙二胺四乙酸四 鈉 （EDTA)、12 mM叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（Triton X-100)、76 uM牛血清白蛋白（BSA)、 7 uM 小鼠免疫球蛋白（IgG)，pH 7. 7 構成的 Siemens Healthcare Diagnostics TSH3 (促 甲狀腺激素)Lite Reagent緩沖液中稀釋到0. 2納摩爾的濃度。將各吖啶酯溶液分配到兩 組儲存容器中。一組儲存容器保持在4°C，另一組保持在37°C。從最初稀釋的那天開始， 在 Berthold Technolgies Autolumat LB953 光度計上在相繼添加 300 微升的各 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 1 (0.1 M 硝酸和 0.5% 過氧化氫）和 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 2(0.25 M 氛氧化納和 0.05% 十六烷基三甲基氣 化銨）下在標準條件下測定來自10微升的各吖啶酯-抗體溶液的化學發光。
[0111] 實施例11 非特異件結合分數的測量。吖啶酯與固相的非特異性結合分數（fNSB)的最小化是用 于提高檢測精確度的一種參數。就與吖啶酯的分子結構的相關性分析共價連接到抗TSH抗 體上的幾種吖啶酯的非特異性結合分數。將各自綴合到不同吖啶酯上的等量的吖啶酯標記 的抗TSH (促甲狀腺激素)抗體在由0.1 M N-(2-羥乙基）哌嗪-N'-2-乙磺酸鈉 （HEPES)、 0.15 M氯化鈉、7. 7 mM疊氮化鈉、1.0 mM乙二胺四乙酸四鈉 （EDTA)、12 mM叔辛基苯氧基 聚乙氧基乙醇（Triton X-100)、76 uM牛血清白蛋白（BSA)、7 uM小鼠免疫球蛋白（IgG)， pH 7. 7 構成的 Siemens Healthcare Diagnostics TSH3 (促甲狀腺激素）Lite Reagent 緩沖液中稀釋到2納摩爾的濃度。接著，100微升含吖啶酯的溶液各用200微升的馬血清 (Siemens Healthcare Diagnostics Multi-diluent 1)和 200 微升的兩種固相的任一種 稀釋。第一種固相是含有50微克用抗PTH抗體衍生化的磁性膠乳微粒（MLP)的200微升 Siemens Healthcare Diagnostics ACS PTH (甲狀旁腺素)固相。第二種固相是含有60微 克用抗TSH抗體衍生化的順磁性微粒（PMP)的200微升Siemens Healthcare Diagnostics ACS TSH3 (促甲狀腺激素)固相。在培養10分鐘以使吖啶酯標記的抗體與固相之間相互作 用后磁力收集粒子并用水洗滌兩次。在Berthold Technolgies Autolumat LB953光度計 上在相繼添加 300 微升的各 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 1 (0.1 M 硝酸和 0.5% 過氧化氫）和 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 2 (0.25 M 氫氧化鈉和〇. 05%十六烷基三甲基氯化銨）下在標準條件下測量與該粒子締合的吖啶酯的 化學發光。測量化學發光5.0秒。作為粒子結合的化學發光與總化學發光輸入的比率計算 非特異性結合分數（fNSB)。一般而言，叮啶酯的疏水性提高fNSB并在識別出少量特定信號 (specific signal)時不合意，相反，[?丫啶酯的親水性降低fNSB并在識別出少量特定信號時 A音 口 >S、0
[0112] 實施例12 化學發光動力學的測量。吖啶酯化學發光速率的加速是可用于提高檢測吞吐率的一種 參數。就吖啶酯的分子結構與其化學發光速率的相關性分析共價連接到抗-TSH抗體上的 幾種吖啶酯的化學發光動力學。將各吖啶酯標記抗體在由0.1 M磷酸鈉、0.15 M氯化鈉、 6 mM疊氮化鈉和I g/L牛血清白蛋白（BSA)構成的緩沖液中稀釋到0. 2納摩爾的濃度。 在 Berthold Technolgies Autolumat LB953 光度計上在相繼添加 300 微升的各 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 1 (0.1 M 硝酸和 0.5% 過氧化氫）和 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 2(0.25 M 氛氧化納和 0.05% 十六烷基三甲基氣 化銨)下在標準條件下以0.1秒為間隔積分10微升的各受試吖啶酯-抗體綴合物的化學發 光動力學20秒。就發光的相對速率比較受試吖啶酯的化學發光動力學。
[0113] 實施例13 量子產率的測暈。提高吖啶酯化學發光量子產率是可用于提高檢測靈敏度的一種參 數。就吖啶酯的分子結構與它們的化學發光光輸出量級的相關性測試共價連接到抗TSH 抗體上的幾種吖啶酯的化學發光量子產率。將各吖啶酯標記抗體在由0.1 M磷酸鈉、0.15 M氯化鈉、6 mM疊氮化鈉和I g/L牛血清白蛋白（BSA)構成的緩沖液中稀釋到0. 2納摩爾 的濃度。在Berthold Technolgies Autolumat LB953光度計上在相繼添加300微升的各 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 1 (0.1 M 硝酸和 0.5% 過氧化氫）和 Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 2(0.25 M 氛氧化納和 0.05% 十六烷基 三甲基氯化銨)下在標準條件下測量10微升的各受試吖啶酯-抗體綴合物的化學發光動力 學10秒。作為化學發光與受試吖啶酯的量的比率計算化學發光量子產率。
[0114] 本說明中引用的所有專利和非專利文獻經引用并入本文。
[0115] 已通過優選實施方案的上文的描述說明本發明，但要理解的是，本領域的技術人 員可以作出這些實施方案的修改和變動而不背離如下列權利要求書中闡述的本發明的精 神或范圍。
【主權項】
1. 具有下列結構的親水、高量子產率叮晚醋：其中 Ri是甲基或橫丙基基團； G是支鏈基團，其在每次出現時獨立地選自： 或；其中1?2、1?3、1?4、35、36和1^在每次出現時獨立地為甲基或基團-畑2邸2〇)。邸3，其中打是 1至5的整數；且 Ri2是用于使叮晚鐵化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合分子上 的親電子或親核基團。2. 根據權利要求1的叮晚醋，其中G在一處或在兩處出現時是基團：其中Rz和R3在每次出現時獨立地為甲基或基團-(CH2邸2〇)。013,其中n是1至5的整 數。3. 根據權利要求2的叮晚醋，其中G在一處或在兩處出現時是基團：4. 根據權利要求2的叮晚醋，其中G在一處或在兩處出現時是基團：5. 根據權利要求2的叮晚醋，其中G在一處或在兩處出現時是基團：6. 根據權利要求1的叮晚醋，其中G在一處或在兩處出現時是基團：其中1?4、1?5為和1^在每次出現時獨立地為甲基或基團-(邸2邸2〇)。邸3，其中/?是1至5的整數。7. 根據權利要求6的叮晚醋，其中G在一處或在兩處出現時是基團：8. 根據權利要求6的叮晚醋，其中G在一處或在兩處出現時是基團：9. 根據權利要求I的叮晚醋，其中Ri2選自： (1) -OH; (2) -O-N-班巧酷亞胺基； (3) -NH-(邸2) 5-C(0) -O-N-班巧酷亞胺基； (4) -NH-(CHz)S-COOH; 妨-NH-(C化 0)n-Cz^NH-C(0)-(邸2)廠C(0) -O-N-班巧酷亞胺基，其中/7 = 1 至 5; (6) -NH-侶電0)。-〔2電畑-(：(0)-(邸2) 3-C00H，其中n= 1 至 5 ; (7) -NH-(C化0)。-〔2電畑2,其中打=1至5 ;和 (8) -NH-R-NHR，其中R獨立地為氨、烷基、締基、烘基或芳烷基；其中R任選包含最多20 個雜原子。10. 根據權利要求9的P丫晚醋，其中R12是-0H。11. 根據權利要求9的P丫晚醋，其中R12是 -畑-侶電0)。-〔2電畑2,其中。=1至5。12. 根據權利要求9的叮晚醋，其中R12是： -NH-侶馬0)C-CzHaNH-C(0)-(邸2) 3-C(0) -0-R，，，其中 /7= 1 至5;且其中R，' 是氨 或-N-班巧酷亞胺基。13. 根據權利要求1的叮晚醋，其具有下列結構：其中Ri2是用于使叮晚鐵化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。14. 根據權利要求1的叮晚醋，其具有下列結構：其中Ri2是用于使叮晚鐵化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。15. 根據權利要求1的叮晚醋，其具有下列結構：其中Ri2是用于使叮晚鐵化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。16. 根據權利要求1的叮晚醋，其具有下列結構：其中Ri2是用于使叮晚鐵化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。17. 根據權利要求1的叮晚醋，其具有下列結構：其中Ri2是用于使叮晚鐵化合物綴合到被分析物、被分析物類似物或被分析物的結合 分子上的親電子或親核基團。18. 根據權利要求14-18任一項的日丫晚醋，其中R12是-0H。19. 用于檢測或量化被分析物的測定法，其包括W下步驟： (a)提供一種綴合物，其包含：（i)被分析物的特異性結合分子；和（ii)根據權利要 求1的親水、高量子產率和快速發光的叮晚醋； 化）提供具有固定在其上的所述被分析物的第二特異性結合分子的固體載體； (C)混合所述綴合物、所述固相和懷疑含有所述被分析物的樣品W形成結合復合物； (d) 分離捕獲在所述固體載體上的結合復合物； (e) 通過添加化學發光觸發劑觸發來自步驟（d)的結合復合物的化學發光； (f) 用光度計測量發光量；和 (g) 通過將反應混合物的發光量與將發光量與被分析物的已知濃度相關聯的標準劑 量響應曲線比較，來檢測被分析物的存在或計算被分析物的濃度。20.用于檢測或量化被分析物的測定法，其包括W下步驟： (a)提供被分析物與根據權利要求1的親水、高量子產率和快速發光的叮晚醋的綴合 物； 化）提供固定有被分析物的特異性結合分子的固體載體； (C)混合所述綴合物、固體載體和懷疑含有所述被分析物的樣品W形成結合復合物； (d) 分離捕獲在所述固體載體上的結合復合物； (e) 通過添加化學發光觸發劑觸發來自步驟（d)的結合復合物的化學發光； (f) 用光度計測量光量；和 (g) 通過將反應混合物的發光量與將發光量與被分析物的已知濃度相關聯的標準劑 量響應曲線比較，來檢測被分析物的存在或計算被分析物的濃度。
【專利摘要】本發明公開了具有提高的光輸出、改進的穩定性、快速發光和降低的非特異性結合的親水的高量子產率化學發光吖啶鎓化合物。該化學發光吖啶酯在吖啶鎓核的C2和/或C7位置上具有親水的支鏈給電子官能團。
【IPC分類】G01N33/58, C09K11/07, C07D219/04, G01N21/76
【公開號】CN105378029
【申請號】CN201480039328
【發明人】A.納特拉簡, D.夏普, 姜慶平, 溫大偉
【申請人】西門子醫療保健診斷公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年7月4日
【公告號】EP3019575A1, WO2015006174A1