Taci-免疫球蛋白融合蛋白制劑的制作方法
【專利說明】TACI-免疫球蛋白融合蛋白制劑
[0001] 本申請是國際申請PCT/EP2008/065395,國際申請日2008年11月12日，中國國家 階段申請號200880115935. 7的發明專利申請的分案申請。 發明領域
[0002] 本發明屬于治療蛋白質制劑領域。更具體說，本發明涉及pH范圍為4. 5 - 5. 5的 TACI-免疫球蛋白（Ig)融合蛋白制劑。
[0003] 發明背景
[0004] BUS配體/夸體家族
[0005] 業已鑒定到對于BlyS(B淋巴細胞刺激劑）和APRIL(-種誘導增殖的配體）兩 種生長因子具有獨特結合親和力的三種受體：TACI(跨膜激活劑和CAML-相互作用子）、 BCMA(B細胞成熟抗原）和BAFF_R(B細胞活化因子受體）（Marsters等?，2000;Thompson 等?2001)〇
[0006]TACI和BCMA能結合BLyS與APRIL二者，而BAFF-R看來只能高親和力結合 BLyS(Marsters等?，2000 ;Thompson等? 2001)。因此，BLyS能通過所有這三種受體傳導信 號，而APRIL看來只能通過TACI和BCMA傳導信號。此外，在全身免疫性風濕病患者的血 清樣品中已鑒定到循環性BLyS與APRIL的異質三聚體復合物（由三個蛋白亞基組成，含 有BLyS和APRIL亞基的一個或二個拷貝），并證明其在體外能誘導B細胞增殖（Roschke 等，2002)。
[0007]BLyS和APRIL是B細胞成熟、增殖和存活的強效刺激劑（Moore等，1999; Schneider等，1999 ;Do等，2000)。BLyS和APRIL是自身免疫性疾病（特別是涉及B細 胞的自身免疫性疾病）持續存在所必需的。經工程改造能高水平表達BLyS的轉基因 小鼠顯示可患免疫細胞疾病，其癥狀類似于全身性紅斑狼瘡患者所見（Gross等，2000; Mackay等，1999)。類似地，檢測到全身性紅斑狼瘡病人和其它各種自身免疫性疾病如 類風濕關節炎病人血清樣品中BLyS/APRIL水平升高（Roschke，2002 ;Cheema等，2001; Groom等，2002)，從而使BLyS和/或APRIL與B細胞介導疾病的關聯從動物模型擴展到人 類。MS病人外周血單核細胞和T細胞的BLyS和APRIL表達上調（Thangarajh等，2004; Thangarajh等，2005)。在MS病損中發現位于靠近表達BAFF-R免疫細胞的星形細胞中BLyS 表達強烈上調（Krumbholz等，2005)。
[0008] Atacicept
[0009]Atacic印t(INN)是一種重組融合蛋白，含有受體TACI(跨膜激活劑和鈣調節 劑及親環素-配體（CAML)-相互作用子）的胞外配體結合部分及修飾的人IgGFc部 分。Atacicept的功能是詰抗腫瘤壞死因子（TNF)超家族二成員BLyS(B細胞刺激劑）和 APRIL(增殖誘導配體）。已證明BLyS和APRIL是B細胞成熟、發揮功能和存活的重要調節 劑。
[0010]Atacic印t是一種包含人IgGfFc與BLyS受體TACI胞外結構域一部分融合而成 的313個氨基酸的可溶性糖蛋白，其預計分子量為35. 4kDa。該產品的構象為二聚體，預計 分子量為73. 4kDa。可用重組技術在中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中產生Atacic印t。
[0011] Atacicept中的人IgGfFc經修飾削弱了其Fc與補體Clq組分結合和與抗體受體 相互作用的能力（Tao等，1993;Canfield等，1991)。經檢測證實Atacicept的這些Fc效 應器功能減弱。
[0012] 治療蛋白制劑
[0013] TACI-Ig融合蛋白如atacic印t是生物制劑，即治療人類疾病的治療蛋白，因此可 對人類給藥。
[0014] 開發這種制劑目的是提供治療蛋白的有效遞送。治療用蛋白常常遇到的問題是， 例如蛋白質的穩定性差（常需要冷藏或冷凍保存），生物利用度差和病人對腸胃道外途徑 劑型不友好。
[0015] 在生物技術產品的加工中，通常需要獲得高純度的治療蛋白水溶液。當配制這些 蛋白溶液（如供非腸胃道遞送）時，使蛋白質穩定至關重要。因此，必須選擇能穩定蛋白質 的賦形劑。高純度蛋白質溶液的穩定性也可能受緩沖液的影響。緩沖液通過其離子強度和 pH共同影響蛋白質在溶液中的穩定性。已用于此目的的緩沖液例子有磷酸鹽、檸檬酸鹽、馬 來酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液。
[0016] 即使在開始儲存時治療蛋白是溶液，所遇到的問題是維持蛋白質溶液穩定防止其 在儲存時凝聚形成顆粒或沉淀，和防止其降解（如水解、氧化、脫酰胺、被截短或變性）。
[0017] 溫度也可影響溶解性，通常隨著溫度升高溶解性也升高。然而高于某溫度域值時 蛋白質會部分去折疊導致溶解性降低或凝聚/沉淀。
[0018] 為防止凝聚和降解，為獲得長期穩定的藥物，需要開發含有一種或多種賦形劑的 穩定的治療性蛋白質制劑。
[0019] 本發明針對這種需要，提供了可用于治療人類疾病的治療蛋白，即穩定的、藥學上 可接受的TACI-免疫球蛋白融合蛋白制劑。
[0020] 發明概述
[0021] 本發明依據的基礎是開發了穩定的TACI-免疫球蛋白融合蛋白制劑。
[0022] 第一方面，本發明的制劑包括：
[0023] a)TACI-免疫球蛋白（TACI-Ig)融合蛋白，其包含：
[0024] i.TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和/或APML的片段或變體；和
[0025]ii.免疫球蛋白的恒定區；和
[0026] b)使制劑的pH范圍維持在4. 5-5. 5之間的緩沖液。
[0027] 第二方面，本發明涉及包含這種制劑的藥物組合物。
[0028] 第三方面，本發明涉及用于治療或預防自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病的本發 明的制劑或藥物組合物。
[0029] 第四方面，本發明涉及制備本發明制劑的方法，該方法包括制備TACI-Ig融合蛋 白的液體溶液，并調節該液體溶液的pH至4. 5-5. 5范圍的步驟。
[0030] 本發明的第五方面涉及制備本發明制劑的方法，該方法包括在滅菌容器中充裝預 定量所述制劑的步驟。
[0031] 發明詳述
[0032] 本發明依據的基礎是開發了穩定的TACI-免疫球蛋白融合蛋白制劑，此制劑中的 TACI-Ig融合蛋白可長期穩定（例如3個月以上、6個月以上、12個月以上、15個月以上或 18個月以上）。
[0033] 按照本發明，所述制劑包括：
[0034] a)TACI-免疫球蛋白（TACI-Ig)融合蛋白，其包含：
[0035] i.TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和/或APRIL的片段或變體；和
[0036] ii.免疫球蛋白的恒定區；
[0037] b)使制劑的pH范圍維持在4. 5-5. 5之間的緩沖液。
[0038]在本發明制劑的一個實施方式中，所述制劑的pH范圍為4. 7-5. 3，更優選 4. 9-5. 1〇
[0039]所述制劑的pH因此可以是 4. 5、4. 6、4. 7、4. 8、4. 9、5. 0、5. 1、5. 2、5. 3、5. 4 或 5. 5。 在一優選實施方式中，所述制劑的pH是5. 5。
[0040] 本發明制劑所用的緩沖液可以是，例如，磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或組 氨酸緩沖液。所述緩沖液的濃度范圍可以是l_59mM，優選5-25mM。例如，本發明制劑中包 含的緩沖液濃度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或 50mM〇
[0041] 在本發明制劑的一個優選實施方式中，所述緩沖液是乙酸鹽緩沖液。優選是乙酸 鈉（NaAc)緩沖液。在本發明的一個實施方式中，所述緩沖液是5-25mM，優選8-12mM，更優 選約10mM的NaAc緩沖液。
[0042] 在一個實施方式中，本發明制劑包含賦形劑。合適的賦形劑是，例如甘露醇、山梨 醇、甘油或海藻糖。所述制劑中甘露醇或山梨醇的濃度范圍可以是（例如）30-80，或40-60， 或約50或51mg/ml。所述制劑中甘油的濃度范圍可以是（例如）10-30,或優選15-25,或 20 或 21mg/ml。
[0043] 海藻糖是一種二糖，由兩個葡萄糖分子通過a，a-1，1鍵連接組成。本發明制劑 中的海藻糖，如無水海藻糖，其濃度范圍可以是（例如）50 - 120mg/ml，或優選60 - 100mg/ ml。例如，本發明制劑可包含70、75、80、85、90、95、100、105或110mg/ml的海藻糖。在一個 優選實施方式中，所述制劑包含約80mg/ml的無水海藻糖。
[0044] 雖然本發明的制劑可包含賦形劑或鹽，如NaCl、CaCl2、MgCl2，但在本
【發明內容】
說明 中該制劑優選無鹽的。
[0045] 本發明制劑還可包含表面活性劑，如吐溫20,或優選波洛薩姆 (Poloxamer) 188(Lutm產或Plur〇nic'KF68)。在本發明一個實施方式中，所述制劑無表面 活性劑。
[0046] 在一個實施方式中，本發明的制劑還包含防腐劑，優選采用苯甲醇與苯扎氯銨 (潔而滅）的組合作為防腐劑。例如，所述制劑可含有〇. 15-0. 5%的苯甲醇，如0. 2%、0. 3% 或0.4%的苯甲醇，和 0.0007%-0.0015%的苯扎氯銨，如 0.0008%、0.0009%、0.001%、 0. 0011 %或0. 0012%的苯扎氯銨。在一個高度優選的實施方式中，所述制劑含0. 3 %苯甲 醇聯合0.001 %的苯扎氯銨。
[0047] 本發明的制劑包含TACI-免疫球蛋白（TACI-Ig)融合蛋白作為治療活性化合物， 即作為活性成分。所述TACI-Ig融合蛋白包含（a)TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和 /或APRIL的變體或片段；和（b)免疫球蛋白的恒定區。本領域技術人員知道按照本發明 制成的TACI-Ig融合蛋白不是抗-TACI抗體。任何抗-TACI抗體不會包含TACI的胞外結 構域或其能結合BLyS和/或APRIL的變體或片段，而是針對TACI胞外結構域中的表位。
[0048] 在本發明的框架中，術語"TACI胞外結構域"也指與TACI胞外結構域（SEQID NO: 1)具有至少80%或85%，優選至少90%或95%或99%相同性的任何變體。術語"TACI 胞外結構域"還包括含有不多于50或40或30或20或10或5或3或2或1個保守性氨基 酸替代的變體。任何這種變體能結合BlyS和/或APRIL，和/或任何BlyS-APRIL異質三聚 體。優選這類變體也能抑制BlyS和/或APRIL和/或任何BlyS/APRIL異質三聚體的生物 學活性。所述BlyS或APRIL的生物學活性是，例如，B細胞增殖。
[0049] 本發明中，也可采用TACI胞外結構域的片段（活性片段）和變體，只要這些片段 能結合BlyS和/或APRIL，和/或BlyS-APRIL異質三聚體。優選這類片段也能抑制或減弱 BlyS和/或APRIL和/或BlyS/APRIL異質三聚體的生物學活性。
[0050] 可按例如以下實施例2所述，來評估任何TACI胞外結構域、TACI-Ig融合蛋白、或 其任何變體或片段結合BlyS和/或APRIL和/或BlyS/APRIL異質三聚體的能力。可按例 如以下實施例3所述，來評估它們抑制或減弱BlyS、APRIL和/或BlyS/APRIL異質三聚體 生物學活性的能力。
[0051] 在本發明中，TACI胞外結構域的任何這種片段或變體，或TACI-Ig融合蛋白，優選 不具有明顯低于atacicept(即具有SEQIDN0:3氨基酸序列的蛋白質）活性的任何生物 學活性。
[0052] 本文所用的術語"免疫球蛋白（Ig)_恒定區"也稱為"Fc區"，它衍生自人或動物 的免疫球蛋白（Ig)，優選IgG。IgG可以是IGgl、IgG2、IgG3或IgG4。Fc區優選包括IgGl 的至少CH2、CH3區，較佳為還包括絞鏈區。
[0053] 優選Ig的恒定區是人IgGl區。
[0054] 在一個實施方式中，人IgGl恒定區經修飾降低了其補體依賴的細胞毒性（CDC)和 /或抗體依賴的細胞毒性（ADCC)。
[0055] 在ADCC中，抗體的Fc區結合于免疫效應細胞如自然殺傷細胞和巨噬細胞表面的 Fc受體（FcyR)，導致靶細胞被吞噬或溶解。在CDC中，抗體通過在細胞表面觸發補體級聯 反應而殺死靶細胞。根據位于絞鏈區和CH2結構域上的殘基，IgG可結合活化受體（FcyRI、 卩(^1?113、？〇丫1?1113和？〇丫1?11113)和抑制受體$〇丫1?1113)?〇丫1?，或補體第1組分（(：19)。 在IgG2和IgG4中，CH2結構域中的兩區域對FcYR和補體Clq結合至關重要，且具有獨特 序列。例如，將IgG2位置233-236的殘基取代為人IgGl(的殘基）大大降低了其ADCC和 CDC活性（Armour等，1999 和Shields等，2001)。按照EU索引位置（Kabat等，1991)，可在 IgGl的Fc區中引入如下Fc突變：
[0056]T250Q/M428L
[0057]M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F
[0058]E233P/L234V/L235A/AG236+A327G/A330S/P331S
[0059]E333A；K322A
[0060] 其它Fc突變可以是，例如在選自330、331、234或235位或其結合的EU索引位置 上的取代。本發明中，也可在Fc區中引入位于CH2結構域上的EU索引位置297的氨基酸 取代，以消除N-連接糖附著的潛在位點。也可用絲氨酸殘基取代EU索引位置220的半胱 氨酸殘基，以去除通常與免疫球蛋白輕鏈恒定區