作參比溶液。
[0241]光密度（0D)
[0242] 用水稀釋制備0. 5mg/mlTACI_Fc5液，用蘭伯特-比爾公式0D=ebe(e是摩爾 消光系數；b是光杯的厚度）計算濃度（c)。e(280nm) = 1.56(mL/mg)/cm。將這些計算值 乘以稀釋倍數測得起始液的濃度。
[0243]園二色性（CD)
[0244] 構象分析
[0245] 通常采用⑶研究肽和蛋白質的構象。幾種因素可能影響⑶光譜遠紫外 (180-250nm)區和近紫外區9250-350nm)特征峰的形態，如蛋白濃度、溫度、pH和離子強度。 文獻報告在遠紫外區觀察到的總譜帶位置代表了特定類型的二級結構螺旋，片 層，隨機卷曲）。在近紫外區觀察到的⑶譜帶主要由Trp、Tyr、Phe和二硫鍵產生。
[0246] 然而，必須指出，二硫鍵的信號一般比芳族氨基酸的信號低得多。只要這些殘基位 于不對稱環境即可產生CD信號。蛋白三級結構的構象變化常導致起始環境的變化，從而引 起CD波譜改變。事實上，天然蛋白的各氨基酸占據三維結構中的獨特位置。這種結構的改 變可導致其可及度的改變。
[0247] 近紫外區⑶光譜的設置：
[0248] 掃描速度=5-20nm/分；范圍=250-350nm;反應速度=8秒；濃度=2mg/ml;光 路徑長=lem;數據間距=0? 5nm;帶寬=lnm;累積=2標準靈敏度。室溫下獲得光譜。
[0249] 遠紫外區⑶光譜的設置：
[0250] 掃描速度=5-20nm/分；范圍=200-300nm;反應速度=8秒；濃度=0? 25mg/ml; 光路徑長〇?lem;數據間距=0? 5nm;帶寬=lnm;累積=2標準靈敏度。室溫下獲得光譜。
[0251] 蛋白質去折疊溫度
[0252] 用CD以固定波長監測溫度掃描是在不同溫度下研究蛋白質二級和三級結構的有 價值的方法。這種檢測可以評價在不同制劑中蛋白質的去折疊溫度（Tunf)。雖然Tunf與蛋 白質去折疊釋放的自由能（它是蛋白質穩定性的一種指標）不直接相關，但廣為接受的是 Tunf升高應與蛋白質穩定性增加相關。因此，Tunf的變化可表明特定組合物是否有穩定或去 穩定的效果。通過監測色氨酸（Trp)信號的變化對熱變性進行了研究，該信號的變化與蛋 白質構象隨溫度變化有關。在55-70°C范圍內加熱藥品制劑（1°C/分）。可通過CD橢園相 對極小值292. 5nm的變化檢測溫度對三級結構的影響。采用第4級多項擬合法計算出解鏈 溫度值。
[0253] ⑶溫度掃描的設置
[0254] 溫度范圍=55-70°C;升溫速度=1°C/分；A= 292. 5nm;濃度=2mg/ml;反應速 度=8秒；數據間距=0. 2-8°C;帶寬=lnm;標準靈敏度；攪拌速度=低速。
[0255] 動態光散射法（DLS)
[0256] 動態光散射法是檢測顆粒布朗運動產生的與顆粒大小有關的光散射。此法需要將 顆粒置于激光束下，分析散射光中的強度波動。更精確地說，顆粒布朗運動的速度與顆粒大 小相關（史托克-愛因斯坦等式）。用數字相關器檢測在一段時間內兩種信號（此例為強 度信號）之間的相似程度，給出與散射光強度波動的性質和程度相關的信息，這些信息與 顆粒大小有關。測定相關函數后，可用其計算出顆粒大小分布。
[0257] 用ZetasizerNanoSeries檢測接近180°的散射光強度（反相散射檢測）。這 種設置可減少通過樣品時多重散射光的影響和大污染顆粒的影響。采用一次性小杯（內部 容量約70y1)。檢測時的溫度=25°C。平衡時間=1分鐘，運行次數=11次；運行時間= 10秒；檢測次數=2 ;分散劑為水（粘度=0. 8872cP;屈光率=1. 330)，不經稀釋。
[0258] 熒光直角光散射（RALS)
[0259] 用熒光檢測器檢測RALS，其激發光和發射光的波長設置相同。在此種配置中，熒光 檢測器成為非常靈敏的RALS檢測器。RALS升高表明樣品中有凝聚/沉淀。
[0260] 焚光
[0261] 內焚光
[0262] 蛋白質含三種芳族氨基酸殘基（色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe)，這成為其 發出內熒光的原因。折疊蛋白的熒光是各芳族殘基熒光的集合。一般用280nm波長或常用 更長的295nm光激發蛋白熒光。大多數發射光由色氨酸殘基發射產生，少數發射光由酪氨 酸和苯丙氨酸產生。色氨酸最大熒光發射的強度、量子率和波長極其依賴于溶劑。隨著色 氨酸殘基周圍溶劑極性的降低，熒光光譜轉移為較短波長，熒光強度增加。包埋在蛋白疏水 核心中的色氨酸與蛋白表面的色氨酸相比，其光譜可能漂移10_20nm。此外，色氨酸熒光可 被鄰近的質子化酸性基團如Asp或Glu淬滅。因此，可利用熒光作為強效監測工具，反映芳 族殘基所處微環境的變化。
[0263]MicroMax384是一種微孔板讀數儀，能裝下多達384孔的平板并連接FluoroMax焚 光分光光度計。單色光鏡的激發光和發射光通過光纖束進出MicroMax384,因此，用戶可用 該主熒光光度計掃描并選擇強度測量用的激發光和發射光波長對。MicroMax的所有控制均 為通過DataMax軟件的自動控制，通過此軟件也可自定義選擇板中微孔。
[0264] 用MiCr〇Max384平板讀數儀進行高通量熒光掃描，采用以下設置：激發光和發射 光間隔=5nm;Aexc= 280nm;發射光范圍=300_450nm;積分時間=0. 1秒；不稀釋。用 Fluromax3軟件自動計算最大發射光波長。
[0265] RALS
[0266] 用FluoroMax焚光分光光度計在500_800nm之間同步掃描（Aexc=Aem)進行 RALS檢測。在這些條件（無樣品吸收和不受光源影響）下顯示的強度主要為溶液中存在的 (光/蛋白質）散射現象所致。散射總強度隨著蛋白粒度增加而增加，因此，可用此技術監 測凝聚、亞單位分離、降解等等。
[0267] 散射強度也依賴于蛋白濃度與屈光系數，因此，應在相同的蛋白濃度下進行檢測 比較。
[0268] 進行RALS檢測設置的參數如下：同步掃描，波長范圍=500-800nm，間距=15nm， 積分時間=〇. 5秒，偏移=Onm，樣品濃度=35mg/ml(用milliQ水作為稀釋劑）。
[0269] 熒光發射光的各向異性
[0270] 大分子的旋轉取決于其大小、形狀和局部環境（即溶劑）。通常采用偏振發射測量 來檢測分子大小的微小變化（凝聚、結合、切斷）及環境變化（局部粘度，相轉變等）。這 些檢測的第一步是激發所選擇的熒光基團（光選擇）。通常用垂直偏振光以垂直方向激發 能吸收偶極子的分子群。在此時相中，用激發途徑中的偏振器產生垂直的偏振激發光。一 旦受到激發，分子可在激發狀態壽命期（約10 9秒）內旋轉。這種旋轉將使熒光發射消偏 振。測定偏振發射光的組成可以出計算分子旋轉的類型與程度。用發射途徑中的偏振器檢 測焚光發射的偏振組成部分。從垂直（V)和水平（H)發射光組成部分的大小，可計算出旋 轉的程度和類型。Anisotropy(A)是一種比例，定義為線性偏振組成部分的強度除以光的總 強度：
[0271]A= (Ivv_G*Ivh)/(Ivv+2G*Ivh)
[0272] 此式中，G是校正因子，G=IHV/IHH
[0273] 在這些方程式中，強度I的第一個下標表不激發光偏振器的位置（H或V)，第二個 為發射光偏振器的位置（H或V)。當激發光波長設為A= 295nm時，熒光的各向異性給出 了與色氨酸殘基移動和它們所處局部粘度的有關信息。因此，熒光各向異性的增加可反映 蛋白質的這些殘基處于更剛性的環境。
[0274] 檢測各向異性所設置的參數如下：入exc= 295nm，發射光范圍=500-800nm，積分 時間=0? 5秒，間距=15nm，樣品濃度=35mg/ml(用milliQ水作為稀釋液）。
[0275] 生物學試驗
[0276]TACI-Fc體外生物學試驗基于Jurkat(人急性T細胞淋巴瘤）轉染的細胞（Jurkat PKZ142)。用二種質粒轉染此細胞系，第一種編碼在CMV啟動子控制下的全長TACIcDNA， 第二種含NF-kB/AP-1驅動的熒光素酶報告基因。該方法基于zTNF4結合細胞表面TACI受 體、觸發信號轉導級聯反應、導致轉染的NF-kB/AP-1熒光素酶報告基因激活的能力。可溶 性TACI-Fc的存在抑制了zTNF4與TACI受體的結合，從而降低熒光素酶的表達。
[0277] 將JurkatpKZ142細胞與TACI-Fc標準品一起培育，建立27. 86-1. 63U/ml全劑量 反應曲線，以及與兩種濃度（即4和6U/ml)的受試樣品一起培育，這兩種濃度位于標準曲 線的線性部分。
[0278] 然后將zTNF4溶液以能誘導次級最大熒光素酶產生的濃度（即每孔150ng/ml)加 入標準品和樣品中；以最少和最多熒光素酶產生為對照。37°C(5%C02)培育4小時后，用 熒光素酶SteadyGlo試劑盒加入細胞，以發光光度計檢測熒光素酶的表達。
[0279] 在標準劑量反應曲線的線性部分內插兩種測試濃度的Y值（RLU)，計算出樣品效 能，獲得X軸上的TACI-Fc濃度（GraphPad軟件）。求得各次獨立試驗中兩種濃度的平均 值，然后從各次獨立試驗獲得的效能算術平均值計算出TACI-Fc5的生物學活性。
[0280] 預配制過程
[0281] 對pH、緩沖液類型和輔料對蛋白質穩定性的影響進行了評價。制備濃度70或 100mg/ml的TACI-Fc溶液，初步研究以下變量：
[0282] -pH(4、5、6、7)
[0283] _緩沖液（乙酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸）
[0284] -糖（甘露醇、山梨醇、甘油、鹿糖、海藻糖）
[0285] -輔料（氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、甘氨酸）
[0286] 除此之外，對70mg/ml的TACI-Fc5進行了以下進一步的預篩選研究：
[0287] -用pH5-6-7的20mM緩沖液（組氨酸、磷酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽）進行反復凍 融（F-T)1、3、5F-T次；
[0288] -4〇°C培育（搖動和不搖動）；
[0289] -儲存在2-8°C，pH4-5-6, 20mM緩沖液（乙酸鹽、組氨酸、磷酸鹽）中。
[0290] 根據這些第一批觀察到的結果，選擇pH5和6的兩種緩沖液（磷酸鹽和組氨酸）， 制備第二批制劑，用以研究再加入穩定劑（剩余重量克分子滲透濃度〇. 2800SM)的效果。測 試了以下穩定劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、甘氨酸、NaCl、MgCl2、CaCl2。
[0291] 將各溶液儲存于2-8°C、25°C和40°C，在14天中對凝聚物（SE-HPLC)、蛋白含量 (RP-HPLC)、pH和外觀進行檢測。
[0292] 實驗設計
[0293] 根據前期所作的選擇，進行實驗設計以評估以前所研究的不同水平的因素對蛋白 質穩定性的影響。對乙酸鹽和組氨酸緩沖液中的制劑進行檢測，同時檢測以下表面活性劑： Poloxamer188 (Lutrol?F-68)和吐溫20,及以下輔料：精氨酸、甘氨酸、賴氨酸、甘露醇和 海藻糖。將這些制劑裝在玻璃小瓶中，貯存于2-8°C、25°C和40°C，檢測凝聚物（SE-HPLC和 AUC)、pH、外觀和重量克分子滲透濃度。也采用生物物理分析方法（如園二色性、2ndUV衍 生光譜法、內熒光法）。
[0294] 候選制劑
[0295] 在預制備期結束時，檢測鑒定了某些候選制劑，含70或100mg/mlTACI-Fc、 10mM乙酸鹽緩沖液、甘露醇（51mg/ml)或無水海藻糖（80或96mg/ml)為輔料的有或無 Poloxamer188(Ultrol?F-68) (0? 05mg/ml)，pH4. 8、5. 0、5. 2 和 5. 4。
[0296] 將所有溶液通過0. 22ymDurapore濾膜過濾除菌后收集到滅菌容器中。然后將 溶液裝填到DIN2R玻璃小瓶（1ml填量）中。取制備期間的加工樣品（過濾前、后）評估蛋 白質的損失或凝聚物的增多。
[0297] 將樣品貯存在2_8°C、25°C和40°C，檢測儲存1個月（40°C)和6個月（2_8°C和 25°C)的結果。
[0298] 檢測候選制劑的凝聚物（SE-HPLC)、蛋白含量（RP-HPLC)、pH、重量克分子滲透濃 度和生物學活性。也檢測C-末端截短的程度和截短/修剪形式的比例。還采用了生物物 理方法（內熒光、動態光散射、90°光散射）。
[0299] 也評估了凍-融對2_8°C保存的候選制劑液體樣品的影響：-80°C冰凍樣品然后室 溫融化。用SE-HPLC評估凍-融前后的凝聚物含量。
[0300] 評價了模擬藥品裝船運輸搖動24小時對2-8°C保存樣品的影響，將樣品放在微孔 板搖動平臺上室溫搖動24小時后用SE-HPLC評估凝聚物水平并與起初的水平比較。
[0301] 結果
[0302] 候選制劑用10mMNaAc配制。
[0303]
[0304] 以下表A-T報告了詳細結果。
[0305] 表A:SE-HPLC測定的總凝聚物百分比％ (2-8°C)
[0306]
[0307] 所用批量原料，S128/L20a(10mM乙酸鈉緩沖液，pH= 5. 0)，總凝聚物％= 3. 9(Tre =海藻糖，Man=甘露醇）。
[0308] 表BSE-HPLC測定的總凝聚物百分比％(25°C)
[0309]
[0310] 所用批量原料，S128/L20a(10mM乙酸鈉緩沖液，pH=5. 0)，總凝聚物％ =3. 9(Tre =海藻糖，Man=甘露醇）。
[0311] 表C.SE-HPLC測定的總凝聚物百分比％(40°C)
[0312]
[0313] 所用批量原料，S128/L20a(10mM乙酸鈉緩沖