456] 用第一輪PCR凝膠純化的片段作為DNA模板，進行第二輪PCR擴增或重疊PCR 擴增反應。第二輪PCR擴增的條件如下：加入約10ngTACI片段和Fc5片段各自的模 板DNA、2. 5y1lOxPfu反應緩沖液（Stratagene)、2y1 的 2. 5mMdNTP、0. 5y1 的 20yM ZC24, 903(SEQIDNO: 15)和ZC24, 946(SEQIDNO: 18)及 0? 5y1Pfu聚合酶（2. 5 單 位，Stratagene)至終體積25y1。擴增的溫度設置為94°C1分鐘，35輪94°C15秒、55°C15 秒、72°C2分鐘，再72°C延伸2分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物，用QIAGENQIAQUICK 凝膠抽提試劑盒（Qiagen公司）按照廠商說明書從凝膠中切割并回收對應于預計大小的條 帶。
[0457] 用Invitrogen公司的ZER0BLUNTT0P0PCR克隆試劑盒按廠商推薦的方案分別分 離4種氨基末端截短的TACI-FcPCR產物。表4是這些TACI-Fc構建物的核苷酸和氨基酸 序列。
[0458] 表4.TACI-Fc變體的序列
[0459]
[0460] 驗證核苷酸序列后，用Fsel和AscI消化包含4種氨基末端截短TACI-Fc融合核 酸的各自質粒，以釋放編碼氨基酸的區段。將Fsel-AscI消化片段連接入含CMV啟動子和 SV40聚A區段的哺乳動物表達載體中。如下所述將該表達載體引入中國倉鼠卵巢細胞中。
[0461] 實施例6.用中國倉鼠卵巢細胞生產TACI-Fc蛋白
[0462] 通過電穿孔用TACI-Fc表達構建物轉染已適應懸浮生長的中國倉鼠卵巢細胞 (CH0)DG44細胞，用無動物蛋白的培養基（Urlaub等，1986)培養。CHODG44細胞由于染色 體的二氫葉酸還原酶有2個位置缺失而缺乏功能性二氫葉酸還原酶基因。在遞增濃度甲氨 喋呤的存在下培養細胞，導致該表達構建物中二氫葉酸還原酶基因和與之相連的編碼重組 蛋白基因的擴增。
[0463]在PFCH0 培養基（JRHBiosciences公司，Lenexa,KS)、4mML-谷氨酰胺（JRH Biosciences公司）和lx次黃噪呤-胸苷添加物（LifeTechnologies公司）中將CH0 DG44細胞傳代。在旋轉振蕩平臺上的Corning搖瓶中于37°C和5% 0)2條件下以120rpm 轉動培養細胞。分別用線性化的表達質粒轉染細胞。為確保無菌，在冰上的Eppendorf小 管中將200yg質粒DNA與20yL剪切的硅魚精子載體DNA(5' 一 3'Inc.Boulder公司， 1〇11^/1111)、221^的31恥(^。(口115.2)和 4841^的100%乙醇（6〇1(1511161(1〇161111。&1公 司，Hayward，CA)混合，進行一次乙醇沉淀步驟25分鐘。培育后，用放在4°C冷室中的微量 離心機于14,OOOrpm將小管離心，棄去上清液，用0. 5ml70%乙醇將沉淀洗滌2次，空氣干 燥。
[0464] 在DNA沉淀干燥的同時，將25ml錐形離心管中總共106個細胞于900rpm離心5分 鐘，制備CHODG44細胞。將CHODG44細胞重懸于總體積300y1的PFCH0生長培養基中， 放入有0. 4cm電極間隙的基因-脈沖小杯（Bio-Rad)中。干燥約50分鐘時間后，將DNA重 懸浮于500y1的PFCH0生長培養基，加入小杯的細胞中，使總體積不超過800y1，置于室溫 下5分鐘以減少氣泡形成。將小杯置于BioRad基因脈沖器II單元中立即電穿孔，電穿孔 的設置為〇? 296kV(千伏）和0? 950HC(高電容）。
[0465] 將細胞室溫培育5分鐘，然后置于CoStarT-75培養瓶總體積20ml的PFCH0培養 基中。將培養瓶置于37°C和5%C02培養48小時，用臺盼蘭排除法染色以血球計對細胞計 數后，將細胞放入無次黃嘌呤-胸苷添加物而含200mM甲氨喋呤（CalBiochem公司）的 PFCHO選擇培養基中。
[0466] 甲氨噪呤選擇處理回收后，用Western印染分析檢查含所分泌的TACI-Fc蛋白的 條件培養基。
[0467] 參考文獻
[0468] AltschulSF等，JMolBiol, 215, 403-410, 1990。
[0469]AltschulSF等，NucleicAcidsRes.，25:389-3402, 1997。
[0470] ArmourKL等，1999. "缺乏Fcy受體1結合和單核細胞觸發活性的重組人IgG分 子"EurJImmunol. 29 (8): 2613-24。
[0471] CanfieldSM,MorrisonSL?"人IgG與其高親和Fc受體的結合親和力由CH2區 中多個氨基酸決定并受絞鏈區的調節".JExpMed1991 ;173:1483-1491.
[0472] Cheema等，ArthritisRheum2001 ;44 (6) : 1313-1319。
[0473] DevereuxJ等，NucleicAcidsRes, 12, 387-395, 1984。
[0474] DoRKG，HatadaE，LeeH，TourignyMR,HilbertD，Chen-KiangS. "基于B細胞 刺激劑對體液免疫應答的增強而使細胞凋亡減弱".JExpMed2000; 192 (7): 953-964。
[0475] Duncan等，Nature332:563 (I988) 〇
[0476] Grantham等，Science,Vol. 185,pp. 862-864 (1974) 〇
[0477] Groom等，JClinInvest2002 ; 109 (1) : 59-68;MarietteX，AnnRheumDis 2003 ;62 (2):168-171。
[0478] Gross等，Nature2000 ;404:995_999〇
[0479] Horton等，Gene77:61 (1989) 〇
[0480] KabatEA，GlusmanM，KnaubV. "用免疫化學方法定量檢測正常和病理腦脊液中 的白蛋白和T球蛋白"?AmJMed1948;4:653-662。
[0481] Kabat,E.A.，Wu，T.T.，Perry,H.M.，Gottesman，K.S.，andFoeller，C. (1991)，"免 疫學感興趣蛋白質的序列".第5版，國立衛生研究院，Bethesda，MD。
[0482] KalledSL."BAFF在免疫功能中的作用和與自身免疫的關聯'ImmunolRev 2005 ;204:43-54。
[0483] Mackay等，JExpMe1999 ;190(11) ;1697_1710。
[0484] MarstersSA,YanM,PittiRM,HaasPE,DixitVM,AshkenaziA."TNF同源物BLyS 和APRIL與TNF受體同源物BCMA和TACI的相互作用CurrBiol2000 ; 10(13) : 785-788。
[0485] Moore等，Science1999 ;285 (5425) : 260-263;Schneider等，JExpMed1999 ; 189(11):1747-1756。
[0486] Do等，JExpMed2000 ; 192(7) :953-964。
[0487] Pearson,MethodsEnzymol. 1990 ； 183:63-98.
[0488] RoschkeV，SosnovtsevaS，WardCD,HongJS，SmithR，AlbertV等，"BLyS和 APRIL形成的生物學活性異質三聚體在全身性免疫風濕疾病患者中的表達JImmunol 2002 ; 169:4314-4321。
[0489] Rudick等，Neurology2001 ;56:1324-1330。
[0490] SchneiderP,MackayF,SteinerV,HofmannK,BodmerJ-L,HollerN.u一種腫 瘤壞死因子家族的新配體BAFF能刺激B細胞生長".JExpMed1999 ;189(11): 1747-1756。
[0491] ShieldsRL.等，2001?"人IgGl的FcyRI、Fc丫RII、Fc丫RIII和FcRn結 合位點的高分辨圖譜和具有改進的FeyR結合能力的IgGl變體的設計".JBiol Chem. 276(9) : 6591-604.
[0492] SoderstromM，LinkH，XuZ，FredrikssonS. "視神經和多發性硬化癥：抗-MBP 和抗-MBP肽抗體分泌細胞在CSF中的累積".Neurology1993 ;43:1215-1222。
[0493] Sondermann等，Nature406:267(2000) 〇
[0494] TaoM-H，SmithRIF，MorrisonSL. "人免疫球蛋白IgG的結構特征決定了補體激 活的同種型差異".JExpMed1993;178:661-667。
[0495] ThangarajhM，GomesA，MastermanT，HillertJ，HjelmstromP. "多發性硬化癥 中TNF家族B細胞活化因子（BAFF)及其受體的表達"JNeuroimmunol2004;152:183-190。
[0496] ThompsonJS，BixlerSA，QianF，VoraK，ScottML，CacheroTG.BAFF-R，"一種 新鑒定的能與BAFF特異性相互作用的TNF受體"Science2001 ;293:2108-2111。
[0497] Urlaub等，Som.Cell.Molec.Genet. 12:555(1986) 〇
[0498] Wines等，J.Immunol. 164:5313 (2000) 〇
【主權項】
I. 一種制劑，包含： a) TACI-免疫球蛋白（TACI-Ig)融合蛋白，其包含： 1. TACI的胞外結構域或其能結合BLyS和/或APRIL的片段或變體；和 ii.免疫球蛋白的恒定區； b) 使制劑的pH范圍維持在4. 9-5. 1之間的乙酸鹽緩沖液；和 c) 濃度為60-100mg/ml的海藻糖。
2. 如權利要求1所述的制劑，所述乙酸鹽緩沖液是乙酸鈉。
3. 如權利要求2所述的制劑，乙酸鈉的濃度是5-25mM。
4. 如權利要求3所述的制劑，所示制劑的pH范圍為pH5. 0。
5. 如權利要求4所述的制劑，乙酸鈉的濃度是10mM。
6. 如權利要求5所述的制劑，其中所述TACI-Ig融合蛋白的濃度在20-180mg/ml之間， 所述海藻糖的濃度在80-100mg/m之間，所述緩沖液是IOmM乙酸鈉緩沖液。
7. 如權利要求6所述的制劑，所述制劑包含80mg/m海藻糖。
8. 如以上權利要求中任何一項所述的制劑，該制劑還包含防腐劑。
9. 如權利要求8所述的制劑，其中所述防腐劑是苯甲醇聯合苯扎氯銨。
10. 如以上權利要求中任何一項所述的制劑，其中所述TACI-Ig片段包含SEQIDNO: 1 的氨基酸殘基34-66和/或氨基酸殘基71-104。 II. 如權利要求10所述的制劑，其中所述片段包含SEQIDNO: 1的氨基酸殘基30-110， 或與其至少90%相同或少于10個保守性氨基酸替代的變體，所述變體能結合BlyS和/或 APRIL。
12. 如以上權利要求中任何一項所述的制劑，其中所述免疫球蛋白恒定區來自人IgGl 的恒定區。
13. 如權利要求12所述的制劑，其中所述人IgGl恒定區包含SEQIDNO: 2序列或其少 于20個保守性氨基酸替代的變體。
14. 如以上任何一項權利要求所述的制劑，該制劑包含SEQIDN0:3序列，或與其至少 90%相同或少于30個保守性氨基酸替代的變體，所述變體能結合BlyS和/或APRIL。
15. 如以上任何一項權利要求所述的制劑，該制劑包含的所述TACI-Ig融合蛋白濃度 為 70、75、100、125 或 150mg/ml。
16. 如以上任何一項權利要求所述的制劑，其中所述制劑是液體劑型。
17. 如以上任何一項權利要求所述的制劑，其中所述制劑是多劑量給藥用制劑。
18. -種藥物組合物，包含以上權利要求任何一項所述制劑。
19. 如權利要求1-17中任何一項所述的制劑或權利要求18所述的藥物組合物，所述制 劑或藥物組合物用于治療自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病。
20. -種制備權利要求1-19任何一項中所述制劑的方法，該方法包括：制備TACI-Ig 融合蛋白液體溶液，調節所述液體溶液的pH至4. 9-5. 1。
21. -種制備權利要求19中所述制劑的方法，所述方法包括將預定量的所述制劑放置 在滅菌容器中的步驟。
22. 如權利要求21所述的方法，其中所述容器選自玻璃小瓶或預裝填的針筒。
【專利摘要】本發明涉及TACI-免疫球蛋白融合蛋白制劑。
【IPC分類】A61K9/08, A61K47/26, A61P37/02, A61K39/395, A61P7/00, A61K47/12
【公開號】CN105168123
【申請號】
【發明人】里奧 A·德爾, G·里納爾迪, J·里查德
【申請人】阿雷斯貿易股份有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2008年11月12日