液，pH= 5. 0)，總凝聚物％= 3. 9(Tre =海藻糖，Man=甘露醇）。
[0314] 表D.AUC測定的二聚物百分比％(2-8°C)
[0315]
[0316] 表E.AUC測定獲得的大凝聚物百分比％(2_8°C)
[0317]
[0318] 表F.AUC測定獲得的二聚物百分比％ (25°C)
[0319]
[0320] 表G.AUC測定獲得的大凝聚物百分比％ (25°C)
[0321]
[0322] 表H.AUC測定獲得的二凝聚物百分比％ (40°C)
[0323]
[0324] 表I.AUC測定獲得的大凝聚物百分比％ (40°C)
[0325]
[0326] 表J.SE-HPLC測定獲得的蛋白含量（2_8°C)
[0327]
[0328] 表K.SE-HPLC測定獲得的蛋白含量（25°C)
[0329]
[0330] 表L.SE-HPLC測定獲得的蛋白含量（40°C)
[0331]
[0332] 表M.pH值（2_8°C)
[0333]
[0334] 表N.pH值（25°C)
[0335]
[0336] 表O.pH值（40°C)
[0337]
[0338] 表P.重量克分子滲透濃度（OSM/kg)
[0339]
[0340] 表Q?生物學試驗（U/ml) (2-8。(：）
[0341]
[0342] 表R?生物學試驗（U/ml) (25°C)
[0343]
[0344] 表S.C_末端截短
[0345]
[0346] 表T?修剪形式
[0347]
[0348] 主要結果總結
[0349] 分子大小排阻色譜法
[0350] 在25 °C，70mg/ml制劑就凝聚率而言，其斜率（％凝聚/月）通常比100mg/ml組 低。在后一組中，制劑21D和21E顯示的斜率最低。40°C時，在100mg/ml液體制劑組中，制 劑21E顯示的斜率值最低。
[0351] AUC
[0352]在2-8°C和25°C，未觀察到制劑21E的AUC狀態有所改變，而70mg/ml制劑檢測到 在整個穩定期間（研究）中單體傾向增多。
[0353] 用⑶監測的去折疊
[0354] 在100mg/ml制劑組中，制劑21E顯示最高的Tunf，pH值不同于導致較低Tunf的 5. 0。70mg/ml制劑則顯示較高的Tuni/(1 (即穩定性較好）。
[0355] 內熒光
[0356] 在40°C，檢測到70mg/ml各制劑及100mg/ml組備選制劑21E的最大發射光波長有 微小變化。
[0357] RALS
[0358] 40°C貯存后，pH不同于"最適pH" 5.0的制劑其RALS有顯著增高。含甘露醇制劑 的散射光值高于其它制劑。制劑21A、21B、21D和21E是顯示較低散射光值的制劑。2-8°C 貯存后，它們都不顯示任何散射光的增加。
[0359] 熒光發射光的各向異性
[0360] 制劑21A和21B于40°C貯存（1個月）后，未觀察到各向異性的變化。制劑21F和 21H有相關改變，其它制劑觀察到處于二者之間的變化。
[0361] 動態光散射
[0362] 在2_8°C未檢測到大小分布有相關改變。25°C貯存后觀察到較大顆粒有所減少。 40°C貯存后，除了含甘露醇的制劑和pH不同于5. 0的制劑外，所有制劑中分子量較高物質 無顯著增加。
[0363] 去折疊的自由能
[0364] 100mg/ml制劑組中，制劑21D和21E觀察到較高的熱動力學穩定性。
[0365] 生物學試驗
[0366] 25 °C和40 °C貯存3個月未見生物學活性降低。
[0367] 總體結論
[0368] 對液體制劑的預篩選研究表明，使70mg/mlTACI-Fc5溶液穩定的最佳pH為約 5. 0。pH值越高，出現凝聚現象（用SE-HPLC評價）和濃度下降（用RP-HPLC和光密度估 計）越強烈。鹽的存在（如NaCl、CaCljPMgCl2)也導致凝聚增加。如在不同緩沖液中（pH = 4.0與5.0相比較）的園二色構象研究所示，低于5的pH值不是最適pH。DSC初步研究 表明海藻糖和蔗糖對分子穩定性（即在較高去折疊溫度時）有某種正面影響。
[0369] 實驗設計階段目的在于研究溶于pH= 5. 0乙酸鹽或組氨酸緩沖液（也試驗不同 緩沖強度）的幾種輔料在存在表面活性劑如Lutrol?F-68和吐溫20時的作用。存在甘露醇 或山梨醇時低濃度的乙酸鹽緩沖液為樣品提供了較高的抗降解穩定性。在穩定蛋白質上， Lutrol?F-68看來比吐溫20更有效。
[0370] 焚光和動態光散射檢測與這些結果相一致。
[0371] 以實驗室規模制備70mg/ml和100mg/ml濃度的TACI-Fc候選樣品。用海藻糖和 甘露糖作輔料（存在乙酸鈉緩沖液，pH= 4. 8、5. 0、5. 2和5. 4)。用SE-HPLC和AUC及幾種 分光光度法監測候選制劑隨時間的變化。
[0372] 此研究結果是，蛋白濃度越低導致的凝聚也越少。證實最佳pH為5. 0。對于穩定 TACI-Fc制劑，海藻糖比甘露醇更成功。在lOOmg/mlTACI-Fc候選制劑中，制劑21E(10mM NaAc,pH= 5. 0, 80mg/ml無水海藻糖）顯示了對40°C凝聚更強的抵抗力（2-8°C檢測的凝聚 無統計學相關的增多）。更精確地說，2-8°C候選液體制劑21E在26周內純度提高1. 4%。 25 °C時其純度只降低1% (26周）。
[0373] 用RP-HPLC分析檢測了候選制劑21E(2_8°C和25°C，10個月）的全部修剪形式，與 起始原料藥（約19% )相比，修剪形式的含量無變化。發現C-末端截短物約95%，與起始 原料藥相似，此水平的截短常見于人抗體。
[0374] 也用RP-MALDI分析了液體候選制劑21E(2-8°C和25°C貯存10個月）中氧化形式 的含量，與制備此制劑的基礎原料藥相比，未見貯存期氧化形式的顯著改變（約2. 4% )。
[0375] 實施例2 :TACI_Fc與抑菌劑的相容性
[0376] 目的
[0377] 此研究的目的是評估多劑量制劑中TACI-Fc與不同抑菌劑的相容性。檢測了以下 抑菌劑：〇. 9%苯甲醇、0. 3%間甲酚、0. 5%苯酚、0. 5%三氯叔丁醇、0. 5%苯基乙醇、0. 3% 苯甲醇+0.001 %苯扎氯銨。
[0378] 主要結果
[0379] 藥品+抑菌劑：
[0380] 一有防腐劑存在的藥品與參比樣品（不加抑菌劑）相比，40°C存貯存2周后，觀察 到總凝聚物（用SEC)增多（15-70% ) ;25°C和2-8°C時觀察到降解速率可比。
[0381] -提供了最少負面影響（根據SEC和CD分析）的抑菌劑是苯甲醇+苯扎氯銨。
[0382] 液體候選制劑+抑菌劑：
[0383] -在TACI-Fc液體候選制劑（乙酸鹽、pH5. 0,海藻糖）中加入防腐劑導致的凝聚 顯著低于藥品所導致的凝聚（40°C，2周后約10-25% )。這表明海藻糖有效地防止了天然 二級結構的凝聚和損失（遠紫外CD實驗證明）。
[0384] -存在防腐劑的制劑組中，就凝聚率而言，苯甲醇+苯扎氯銨聯用提供了最佳結 果。
[0385] 結論
[0386] 評價了幾種抑菌劑對TACI-Fc藥品（原批量裝）和用pH5. 0乙酸鈉和海藻糖配 制的l〇〇mg/mlTACI-Fc制劑中蛋白質完整性的影響。
[0387] 包含任何這些抑菌劑對蛋白質的完整性均有負面影響，特別是對原批量裝藥品。 0. 3 %苯甲醇+0. 001 %苯扎氯銨聯用成為對蛋白質結構有害作用最小的。
[0388] 實施例3 :TACI_Fc液體候選制劑在預裝填針筒中的穩定性
[0389] 目的
[0390] 此研究的目的是評估在用兩種橡皮塞塞住的1mlHypak針筒（W4023/50和 W4023/50G，FluroTec公司）中充裝的100mg/mlTACI-Fc液體制劑（乙酸鈉，海藻糖， PH5. 0)的穩定性。
[0391] 主要結果
[0392] 對充裝在用涂層塞子（W4023/50GFluroTec公司）和無涂層塞子（W4023/50G)塞 住的lml玻璃針筒中TACI-FclOOmg/ml進行6個月的檢測，結果小結如下：
[0393] -二聚體和HMW:40°C(每周增加1. 6%)和25°C(每月增加0? 5%)的降解速率 是可比的。2-8°C觀察到的表現稍有不同，雖然并不明顯影響總體穩定性：兩種不同生產批 號每月增加0. 2 %和0. 1% ;
[0394]-蛋白質含量：蛋白質含量在貯存期未見減少；
[0395]-修剪形式：檢測到與小瓶中產品可比水平的剪接形式（2_8°C時與藥品相比不增 加，25°C5個月后約增加40% );
[0396]-生物效能：生物學活性保持直到3個月（2_8°C和25°C);
[0397]-pH:貯存期未見pH變化。
[0398] 結論
[0399] 充裝在lmlHypak針筒中的100mg/mlTACI-Fc液體制劑（乙酸鈉+海藻糖， PH5.0)是穩定的。此研究評價的兩種橡皮塞（W4023/50和W4023/50GFluroTec公司）是 等價的，均不影響該液體制劑的穩定性。
[0400] 實施例4 :裝在預充裝針筒中的不同強度ATACICEPT的穩定性
[0401] 評估了裝在預充裝針筒中的不同強度atacic印t的穩定性。按實施例1中報告的 方法進行。
[0402] 受試樣品的組合物如下：
[0403]
[0404] 穩定性研究的結果報告見以下表U-Z。
[0405] 表U.SE-HPLC檢測的純度％
[0406] 5°C貯存1、2、3、6、9、12和18個月后：
[0407]
[0408]
[0409]
[0410]
[0411] 25°C貯存1、2、3和6個月后：
[0412]
[0413]
[0414] 表V.SE-HPLC測定的蛋白含量（mg/ml)
[0415] 5°C貯存 1、2、3、6、9、12 和 18 個月后：
[0416]
[0417]
[0418] 25UC貯存1、2、3和6個月后
[0419]
[0420] 40°C貯存1、2和4周后
[0421]
[0422] 表W?修剪形式（％)
[0423] 5°C貯存1、2、3、6、9、12和18個月后：
[0424]
[0425]
[0426] 25°C貯存1、2、3和6個月后：
[0427]
[0428] 表X.IEC-HPLC檢測的游離Fc%
[0429] 5°C貯存1、2、3、6、9、12和18個月后：
[0430]
[0431] CN105168123A 說明書 35/42 頁
[0432] 25°C貯存1、2、3和6個月后：
[0433]
[0434] 表Y.生物學活性（U/ml)
[0435] 5°C貯存1、2、3、6、9、12和18個月后：
[0436]
[0437]
[0438] 25°C貯存1、2、3和6個月后：
[0439]
[0440] 表Z.pH測定
[0441] 5°C貯存1、2和3個月后：
[0442]
[0443]
[0444] 25°C貯存1、2、3和6個月后：
[0445]
[0446] 實施例5.BLYS拮抗劑的制備
[0447] 制備了 4種氨基酸末端截短的TACI-Fc。這4種都含有融合于SEQIDN0:6的 氨基酸殘基30的修飾的人組織纖維蛋白溶解酶原激活劑序列（如W0 02/094852(SEQID N0:25)所揭示的）。然而，這4種蛋白中的"Fc5"融合于SEQIDN0:6的TACI氨基酸序列 的位點不同。表1概括了這4種融合蛋白的結構。
[0448] 表l.TACI-Fc融合蛋白
[0449]
[0450] 采用標準技術通過重疊PCR制備了編碼蛋白的表達盒（參見，例如Horton等， 1989)。采用編碼TACI的核酸分子和編碼Fc5的核酸分子作為PCR模板。表2和3為其鑒 定的寡核苷酸引物。
[0451] 表2.用于制備TACI融合蛋白的寡核苷酸引物
[0452]
[0453] 表3.寡核苷酸的序列
[0454]
[0455] 第一輪PCR擴增包括4種氨基末端截短物各自的二次反應。分別進行這二次反應， 一次反應用5'和3'TACI寡核苷酸。另一次反應用各自的5'和3'Fc5寡核苷酸。第一輪 PCR擴增的條件如下：加入約200ng模板DNA、2. 5y1lOxPfu反應緩沖液（Stratagene)、 2y1的2. 5mMdNTP、0. 5y1的20yM各種5'寡核苷酸和3'寡核苷酸及0. 5y1Pfu聚合 酶（2. 5單位，Stratagene)至終體積25y1。擴增的溫度設置為94°C3分鐘，35輪94°C15 秒，50°C15秒，72°C2分鐘，再于72°C延伸2分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物，用 QIAGENQIAQUICK凝膠抽提試劑盒（Qiagen公司）按照廠商說明書從凝膠中切割并回收對 應于預計大小的條帶。
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