形成二硫鍵的該半胱氨酸殘基。
[0061] 已制備了適合用于本發明TACI-Ig融合蛋白的特定Fc結構域。
[0062] 具體說，為產生Fc融合蛋白，制備了 6種修飾的人IgGIFc，命名為Fc-488及Fc4、 Fc5、Fc6、Fc7 和Fc8。
[0063] 利用野生型人免疫球蛋白y1恒定區作模板，設計和構建了便于克隆含人ylFc 區融合蛋白的Fc-488(具有SEQIDN0:4的DNA序列和SEQIDN0:5的氨基酸序列）。應 注意由于用絲氨酸取代通常與免疫球蛋白輕鏈恒定區形成二硫鍵的半胱氨酸，可能導致半 胱氨酸殘基不配對而產生有害作用。在編碼EU索引位置218的密碼子中引入一種其它改 變，以引入Bglll限制性酶識別位點而有利于后面的DNA操作。通過PCR引物將這些改變 引入編碼的PCR產物中。由于已安置了Bglll位點，為了完成（引入）Fc絞鏈區，將編碼EU 索引位置216和217的密碼子摻入融合蛋白的伴侶序列中。Fc4、Fc5和Fc6包含突變，通 過減弱FcyR結合和補體Clg結合而減弱Fc介導的效應器功能。Fc4含有同樣的氨基酸取 代，它們被引入Fc-488中。引入其它氨基酸取代，以減弱潛在的Fc介導的效應器功能。具 體說，引入三個氨基酸取代以減弱FcyRI結合，這些取代是在EU索引位置234、235和237 的取代。已顯示這些位置的取代減弱了與FcyRI的結合（Duncan等，1988)。這些氨基酸取 代可能也減弱了與FcyRlla的結合以及與FcyRIII的結合（Sondermann等，2000;Wines 等，2000) 〇
[0064] 幾個研究小組報導了EU索引位置330和331的氨基酸與補體Clq結合及后續補 體的固定有關（Canfield和Morrison, 1991 ;Tao等，1993)。在Fc4的這些位置引入氨基酸 取代減弱了其補體固定功能。Fc4的CH3區與相應野生型多肽的CH3區相同，除了終止密碼 之外。當用不良的大腸桿菌菌株培養克隆的DNA時，將該終止密碼子從TGA改變成TAA以 消除潛在的有害甲基化位點。
[0065] 在Fc5中，EU索引位置218的精氨酸殘基突變回賴氨酸，因為在含這種特定Fc的 融合蛋白中沒有采用Bglll克隆方案。Fc5序列的其余部分與以上描述的Fc4相匹配。
[0066]Fc6與Fc5相同，除了羧基末端賴氨酸密碼子已消除外。成熟免疫球蛋白C-末 端的賴氨酸通常從翻譯后成熟免疫球蛋白去除然后從B細胞分泌出來，或在血清循環時去 除。結果，循環抗體通常沒有C-末端賴氨酸殘基。與以上的Fc4和Fc5相同，Fc6序列中 的終止密碼子改變成TAA。
[0067]Fc7與野生型ylFc相同，除了CH2結構域中EU索引位置297上有氨基酸取代外。 EU索引位置297天冬酰胺是N-連接的糖附著點。由于糖結構可能產生批間差異，N-連接 糖在重組表達的蛋白中引入了潛在的變異源。在一個消除這種潛在變異的嘗試中，使297 天冬酰胺突變為谷氨酰胺殘基以防止該殘基位置附著N-連接糖。殘基297處的糖也參與 Fc與FcIII的結合（Sondermann等，Nature406:267(2000))。因此，通常去除該糖應減弱 含Fc7重組融合蛋白與FcyR的結合。如上所述，將Fc7序列中的終止密碼子突變為TAA。
[0068]Fc8與SEQIDN0:4所示的野生型免疫球蛋白y1區相同，除了EU索引位置220 的半胱氨酸被絲氨酸殘基取代外。此突變消除了通常與免疫球蛋白輕鏈恒定區形成二硫鍵 的半胱氨酸殘基。
[0069] 任何這些特定Fc區在形成TACI-Ig融合蛋白的應用均落入本發明范圍。
[0070]TACI-Ig的免疫球蛋白恒定區優選包含具有SEQIDN0:2所示氨基酸序列的多肽， 或其與SEQIDN0:2所示Ig恒定區至少有80%或85%，優選至少90%或95%或99%相同 的變體；或含有少于50或40或30或20或10或5或3或2個保守性氨基酸取代的變體， 只要這不影響TACI-Ig融合蛋白的整體生物學活性，此種TACI-Ig蛋白的免疫原性不會顯 著高于atacicept(SEQIDNO:3)〇
[0071] 在本發明說明書中，術語"相同性"表示通過序列比較所確定的兩條或多條多肽序 列之間的關系。相同性通常指兩條多肽序列作全長序列比較時，它們的氨基酸與氨基酸分 別精確對應。
[0072] 對于無精確對應的序列而言，可確定其為"0%相同"。通常排列對比所比較的二條 序列，得到序列之間的最大相關性。這可包括在一條或二條序列中插入"空格"以提高對比 程度。比較每條序列的全長（所謂總體對比）可確定相同性％，這特別適合長度相同或非 常相似的序列，或比較較短、長度限定的的序列（所謂局部對比），這較適合長度不相等的 序列。
[0073] 比較兩條或多條序列相同性的方法是本領域熟知的。例如，可采用在9. 1版威斯 康新序列分析包中的這種程序（DevereuxJ等，1984)，例如BESTFIT和GAP程序，來測定 兩條多聚核苷酸之間的相同性％和兩條多肽序列之間的相同性％。BESTFIT采用Smith和 Waterman(1981)的"局部同源性"算法，尋找二條序列之間相似性的最佳單一區域。測定 序列相同性的其它程序也是本領域已知的，例如，BLAST家族程序（AltschulSF等，1990 ; AltschulSF等，1997,可通過NCBI主頁www.ncbi.nlm.nih.gov講入）和FASTA(Pearson ffR, 1990) 〇
[0074] 本發明優選的氨基酸取代是被稱作"保守性"的取代。TACI-Ig融合蛋白的TACI 胞外結構域或免疫球蛋白恒定區部分的保守性氨基酸取代，包括理化性質充分相似的 同組內的同義氨基酸（相互取代），同組內成員之間的取代將保存該分子的生物學功能 (Grantham, 1974)。已知也可在上述序列中制造插入和缺失而不會改變其功能，具體說，如 果插入或缺失只涉及少數氨基酸，如50以下、或30個以下、20個以下、或優選10個以下、或 5個以下氨基酸殘基，并且不去除或置換對功能構象至為關鍵的氨基酸，如半胱氨酸殘基。 這樣的缺失和/或插入所產生的蛋白質和變體可用于治療復發性MS，只要其生物學活性不 顯著低于atacicept(具有SEQIDN0:3所示氨基酸序列的蛋白）的生物學活性。
[0075] 已公布的國際專利申請W0 00/40716和W0 02/094852公開了TACI的胞外結構域 及TACI胞外結構域與其配體BlyS和APRIL相互作用的特異性片段。
[0076] 如W0 00/40716所公開的那樣，TACI的胞外結構域包含2個富含半胱氨酸（Cys) 的重復序列，這是TACI受體所屬腫瘤壞死因子（TNF)受體超家族成員的特征。W0 00/40716 中也制備了一種能與BlyS結合的TACI修剪變體，命名為BR42x2,它只包含第2種較不保守 的富含Cys重復序列。因此，在本發明框架內，TACI的胞外結構域片段優選至少包含對應 于該第2種富含Cys重復序列的SEQIDNO: 1的71-104氨基酸殘基或由這些殘基組成，更 優選TACI-Ig融合蛋白還包含對應于第一種富含Cys重復序列的SEQIDNO: 1的34-66氨 基酸殘基。
[0077] 在本發明另一實施方式中，所述能結合和抑制BlyS和/或APRIL活性的TACI的 胞外結構域片段自身包含SEQIDNO: 1的30-110氨基酸殘基或由這些殘基組成。
[0078] 在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQIDN0:3序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性氨基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或APRIL。
[0079] 在本發明的還有另一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQIDN0:8序 列的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30個或20 個或15個或10個或5個或3個或2個保守性氨基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和 / 或APRIL。
[0080] 在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQIDNO: 10序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性氨基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或APRIL。
[0081] 在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQIDNO: 12序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性氨基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或APRIL。
[0082] 在本發明的還有一個實施方式中，所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQIDN0:14序列 的多肽或由其組成，或與之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30個或20個 或15個或10個或5個或3個或2個保守性氨基酸取代的變體，這種變體能結合BlyS和/ 或APRIL。
[0083] 在本發明的另一個實施方式中，所述制劑包含濃度范圍20mg/ml-180mg/ml，例如 濃度為 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、 130、135、140、145、150、155、160、165、170、175mg/ml的TACI-Ig融合蛋白。
[0084] 在本發明另一實施方式中，所述制劑是液體（如水溶液）劑型。
[0085] 在本發明的還有一個實施方式中，所述制劑是多劑量給藥制劑。多劑量制劑中優 選包含防腐劑。如上所述，在一個優選的實施方式中，所述制劑包含苯甲醇（如0.3%)和 苯扎氯銨（如0.001% )。
[0086] 可每天、每隔一天，優選每周二次或每周一次給予TACI-Ig融合蛋白制劑。給予 TACI-Ig優選推注給藥，每周一次。或者，也可每隔一周或每月一次給予所述制劑。
[0087] 本發明的制劑可以是例如靜脈內、皮下或肌肉內途徑給藥。在本發明的一個實施 方式中，所述制劑是用于皮下給藥的。
[0088] 本發明的制劑用于治療疾病，優選治療人類疾病。因此，在一實施方式中，將本發 明制劑制備成藥物組合物。
[0089] 包含TACI-Ig融合蛋白的制劑或藥物組合物優選用于治療自身免疫性疾病或淋 巴增殖性疾病，或制備治療自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病的醫療用藥。
[0090] 本發明所述的自身免疫性疾病包括但不限于：全身性紅斑狼瘡（SLE)、狼瘡性腎 炎、類風濕關節炎、多發性硬皮癥或視神經炎。
[0091] 淋巴增殖性疾病是一種淋巴系統細胞過度增殖的疾病。B細胞惡變是例如淋巴增 殖性疾病。B細胞惡變疾病包括但不限于：白血病和淋巴瘤，例如，急性白血病、急性淋巴細 胞性白血病、急性髓細胞性白血病、髓母細胞白血病、前髓細胞性白血病、粒-單核細胞白 血病、單核細胞紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞（粒細胞）白血病、慢性淋巴細胞性白血 病、真性紅細胞增多癥、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多發性骨髓瘤和瓦爾登斯特倫巨球蛋 白血癥。
[0092] 本發明也涉及生產或制備本發明制劑的方法，包括制備（例如混合）組分（a)-(c) 的步驟，優選在液體溶液（如水溶液）中。
[0093] 本發明還涉及生產或制備本發明制劑的方法，包括在滅菌容器中放置預定量的所 述制劑。預定量可以是例如〇. 5-5ml，優選l-2ml。
[0094] 在本發明的一個實施方式中，所述容器選自玻璃小瓶或預裝填針筒。玻璃小瓶例 如可用無涂層瓶塞或涂層瓶塞密封。瓶塞可以是例如橡皮塞或溴丁基橡膠塞。針筒，如預 裝填針筒可以用橡皮內芯或用涂層內芯塞住。涂層可以是例如無油硅酮涂層。
[0095] 預裝填針筒可以有不同容量，如0.5、1、1. 5或2ml。優選lml針筒。針筒的裝填 容量優選1或1.2ml。預裝填針筒可用塑料制成，或優選為玻璃針筒。合適的玻璃針筒為 例如BectonDickinson制造的lmL玻璃針筒27G1/2RNGW7974/50G。預裝填針筒優選用 涂層塞子（如FluroTec公司制造的W4023/50G)和無涂層塞子（如WestPharmaceutical 公司制造的W4023/50G)塞住。按照本發明，預裝填針筒優選包含TACI-Ig融合蛋白含量范 圍在20-160mg，例如20、25、50、75、100、125或150mg的藥物。如以下實施例4所示，包含乙 酸鈉緩沖液和海藻糖的PH5. 0的TACI-Ig融合蛋白制劑保持在5-25°C可長期穩定，例如達 18個月。
[0096] 除非另外指明，本申請說明書所指定的各種范圍的數值都表示為近似值，正如所 述范圍內的最低值與最高值前面都有"大約"這個詞。以這種方式，可采用在所述范圍之上 或之下的輕微變更以達到與范圍內的數值基本上相同的結果。還有，所公開的范圍是連續 范圍，包括所引用的最低值與最高值之間的每一個值，以及可能形成的任何范圍。
[0097] 在本發明中，本發明的制劑或藥物組合物可包含除TACI-Ig融合蛋白以外的其它 活性成分，或與其它活性成分聯合給藥。例如，可存在皮質類固醇，特別是甲基氫化潑尼 松，還有干擾素、克拉曲濱、米托蒽醌、乙酸格拉默、那他珠單抗、利妥昔單抗、特立氟胺、 fingolimod、laquinimod或BG-12 ( -種口服延胡索酸鹽）。這種聯合治療可以同時、分開 或相繼進行。
[0098] 現已全面公開了本發明，本領域技術人員會明白，采用范圍廣泛的同等參數、濃度 和條件，不背離本發明的思路和范圍，無需過多實驗而可獲得同樣的結果。
[0099] 雖然結合具體實施例描述了本發明，但應明白可以作進一步改進。本申請旨在其 所附權利要求范圍中覆蓋按照本發明原理對本發明所作的任何變更、應用和改編，包括屬 于本發明所屬領域的已知或常規實踐、可適用于上述基本特征而與