恪疏水微粒
[0312] 吸附型樹脂由DOW提供：Amberlite XAD4、Amberlite XAD7HP和Amberlite XAD761 貝勾于Sigma Aldrich，Vienna，Austria，2011。
[0313] 使用電動機驅動陶瓷涂層的研鉢研磨樹脂過夜(20g，~12小時）。研磨的樹脂在水 中（~10% v/v，添加50ml)懸浮。上清液在4000X g(相當于相對離屯、力）下離屯、30分鐘。樹脂 在離屯、分離1分鐘(4000X g)的2M氯化鋼(50ml)中重新懸浮。丟棄離屯、1分鐘后的顆粒。轉移 上清液，再次離屯、30分鐘(4000X g)，丟棄上清液，磨碎的樹脂在水中重新懸浮（1:2)，移入 試管。在4000X g下離屯、樹脂，丟棄上清液，樹脂在50ml水性清洗液中重新懸浮。
[0314] 清洗順序為：
[0315] lx 50%化0H(稀釋有機殘留物）
[0316] 3x去離子水（稀釋EtOH)
[0317] 疏水微粒的粒徑
[0318] 通過測量l%v/v和600X倍放大下約500個顆粒的亮視野顯微鏡影像來從當量圓直 徑計算微粒的粒徑分布。
[0319] 微粒和常規色譜介質吸附/解吸的常規方案。
[0320] 在ImL批量(勻漿或標準蛋白質溶液）中進行解吸和吸附的研究。將50%(v/v)微粒 懸浮液(yL)的各種量加入2mL試管中的蛋白質溶液中。與蛋白質濃度和導電率相關的稀釋 因子被考慮在內。
[0321] 培養微粒懸浮液30分鐘，培養常規色譜介質懸浮液12小時。然后將微粒或常規色 譜介質在7000X g下離屯、10分鐘，通過加入ImL洗脫緩沖液來洗脫結合蛋白，充分混合并培 養30分鐘。在某些情況下，包括使用洗脫緩沖液的第二步清洗步驟。洗脫后，微粒或常規色 譜介質如前述被再次離屯、。上清液中的蛋白質濃度根據光度分析而被量化，祀蛋白的純度 由SDS-PAGE檢查。
[0扣。實施例η:回收酸性生物分子
[0323] 按下列步驟，使用微粒(MPs)(磨碎的色譜樹脂MARAT冊Ν Α2 (ΜΑ2))從大腸桿菌粗 勻漿進行間歇吸附重組GFP。該實施例使用GFP作為酸性細胞內可溶蛋白。
[0324] 大腸桿菌菌株HMS174(DE3)(pETllaGFP mut3.1)W化規模分批補料工藝進行發 酵。使用IPTG(異丙基β-D-1-硫代半乳糖巧)誘導細胞內可溶祀蛋白GFP(綠色巧光蛋白）表 達。
[0325] 收獲和勻質化:將大腸桿菌懸浮液(生物質含量~30%wt)冷卻至4°C，在15000g下 離屯、20分鐘。丟棄上清液，將細胞顆粒進一步處理。該細胞顆粒在50mM化iS，pH 7.5中重新 懸浮，稀釋為生物質含量為20%wt的細胞/緩沖液。細胞經高壓勻質化在lOOObar下被破壞 兩個通道(two passages),產生粗細胞裂解物。
[0326] 還可能使用冷凍的生物質從所述裂解物進行間歇吸附。運種情況下，該生物質 (20 % w/v)在50mM化iS，pH 7.5中重新懸浮，其所應用的破壞程序還可與新鮮發酵的大腸 桿菌細胞在運種情況下的破壞程序相同。
[0327] 捕獲祀蛋白
[0扣引室溫下（rt)，WlmL體積的小規模在試管中，W及W高達lOOmL的規模在玻璃燒杯 中進行間歇吸附。將MA2加入至粗細胞裂解物中（每lyg細胞顆粒中加入1化的50 % v/v MA2)，在實驗室縱滿混合器中混合~5秒，或在更大規模中W頂置式電子攬拌器混合~30 秒。混合過程中，絮凝發生，MA2結合至祀蛋白W及如DNA、hcp(宿主細胞蛋白質）和細胞片段 的雜質。經過絮凝后，該樣品在13400g下離屯、3分鐘或在頂置式壓力的死端過濾器中經 1.化ar、0.2WI1濾板過濾。丟棄該上清液，該顆粒/濾餅經進一步處理，用于清洗步驟。
[0329] 絮凝物清洗
[0330] 該絮凝物的顆粒在含75mM化Cl、pH 7.5的50mM化is清洗緩沖液中重新懸浮。經 短暫培養后，使用離屯、（13400g，3分鐘)來分離絮凝物。當使用過濾工藝進行分離時，濾餅不 會重新懸浮，但是而是通過穿過濾餅過濾清洗緩沖液來清洗濾餅（1. Sbar，ο . 2]im濾板）。丟 棄該上清液，進一步處理該顆粒/濾餅，用于洗脫步驟。低鹽濃度能夠洗脫結合強度低的雜 質。
[0331] 洗脫:洗脫步驟中，經過清洗的絮凝物在含有400mM化Cl，pH 7.5的50mM化is緩 沖液中重新懸浮。該絮凝物在容量杯中混合5分鐘。在400mM化C1濃度下，所述祀蛋白從MPs 洗脫，隨即進入上清液中。上清液經離屯、（13400g，3min)或經過死端過濾（0.2μπι濾板， 1.5bar)而從絮凝物中分離。丟棄包含結合了雜質的MPs的微粒/濾餅，包含感興趣的蛋白質 (GFP)的上清液經進一步處理。
[0332] 圖22示出了 GFP的洗脫圖譜。通道1上可見的裂解物樣本是純化過程的起始物料。 通道2是標記物(Markl2TM)。通道3顯示經過捕獲的上清液。缺失的GFP帶顯示所有的GFP分 子都結合至MPs上。洗脫在100-400mM化C1之間發生。洗脫樣品池提供GFP的98%的產量和 約60 %的通道純度。
[0側]實施例12:使用帶正電荷的微粒回收堿性生物分子
[0334] 本實施例說明了使用由磨碎的MARAT冊N A2(MA2)樹脂得到的MPs從細胞勻漿回收 重組表達的堿性蛋白。蛋白干擾素丫、IFN-丫作為實例用于細胞內可溶性表達堿性蛋白。本 實施例顯示，帶正電的交換樹脂能夠通過結合至多余的細胞結構和細胞內物質(被稱為負 凈化)而用于回收生物分子。
[0335] 通過分批補料發酵，在大腸桿菌中IFN- 丫表達為細胞內可溶。
[0336] 收獲和勻質化
[0337] 使用表達干擾素丫 IFN-丫的細胞的冷凍生物質（20%w/v)，并在裂解緩沖液(20mM TriS，lOmM邸ΤΑ，1M尿素，0.1 %β-琉基乙醇）中重新懸浮。細胞經95化ar高壓勻質化破壞Ξ 個通道，產生粗細胞裂解物。細胞破碎也將與新鮮生物質一同運作。
[0338] 祀蛋白的負凈化
[0339] 室溫下（rt)W2mL體積的小規模在試管中進行間歇吸附。該粗細胞裂解物與MA2 (50%v/v)混合，并在實驗室縱滿混合器(每化g濕細胞顆粒中加入0.7化的50%v/v M2)中 混合~5秒。混合過程中，絮凝發生，其中M2結合帶負電的如DNA、heps(宿主細胞蛋白質）和 細胞片段的雜質。經過絮凝，該樣品經13400g離屯、3分鐘，或在具有頂置式壓力的死端過濾 器中1.化ar下經0.2WI1濾板過濾。丟棄包含結合了雜質的MPs的顆粒/濾餅，包含感興趣的蛋 白質（IFN-丫）的上清液經進一步處理。
[0340] 圖23示出了干擾素丫 IFN-丫的洗脫圖譜。通道1是Markl2TM標記物，隨后是通道2- 4上用作量化目的的BSA。通道5是細胞勻漿。通道6是上清液樣品，其中添加了結合有HCPs DM和細胞片段的帶正電荷的微粒(Marathon A2)。通道7顯示了示例性的顆粒清洗和使用 lOOOmM NaCl洗脫雜質的條帶。產量高達99%，純度30%。
[0341] 實施例13:使用帶正電荷的微粒從大腸桿菌細胞回收酸性生物分子
[0342] 本實施例顯示使用由MA2制備的帶正電的MPs從完整大腸桿菌細胞萃取酸性細胞 內可溶性蛋白。在該實施例中，使用的祀蛋白是GFP。蛋白質的萃取使用兩種不同的大腸桿 菌菌株歷S174(DE3)和化21示出，所述菌株具有不同的GFP分子，分別為GFPmut3.巧日GFP.1。 進行了兩個變種的蛋白質萃取。
[03創 實施例13.1
[0344] 大腸桿菌菌株HMS174(DE3)(祀TllaGFP mut3.1)和化21(pBnKT7ix.l_GFP.l)在 化規模分批補料工藝中發酵。使用IPTG(異丙基β-D-1-硫代半乳糖巧)誘導表達細胞內可溶 祀蛋白GFP(綠色巧光蛋白）。
[0345] 收獲細胞和清洗
[0346] 收獲所述細胞，于4°C下Flexboy?袋中儲存過夜（~12小時）。將大腸桿菌懸浮液 (生物質含量~30%wt)冷卻至4°C，在15000g下離屯、20分鐘，后W50mM，pH7.5同時包含相 同的生物質含量的Tris緩沖液重新懸浮。
[0347] 細胞絮凝和回收蛋白質
[0348] 實施例13.1使用減少的量的MPs(30%濕生物質含量，每ImL細胞懸浮液中85化 MA2(50%v/v))來結合大腸桿菌并使大腸桿菌絮凝。當MPs與細胞相互接觸時發生萃取，祀 蛋白（運里是GFP)被釋放并在上清液中積累。經過2-3小時的培養，萃取完全，該絮凝的細胞 經死端過濾(0.2μηι濾餅，1. Sbar)或離屯、（13000g，3分鐘)而被分離。丟棄該細胞顆粒/濾餅， 包含祀蛋白的上清液經進一步處理。
[0349] 實施例 13.2
[0350] 該實施例中，更多的微粒被加入細胞懸浮液。較高的量的微粒允許祀蛋白直接結 合和萃取。
[0351] 大腸桿菌菌株HMS174(DE3)(祀TllaGFP mut3.1)和化21(pBnKT7ix.l_GFP.l)在 化規模分批補料工藝中發酵。使用IPTG(異丙基β-D-1-硫代半乳糖巧)誘導表達細胞內可溶 性祀蛋白GFP(綠色巧光蛋白）。
[0352] 細胞收獲和清洗
[0巧3] 收獲所述細胞W及于4°C下Flexboy(霞袋中儲存過夜（~12小時）。大腸桿菌懸浮 液(生物質含量~30%wt)冷卻至4°C，在15000g下離屯、20分鐘，后W50mM，pH7.5同時包含 相同的生物質含量的化i S緩沖液重新懸浮。
[0354]細胞絮凝和回收蛋白質
[03W]相比于實施例13.1，實施例13.2使用較高的量的微粒(30%濕生物質含量，每ImL 細胞懸浮液中35化L MA2(50%v/v))來結合大腸桿菌并使大腸桿菌絮凝。當微粒與細胞相 互接觸時發生祀蛋白萃取，該蛋白質直接被MPs結合。經過1.5至2.5小時之間的培養后，萃 取完全。上清液經死端過濾(0.2WI1濾餅，1.5bar)或離屯、（13000g，3分鐘）而被分離。丟棄該 上清液，祀蛋白絮凝的小球經進一步處理。
[0356]清洗絮凝物
[0巧7] 將絮凝物顆粒重新懸浮于含75mM化Cl、pH 7.5的50mM化is清洗緩沖液中。經短 時培養后，該絮凝物經離屯、（13400g，3分鐘)而被分離。當使用過濾工藝進行分離時，濾餅不 會重新懸浮，而是通過穿過濾餅過濾清洗緩沖液來清洗濾餅（1. Sbar，0.2]im濾板）。丟棄該 上清液，該顆粒/濾餅經進一步處理，用于洗脫步驟。低鹽濃度能夠洗脫結合強度低的雜質。 [035引洗脫
[0359]洗脫步驟中，經過清洗的絮凝物在含有400mM化C1，pH 7.5的50mM化is緩沖液中 重新懸浮。該絮凝物在容量杯中混合5分鐘。在400mM化C1濃度下，所述祀蛋白從MPs洗脫， 隨即進入上清液中。上清液經離屯、（13400g，3min)或經過死端過濾(0.2皿濾板，1.5bar)而 從絮凝物中分離。丟棄包含結合了雜質的MPs的顆粒/濾餅，包含感興趣的蛋白質(GFP)的上 清液經進一步處理。
[0360]圖24為顯示兩種不同培養時間：1小時和2小時下實施例13.2的GFP產量的柱狀圖。 1表示捕獲上清液中的GFP的量。2表示在絮凝清洗步驟中的清洗緩沖液中的GFP的量。在1或 2中沒有發現GFP漏出物。3表示在50mM化i S使用400mM化C1洗脫，其中該GFP從MPs被洗脫 并集中于上清液中。4表示經化學破壞方法得到的裂解細胞中的最大量的GFP。
[036。實施例14:使用帶正電的微粒從細胞回收堿性蛋白
[0362] 由磨碎的Dowex M-A2陰離子交換樹脂制備帶正電的微粒，W獲得如實施例1所述 的微粒。
[0363] 通過分批補料發酵，在大腸桿菌中IFN- 丫表達為細胞內可溶。
[0364] 細胞收獲和清洗
[03化]收獲所述細胞W及于4°C下Flexboy飯袋中儲存過夜（~12小時）。將大腸桿菌懸 浮液(生物質含量~30%wt)冷卻至4°C，15000g下離屯、20分鐘，后W包含相同的生物質含量 的緩沖液(20mM TrisaOmM邸ΤΑ,ΙΜ尿素，0.1%β-琉基乙醇)重新懸浮。
[0366] 細胞絮凝和回收蛋白質
[0367] 將MPs (每1血細胞懸浮液(30 %濕生物質含量)8扣L ΜΑ2(50 %v/v))加入細胞懸浮 液來結合大腸桿菌細胞并使大腸桿菌細胞絮凝。當MPs與細胞相互接觸時發生萃取，該祀蛋 白（此處為IFN-丫）被釋放并集中于上清液中。經過2-3小時的培養，萃取完全，該絮凝的細 胞經死端過濾(0.2皿濾餅，1.5bar)或離屯、（13000g，3分鐘)而被分離。丟棄細胞顆粒/濾餅， 包含祀蛋白的上清液經進一步處理。
[0：3側實施例15:使用帶負電荷的馨合微粒從細胞回收堿性蛋白
[0369] 由馨合陽離子交換樹脂AmberliteIRC748制備微粒。
[0370] 通過分批補料發酵，在大腸桿菌中IFN- 丫表達為細胞內可溶。
[0371 ]細胞收獲和清洗
[0372] 收獲所述細胞W及于4°C下Fle_xboy⑩袋中儲存過夜（~12小時）。大腸桿菌懸浮 液(生物質含量~30%wt)冷卻至4°C，在15000g下離屯、20分鐘，W包含相同的生物質含量的 緩沖液(20mM TrisaOmM邸ΤΑ,ΙΜ尿素，0.1%β-琉基乙醇)重新懸浮。
[0373] 細胞絮凝和回收蛋白質
[0374] 將MPs(每ImL細胞懸浮液（30%濕生物質含量）8化L Amberlite IRC748(50%v/ V))加入細胞懸浮液來結合大腸桿菌細胞并使大腸桿菌細胞絮凝。當MPs與細胞相互接觸時 發生萃取，該祀蛋白（此處為IFN-丫）被釋放并集中于上清液中。經過2-3小時的培養，萃取 完全，該絮凝的細胞經死端過濾(0.2皿濾餅，1.5bar)或離屯、（13000g，3分鐘）而被分離。丟 棄細胞顆粒/濾餅，包含祀蛋白的上清液經進一步處理。
[0375] 實施例16:由離子交換樹脂制備微粒
[0376] 不同類型離子交換樹脂購自Sigma A1化ich和DIAI0N。
[0377] 使用 W 下陰離子交換樹脂：4111661'1;[16 11?4-400、4111661'1;[16 11?4-743、00*6義1乂2- 100、Dowex lX2-400、Dowex lX8-100、Marathon A2、DIAI0N SA20A、DIAI0N SA10A、DIAI0N SA3120
[0378] 使用W下陽離子交換樹脂：Dowex 50WX2-100、Dowex 50WX8-100、Marathon C、 Marathon MSC、DIAI0N PK216、DIAI0N SKllO。
[0379] 在陶瓷涂層的研鉢中手動濕磨（20g，l/2h)樹脂約30分鐘。磨碎的樹脂在水中（添 加50ml)懸浮。一段時間（約96小時）后樹脂沉淀物的上清液被移至試管中。上清液在 7000rcf (相對離屯、力）下被分段（1ml)離屯、15分鐘直至每個試管的約20化1的樹脂被收集。 樹脂經離屯、（70(K)rcf)l分鐘在2M氯化鋼（1.5ml)中重新懸浮。經1分鐘離屯、分離后，丟棄顆 粒(除Amber 1 i te IRA-743之外）。上清液被轉移并再次離屯、15分鐘（7000rcf)。丟棄經15分 鐘離屯、的上清液。微顆粒(約20化1)也在2M氯化鋼中離屯、。微顆粒（約15化1)和其它磨碎的 樹脂(50-20化1)在水中重新懸浮(1:4)并且其中一部分(5化1樹脂)被移入試管中。
[0380] 等量的樹脂在7000rcf下經離屯、，丟棄上清液，樹脂在20倍體積（約1ml)的水性沖 洗液中重新懸浮。在溶液中的培養時間為30分鐘。
[0381] 清洗順序：
[0382] -lx 50%化0H(稀釋有機殘留物）；
[0383] -3x去離子水（稀釋化0H);
[0384] -檢查接近中性抑；
[0385] -微顆粒和磨碎的樹脂在去離子水中重新懸浮(約70%v/v);
[0386] -樹脂在相應的緩沖液中達到平衡用于特定試驗。
[0387] 使用光學顯微鏡確定顆粒尺寸
[0388] 使用基于軟件的尺寸測定法，通過光學顯微鏡來確定所制備的微粒的顆粒尺寸。 1000倍放大下估算相對直徑來測量磨碎材料和微顆粒的顆粒尺寸。通過比較1 % v/v下 1000-5000個顆粒的直徑尺寸來計算分布。結果見表3。
[0389]
[0391]表3所列出的樹脂用于制備微粒。
【主權項】
1. 帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述帶正電 荷的微粒包含磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，以及其中所述帶負電荷的微粒包含磨碎的聚 合的陽離子交換樹脂。2. 根據權利要求1所述的用途，其中所述生物分子是多肽或多核苷酸。3. 根據權利要求1所述的用途，其中所述帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒形成絮 凝物絮凝物。4. 帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒用于細胞破碎的用途，其中所述帶正電荷的 微粒包含磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，以及所述帶負電荷的微粒包含磨碎的聚合的陽離 子交換樹脂。5. 前述任一項權利要求所述的用途，其中所述陰離子交換樹脂和所述陽離子交換樹脂 為聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、 聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的、甲基丙烯酸(MAA)基的。6. 前述任一項權利要求所述的用途，其中所述陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂為以 二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯。7. 前述任一項權利要求所述的用途，其中所述微粒的平均粒徑小于約5μπι。8. 前述任一項權利要求所述的用途，其中所述帶正電荷的微粒或帶負電荷的微粒能夠 通過研磨聚合的陰離子交換樹脂和/或陽離子交換樹脂獲得。9. 前述任一項權利要求所述的用途，其中所述陰離子交換樹脂為Amberlite IRA-400、 Amberlite IRA-485、Dowex 1X2-100、Dowex 1-8-100、Marathon A2或DIAION SA 20A〇10. 前述任一項權利要求所述的用途，其中所述陽離子交換樹脂為411^61'1;^611?(：-748、Dowex 50WX2-100、Dowex 50WX8-100、Marathon MSC或DIAION SK 110〇11. 前述任一項權利要求所述的用途，其中所述細胞為真核細胞或原核細胞。12. -種從生物流體中獲得生物分子的方法，包括:a)將權利要求1至10中任一項所定 義的帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒加入至生物流體中，并從該生物流體中回收所 述生物分子。13. 根據權利要求12的方法，進一步包括:b)允許所述微粒形成絮凝物絮凝物；c)從所 述生物流體中去除絮凝物所述絮凝物，以及d)解吸所述生物分子。14. 一種破壞細胞的方法，包括向細胞懸浮液中加入帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的 微粒。15. 根據權利要求14的方法，進一步包括從所述細胞中釋放生物分子。16. 根據權利要求14或15的方法，其中所述生物分子是多肽或多核苷酸。17. -種包含帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒的生物流體，其中所述帶正電荷的 微粒包含磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，以及所述帶負電荷的微粒包含磨碎的聚合的陽離 子交換樹脂。18. 根據權利要求17的流體，進一步包括絮凝物絮凝物。
【專利摘要】本發明提供了一種細胞破碎和從細胞釋放生物分子的新方法。本發明包括含有磨碎的樹脂的帶正電荷和/或帶負電荷微粒的用途。它尤其適用于由細胞培養純化生物分子。
【IPC分類】C07K1/18
【公開號】CN105683210
【申請號】
【發明人】R·哈恩, A·章格鮑爾, A·特列菲洛夫
【申請人】貝林格爾·英格海姆Rcv兩合公司, 山德士股份公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年8月25日