馨合樹脂典型的特征是對特定的金屬離子 具有很大的選擇性。某些馨合樹脂可W是堿性和/或酸性，運取決于它們的官能團和pH。馨 合樹脂典型的官能團包括但不限于亞氨基二乙酸、多胺、甲基葡萄糖酷胺、硫脈、氨基麟酸。 Amberlite IRC748是示例性的馨合陽離子交換樹脂，其具有亞氨基二乙酸官能團，該官能 團能用于制備例如能從細胞懸浮液中回收生物分子的微粒。
[0145] 可商購的離子交換樹脂為:例如Amberlite、Amber jet、Duo lite和Imac樹脂，由美 國賓夕法尼亞州費城的羅口哈斯公司（Rohm祉laas of Philadelphia,化nnsylvania USA) 提供；Lewatit樹脂，來自德國勒沃庫森的拜耳公司（Bayer of Leverkusen,Germany);Dow 樹脂，來自美國密歇根州米德蘭的陶氏化學公司（Dow畑emical of Midland,Michigan USA);Diaion和Relite樹脂，來自日本東京的Ξ菱化學公司（Mitsubishi畑emical of Tokyo，Japan) ;Pu;ro lite樹脂，來自美國賓夕法尼亞州己拉辛魏德鎮的漂萊特公司 (化rolite of Bala切nwyd,Pennsylvania USA); lonac樹脂，來自美國新澤西州伯明翰盛 邦公司（Sybron of Birmin曲am,N. J.USA); W及來自美國新澤西州西柏林的Resintech公 司（Resintech of West Be;rlin,N.J.USA)的樹脂。
[0146] 帶正電的微粒能夠由聚合的陰離子交換樹脂來制備。商購的陰離子交換樹脂典型 地為Of或cr的形式。在一個實施方案中，所述陰離子交換樹脂是or的形式。該樹脂可W為 例如"Diaion"陰離子交換樹脂，諸如Diaion SA樹脂(包括DIAI0N SA 20A)和Diaion SK樹 月旨(包括DIAI0N SK 110)(來自Ξ菱化學公司）（Mitsubishi Qiemical)、"Amberlite"樹脂 諸如Amberlite IRA-400、Amberlite IRA-458、Amberlite IRA-7：M和Amberlite IRA-900 (來自羅口哈斯公司公司（Rohm &Haas))或"Dowex"樹脂諸如Dowex l、Dowex 2、Dowex 11、 Dowex 2化、Dowex lx2、Dowex lx4、Dowex 1x8和Dowex Marathon樹脂（來自陶氏化學公司 (Dow Chemical Co))。在優選實施方案中，所述陰離子交換樹脂為Amberlite IRA-458或 Marathon A2。陰離子交換樹脂的官能團可包括季胺基團例如芐基Ξ甲錠基團（1型樹脂）、 芐基二甲基乙醇錠基團（2型樹脂）、Ξ烷基芐基錠基團（1型樹脂）、二甲基乙醇胺基團（2型 樹脂）或叔胺官能團。對于細胞破碎，Marathon ΜΑ2和Amberlite IRA-458是特別優選的用 于制備帶正電荷微粒的陰離子交換樹脂。
[0147] 帶負電荷的微粒能夠由聚合的陽離子交換樹脂制備。本文所使用的聚合物材料可 W是指聚合物、聚合物混合物、交聯聚合物及其混合物，或者是指聚合物網絡。通常，聚合物 材料簡單地被稱為聚合物。可商購的陽離子交換樹脂典型地或者是H+的形式或者是Na+的形 式。在一個實施方案中，陽離子交換樹脂是H+的形式。該樹脂可W是例如"Diaion"陽離子交 換樹脂諸如Diaion PK樹脂、Diaion SK樹脂（來自Ξ菱化學公司（Mitsubishi Qiemical))， "Amberlite"樹脂例如Amber lite IRC-748(來自羅口哈斯公司（Rohm 細 aas Co .))，或 "Dowex"樹脂諸如Dowex 50WX2、Dowex 50WX8和Dowex Marathon樹脂諸如Marathon C、 Marathon MSC(來自陶氏化學公司（Dow化emical))。陽離子交換樹脂的官能團可包括橫酸 基團（-S0抽）、麟酸基團（-P0抽）、次麟酸基團（-P0抽）、簇酸基團（-C00H或-C(C曲)-C00H)及 其組合。在一個實施方案中，陽離子交換樹脂中的官能團可W是-S化H、-P化Η或-C00H，而在 最優選的實施方案中，陽離子交換樹脂中的官能團為-S化Η。對于細胞破碎，具有馨合官能 團的陽離子交換樹脂，例如Amberlite IRC 748特別優選用于制備帶負電荷的微粒。
[0148] 本文使用的聚合的陽離子交換樹脂是指具有一個或多個基本電荷的質子的聚合 物材料，或者是指該大分子本身。聚合的陰離子交換樹脂具有一個或多個基本電荷的電子。
[0149] 本發明所述帶正電的微粒是至少具有一個基本電荷的質子的顆粒，更加典型地， 該微粒在中性抑時具有多于一個基本電荷的質子，而中性抑條件下帶負電的微粒具有至少 一個基本電荷的電子。
[0150] 當微粒成分中至少一部分為離子電荷時，獲得帶正電或帶負電的微粒。
[0151] 本發明還提供一種作為新型吸附材料的用于捕獲生物分子的微粒，該微粒為固體 且是疏水性的。所述微粒是磨碎的形式，可通過磨碎諸如Amberlite XAD4、Amberlite XAD7HP、Amber 1 ite XAD761的疏水吸附材料來制備。
[0152] 在一個實施方案中，只將帶正電荷的微粒加入生物流體中。在另一個實施方案中， 只將帶負電荷的微粒加入生物流體中。還有另外一個實施方案中，將帶正電荷的微粒和帶 負電荷的微粒均加入生物流體中。如果將帶正電荷的微粒和帶負電荷的微粒均加入生物流 體中，帶正電荷的微粒和帶負電荷的微粒的比率可為約0.1:99.9(w/w)至99.9:0. l(w/w)。 例如，該比率可為約50:50，但是該比率也可^是不同的，諸如90:10、80:20、75:25、60:40、 40:60、20:80、25:75、10:90等。還有另一個實施方案中，將疏水微粒加入所述生物流體中。
[0153] 在一個優選的實施方案中，所述微粒W磨碎顆粒的形式存在，運些顆粒的平均粒 徑小于約10皿，如小于約9μηι、祉m、7皿、6皿、5皿、4μηι、3μηι、2皿和1皿。優選地，運些磨碎的顆 粒的平均粒徑小于約扣m，更優選為小于約2.5μπι。優選地，運些磨碎的顆粒的平均粒徑大于 0.5皿。因此，運些磨碎的顆粒的平均粒徑可優選的范圍為約10皿至0.5皿、約9皿至約0.扣 m、約8皿至約0.5皿、約7皿至約0.5皿、約6皿至約0.5皿、約5皿至約0.5皿、約4皿至約0.5皿、 約3μπι至約0.5μπι或約2.5μπι至約0.5μπι。然而，運些磨碎的顆粒的粒徑可大于10皿W及小于 Ο.δμπ?ο
[0154] 制備微粒
[0155] 通過研磨陰離子交換樹脂和/或陽離子交換樹脂可獲得或獲得微粒。優選地，通過 研磨樹脂和調節樹脂可獲得(或獲得)本發明所述微粒。
[0156] 優選的是，調節磨碎的顆粒來去除在制備樹脂過程中所剩余的副產品。本領域已 知離子交換樹脂的典型的調節方法，供給方也描述了運些調節方法。
[0157] 如必要，可進行"調節"來將所述樹脂中的r或0Η-轉化為化+或cr。在一個實施方 案中，通過使用NaCl和水的重復清洗步驟進行調節。在此過程中，可在水中磨碎所述樹脂并 經離屯、產生沉淀。可選擇的，已經W化+或cr形式存在的樹脂還可經商業途徑獲得，W及從 供應方獲取。
[0158] 在一個優選的實施方案中，所述微粒通過W下步驟來制備：（a)研磨離子交換樹 月旨；W及(b)將所述磨碎的樹脂在水中重新懸浮；（C)允許所述磨碎的樹脂產生沉淀；（d)從 沉淀的懸浮液的上清液中收集磨碎的樹脂；（e)將所收集的磨碎的樹脂在約2M的氯化鋼中 重新懸浮；（f)允許所述磨碎的樹脂產生沉淀；（g)從(f)步驟產生的沉淀的懸浮液的上清液 中收集磨碎的樹脂；化)允許所述磨碎的樹脂產生沉淀；（i)收集化)步驟產生的磨碎的樹脂 沉淀物，W及(j)清洗所收集的磨碎的樹脂。
[0159] 本發明的疏水微粒優選被研磨過夜，磨碎的樹脂在水中懸浮。離屯、上清液。樹脂重 新懸浮于鹽溶液諸如2M的氯化鋼中，離屯、并丟棄顆粒物。轉移上清液并再次離屯、，丟棄上清 液。磨碎的樹脂于水中重新懸浮，將其轉移至試管中。離屯、樹脂，丟棄上清液，樹脂于水性清 洗液中重新懸浮。清洗順序為：
[0160] -lx 50%化0H(稀釋有機殘留物）
[0161] -3x去離子水(稀釋化0H)
[0162] 整
[0163] 可通過本領域已知的任何方式進行研磨，其包括但不限于，通過諸如研磨機(包括 噴射式粉碎機、球磨機、鍵式粉碎機等此類）的研磨設備進行研磨，或通過例如研鉢及研巧 來手動研磨。本文使用的"研磨"是指減少粒徑大小的一種操作。技術人員能夠很容易地選 擇研磨方法來制備所述樹脂。例如，在一個實施方案中，W自動化方式通過在研鉢中移動一 個或多個研巧來濕磨樹脂。該研磨過程一直持續至所得到的大部分顆粒的粒徑小于約?〇μ m，比如所得到的顆粒粒徑小于9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5μηι。大部分的意思是超過50%，諸如 超過60%、70%、80%、90%或95%。在其它的實施方案中，大部分的顆粒具有的平均粒徑至 少為 0.1皿，諸如0.2皿、0.3皿、0.4 皿、0.5皿、0.6皿、0.7皿、0.8皿、0.9皿、1.0皿、1.1皿、1.2 μηι、1.3μηι、1.4μηι、1.5μηι、1.6μηι、1.7μηι、1.8μηι、1.94111、2.〇4111、34111、441]1或如1]1。
[0164] 技術人員運用本領域的已知方法能夠容易地確定所磨碎的顆粒尺寸。隨后通過本 領域已知的手段和方法能夠確定平均粒徑。例如，在使用諸如實施例所述的基于軟件的尺 寸確定法通過光學顯微鏡能夠確定尺寸。所磨碎的樹脂的粒徑可在放大1000倍下通過估算 等效圓直徑來確定。分布優選通過比較1%v/v下約100-500個顆粒的直徑尺寸來計算。研磨 具有大幅度增大表面積的效果，運能顯著增大生物分子尤其是蛋白質或多膚的結合容量。 優選在技術手段，諸如能識別顆粒和測量直徑的軟件的幫助下確定直徑。
[0165] 當本文使用"重新懸浮"或"懸浮"或其的任何語法形式時，其意為將微粒引入懸浮 液中。
[0166] 當本文使用"允許沉淀"時，其意為允許微粒從流體中沉淀，其中運些微粒被夾帶 并依靠障礙物停止移動。所述沉淀是由于粒子移動穿過流體時為響應作用于它們上的外力 而產生的。該外力可W是重力或通過例如離屯、機所產生離屯、加速度，優選后者。
[0167] "收集"意為從懸浮液中收獲所述微粒。
[0168] 本文使用的"洗涂"意為減少那些能破壞或干擾所述微粒性能的殘留流體的量。例 如，如上述預處理，可使用50% (v/v)乙醇化tOH)和雙去離子(dd出0)來清洗樹脂，隨后使用 d地2〇重復清洗。運些流體的每一種體積均超出微粒的體積，優選超出10倍或20倍。
[0169] 經研磨后，可任選例如通過離屯、、沉淀、過濾或其它本領域技術人員所熟知的任何 方法來移除上述優選范圍外的顆粒。
[0170] 令人驚奇的是，已經發現所述磨碎的顆粒的粗糖表面所提供的蛋白質吸附容量， 可相當于具有高結合容量的常規色譜介質所提供的蛋白質吸附容量，該常規色譜介質如 Bio-Rad Laboratories化SA)所開發的Nuvia介質。
[0171] 添加微粒
[0172] 第一步，將所述微粒加入至生物流體中。本發明所公開的微粒能夠用于實驗室規 模、中試規模或工業規模。本文所使用的"實驗室規模"包括從約1或10ml流體至約1000ml的 流體中間歇吸附生物分子。本文所使用的"中試規模"包括從約1升流體至約10升液體中間 歇吸附生物分子。本文所使用的"工業規模"或大規模包括從約10升流體至約1000升或甚至 10000升液體或更多液體中間歇吸附生物分子。
[0173] 本文所述的方法包括向所述生物流體中添加帶正電荷的微粒，或添加帶負電荷的 微粒，或既添加帶正電荷的微粒也添加帶負電荷的微粒，或添加疏水微粒。當既添加帶正電 荷的微粒也添加帶負電荷的微粒時，它們能夠作為制備的混合物被添加，或者分別被添加， W同時或連續的方式被添加。如果帶正電荷的微粒和帶負電荷的微粒W連續的方式被添 加，也就是說，一個接一個，因而，本發明包括向所述生物流體中先添加或者是帶正電荷的 微粒或者是帶負電荷的微粒，其次向該生物流體中添加帶相反電荷的微粒。考慮到例如所 述生物流體和將從該生物流體中被回收的所預期的生物分子，技術人員能夠確定是否只使 用帶正電荷的微粒或只使用帶負電荷的微粒，或既使用帶正電荷的微粒也使用帶負電荷的 微粒。
[0174] 可選擇地，根據本發明的吸附劑包括磨碎顆粒形式的疏水樹脂。此種疏水樹脂的 突出的蛋白質吸附容量優于在低鹽濃度下常規色譜介質，其尤其適用于例如多聚核巧酸和 親水蛋白質的負純化。因此，本發明提供通過應用疏水微粒來負純化多聚核巧酸或親水蛋 白質的用途和方法。為了在勻漿或標準蛋白質溶液中達到運個目的，50% (v/v)疏水微粒懸 浮液被加入至勻漿或蛋白質溶液。培養微粒懸浮液例如30分鐘。之后離屯、微粒，通過添加洗 脫緩沖液來進行結合蛋白的洗脫，混合并培養例如30分鐘。任選地，能夠包括使用洗脫緩沖 液的第二步清洗步驟。洗脫后，該微粒如前所述被再次離屯、。能夠通過例如光度分析來量化 上清液中蛋白質濃度，并能夠通過SDS-PAGE來檢查祀蛋白的純度。
[0175] 能夠將所述微粒加入至從中生物分子將被分離的生物流體中。應在廣義上理解術 語"生物流體"。它們是指任何與生物體有關聯的流體，諸如從任何生物體中獲得或由任何 生物體所產生。生物流體的實例包括細胞培養液、發酵上清液、發酵液、細胞懸浮液、細胞裂 解液。生物流體的進一步的實例如本文W上所述。在其它的實施方案中，生物流體還可W是 唾液、尿液、淋己液、前列腺液、精液、血液、血漿、血清、汗液、分泌的粘液、牛奶、牛奶乳清、 腹水、器官提取物、植物提取物、動物提取物。在一個優選的實施方案中，所述生物流體是本 文所述的任意一種生物流體，諸如多膚或多核巧酸如質粒DNA、粘粒DNA、BAC DNA、微環DNA 等。包括來源于各種體內或體外過程的流體，尤其是包括發酵液、培養液、發酵上清液、培養 上清液、細胞勻漿、細胞裂解液或細胞懸浮液。"細胞勻漿"通常被理解為破碎的細胞混合 物。細胞勻漿可通過機械或化學方法來獲得。例如，能夠通過常規方法如通過高壓勻質或通 過裂解液中的簡單滿流來使細胞均勻化從而得到發酵勻漿，所述裂解液包括堿裂解。
[0176] 因此，本發明還包括一種流體，其包含生物分子、帶正電和帶負電的微粒。在一個 優選的實施方案中，在本發明的方法的任一步驟過程中和/或之后攬拌生物流體，但是優選 不在允許顆粒形成絮凝物的步驟中和/或將絮凝物從生物流體中移除的步驟中進行攬拌。
[0177] "細胞勻漿"通常被理解為破碎的細胞混合物。細胞勻漿可通過機械或化學方法來 獲得。例如，可通過常規方法如通過高壓勻質或通過裂解液中的簡單滿流來使細胞均勻化 從而得到發酵勻漿，所述裂解液包括堿裂解。
[017引生物流體的實例包括例如源自大腸桿菌和CH0細胞培養液的細胞培養液、細胞勻 漿、細胞裂解液和發酵上清液。發酵上清液或細胞勻漿可被另外W其他方式進行過濾、離 屯、、透析、調節或處理。
[0179] 本發明的一個優選實施方案中，所述生物流體是細胞懸浮液。本文使用的"細胞懸 浮液"是指一種液體，諸如細胞培養液、緩沖液或其它任意適當的流體，優選包括完整的細 胞。"完整的"是指會封閉細胞的細胞內成份的細胞膜的物理連續性，其意味著細胞膜沒有 W任何方式已經被破壞到將會釋放細胞的細胞內成分到在常規培養條件下超過細胞膜的 滲透性的程度。
[0180] 在向生物流體中添加微粒的過程中和/或之后，它們能夠通過攬拌或振蕩（只有在 添加了MPs后)混合來獲得均勻混合物。在一些實施方案中，混合能夠通過促進細胞和/或生 物分子和微粒的相互接觸來增強絮凝和/或細胞破壞。當所述顆粒與生物流體混合的同時 吸附自發產生。然而，在一些實施方案中，添加了微粒后不需要進行混合(在實施例中被稱 為靜態培養）。
[018。培養參數
[0182] 當微粒被加入至生物流體中，可調整細胞的最佳體積濃度（用"％ (v/vΓ表示，運 是指各自的體積分數的比率）。在一些實施方案中，最佳的細胞濃度小于30% (v/v)，例如小 于約 25%(v/v)，小于約 20%(v/v)，小于約 15%(v/v)，小于約 10%(v/v)，小于約 9%(v/v)， 小于約8% (v/v)，小于約7% (v/v)，小于約6% (v/v)，小于約5% (v/v)，小于約4% (v/v)，小 于約3% (v/v)，小于約2% (v/v)或小于約1 % (v/v)。可使用混合來獲得細胞和微粒的均勻 混合物。
[0183] 在本發明的某些方面，所述微粒濃度優選小于約300% (v/v)，例如小于約200%、 100% (v/v) '80% (v/v) '70% (v/v) '60% (v/v) '50% (v/v) '40% (v/v) '30% (v/v) '20% (v/v )、10 % (v/v)或更少。選擇樹脂與細胞的體積比率，例如能夠依據微粒尺寸分布(有效 表面積)和電荷密度(每個可及區域的官能團）。
[0184] 莖避
[0185] 在一些實施方案中，在向生物流體添加了微粒后的下一步驟是允許形成絮凝物。 已經令人驚訝的發現，所述微粒一旦將細胞和/或生物分子吸附至微粒就能夠在生物流體 中與細胞和/或生物分子快速形成大直徑絮凝物。
[0186] 當微粒被加入至細胞懸浮液，細胞可W通過被吸附至微粒上而被固定在絮凝物 上。在一些實施方案中，細胞釋放生物分子并保持活性。被釋放的生物分子可W或不可W被 吸附至所述微粒上。
[0187] 當所述微粒被加入至生物流體中，例如細胞裂解液或細胞勻漿或發酵上清液，一 旦生物分子被吸附至微粒上就可W形成絮凝物。在一些實施方案中，帶正電荷和帶負電荷 的微粒首先被混合隨后被加入生物流體中，一旦微粒混合物和生物流體相互接觸，就會發 生絮凝。在其它實施方案中，先向生物流體中加入帶正電荷的微粒或先加入帶負電荷的微 粒，隨后再分別加入帶相反電荷的微粒，從而形成絮凝物。
[0188] 在一個實施方案中，所述生物分子為酸性。在運種情況下，帶正電荷的微粒被加入 至生物流體例如細胞裂解液或細胞勻漿中來進行吸附。帶正電荷的微粒還可被加入至細胞 懸浮液，其加入量或者是僅足夠破壞細胞而釋放生物分子的量，或者是將破壞細胞并吸附 生物分子的較高的量。技術人員能夠確定部分地或完全地破壞細胞所需要的量。之后帶負 電荷的微粒可被加入，其作為交聯劑來增大絮凝物的粒徑和穩定性。可選擇地，帶負電荷的 微粒諸如由馨合陽離子樹脂制備的微粒還可被加入至該細胞懸浮液中，其加入量是足W破 壞該細胞并釋放生物分子用于進一步的純化的量。任選地，帶正電荷的微粒可隨后被加入 來增加絮凝物。
[0189] 在另一個實施方案中，所述生物分子為堿性。運種情況下，帶正電荷的微粒可被加 入生物流體諸如細胞裂解液或細胞勻漿中，W和細胞碎片或其它諸如DNA、宿主細胞蛋白和 細胞片段的雜質形成絮凝物。帶負電荷的微粒可被加入來增大絮凝物的粒徑和穩定性，從 而該絮凝物能夠被容易地分離出并被丟棄。由于該堿性生物分子沒有被結合至帶正電荷的 微粒，因此，它能夠從上清液中被回收。可選擇地，帶正電荷或帶負電荷的微粒可足夠 破壞細胞并釋放生物分子并用于進一步純化的量被加入至細胞懸浮液。該絮凝物典型地具 有100M1的尺寸或甚至更大的尺寸，運使得它們是可見的并利于將它們分離。運意味著其它 非預期的材料諸如細胞和/或細胞碎片能夠通過過濾而不需要進行離屯、而被容易地去除。 因此本發明比現有技術的方法快速而簡單。本發明并不必須但是如果使用柱色譜法則可能 需要再生樹脂。此外，所述微粒是價格便宜的材料，因而在使用后可W將其丟棄。
[0190] 在一個優選的實施方案中，絮凝物具有的平均粒徑至少為扣m，諸如至少為10、20、 30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000皿、2000皿或形成 更大的絮凝物。
[019。吸附容量
[0192]本文使用的"吸附容量"被定