化4] 圖13:GFP表達的大腸桿菌經不同濃度化Cl(200-1000mM)洗脫后使用Marathon A2 微粒(樹脂與細胞的體積比率50 % )培養(50mM TRI S，pH 8.0) 3小時所得到的非祀蛋白萃取 物與大腸桿菌勻漿、勻漿上清液得到的非祀蛋白萃取物之間的對比，由SDS-化ge和考馬斯 亮藍染色所確定。
[0055] 圖14:圖13中SDS-Page的光密度分析。
[0化6]圖15:GFP表達的大腸桿菌勻漿上清液的蛋白質圖譜，與大腸桿菌經Marathon A2 微粒(樹脂與細胞的體積比率50%)靜態培養(50mMTRIS，pH8.0)3小時并經300mMNaCl洗 脫所獲得的洗脫液的蛋白質圖譜相比較。
[0057] 圖16:使用Amberlite IRA458和Marathon A2(樹脂與細胞的體積比率50、70、 100%v/v)微粒靜態培養(50mMTRIS，pH8.0)并隨后經化Cl洗脫后，從大腸桿菌勻漿和細 胞懸浮液（10%v/v)萃取蛋白質（SOD)期間的dsDNA下降動力學。由英杰公司的"Pico Green 如an 111"分析系統來估算DM的量。
[0化引圖17:使用Marathon A2微粒靜態培養（50mM TRIS，抑8.0)并隨后經化C1洗脫后， 從大腸桿菌勻漿和細胞懸浮液（10%v/v)萃取蛋白質（SOD)動力學過程中，內毒素減少。由 購于龍沙公司的巧roGene?重組因子C分析系統來估算內毒素的量。
[0059] 圖18:磨碎的樹脂的原子力顯微鏡（AFM)圖像。Marathon A2(圖像1)、Marathon MSC(圖像2)和Amberlite IRC748(圖像3)的高度測量。
[0060]圖19:大腸桿菌細胞的原子力顯微鏡(AFM)圖像。經磨碎的Marathon A2培養之前 (左圖）和培養1小時之后的高度測量。
[006。 圖20:無微粒培養的大腸桿菌HMS174(GFPmut3.1)的覆蓋圖像（圖1)，使用磨碎的 Marathon A2培養1小時后的覆蓋圖像（圖2)，使用Amberlite IRC748在50mM，p冊.0TRIS中 培養1小時的覆蓋圖像(圖3)。
[0062] 圖21:使用Marathon A2微粒(樹脂與細胞的體積比率70%)靜態培養(50mM TRIS， P冊.0)并經生理緩沖液Wl:l〇稀釋后，大腸桿菌細胞（l〇%v/v)的存活率。活的（綠色)/死 的(紅色)細胞由英杰公司的巧acLi te"巧光染色試劑盒進行染色。
[0063] 圖22: SDS-Ge 1顯示了使用微粒來從細胞勻漿中捕獲GFP的洗脫圖譜。
[0064] 圖23:SDS-Gel顯示了使用微粒從細胞勻漿中回收IFN-丫的洗脫圖譜。
[0065] 圖24:顯示了實施例13.2中捕獲上清液（1)、清洗緩沖液(2)、經洗脫的GFP(3)中的 GFP的量與使用化學破壞法(4)的GFP最大量的比較的柱狀圖。 閨]本發明的項目
[0067] 還可W通過下述項目來描述本發明的特點：
[0068] 1.帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述帶 正電荷的微粒包含磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，W及其中所述帶負電荷的微粒包含磨碎 的聚合的陽離子交換樹脂，其中所述生物分子優選為多膚或多核巧酸。
[0069] 2.帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒用于細胞破碎的用途，其中所述帶正電 荷的微粒包含磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，W及其中所述帶負電荷的微粒包含磨碎的聚 合的陽離子交換樹脂。
[0070] 3.疏水微粒用于回收生物分子的用途。
[0071] 4.根據項目1或2所述的用途，其中所述陽離子交換樹脂為弱酸性或強酸性。
[0072] 5.根據項目1或2所述的用途，其中所述陰離子交換樹脂為弱堿性或強堿性。
[0073] 6.根據項目1或2所述的用途，其中所述陽離子交換樹脂和/或所述陰離子交換樹 脂為馨合樹脂。
[0074] 7.根據前述任一項目所述的用途，其中所述陰離子交換樹脂和所述陽離子交換樹 脂為聚苯乙締基的、甲基丙締酸徑乙醋化EMA)基的、甲基丙締酸二甲氨基乙醋(DMAEMA)基 的、聚甲基丙締酸二甲氨基乙醋(pDMAEMA)基的、聚丙締酷胺基的、甲基丙締酸(MAA)基的。
[0075] 8.根據前述任一項目所述的用途，其中所述陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂為 W二乙締基苯交聯的聚苯乙締。
[0076] 9.根據前述任一項目所述的用途，其中所述微粒的平均粒徑低于約如m。
[0077] 10.根據前述任一項目所述的用途，其中所述帶正電荷的微粒或帶負電荷的微粒 通過研磨聚合的陰離子交換樹脂和/或陽離子交換樹脂可獲得。
[0078] 11.根據前述任一項目所述的用途，其中所述陰離子交換樹脂為Amberlite IRA- 400'Amberl ite IRA-485、Dowex 1X2-100 、Dowex 1-8-100'Marathon A2 或 DIAI0N SA 20A。
[0079] 12.根據前述任一項目所述的用途，其中所述陽離子交換樹脂為411166^^0 1肪- 748、Dowex 50WX2-100、Dowex 50WX8-100'Marathon MSC或DIAI0N SK 110。
[0080] 13.根據前述任一項目所述的用途，其中所述樹脂無孔。
[0081] 14.根據前述任一項目所述的用途，其中所述細胞為真核細胞或原核細胞。
[0082] 15.根據項目1至14中任一項所述的用途，其中所述細胞選自腸桿菌科、假單胞菌 科、乳酸菌科或芽抱桿菌科。
[0083] 16.根據項目14或15所述的用途，其中所述細胞為大腸桿菌。
[0084] 17.根據前述任一項目所述的用途，其中所述生物分子為蛋白質或多核巧酸。
[0085] 18.-種從生物流體中獲得生物分子的方法，包括:a)向生物流體中加入項目1至 13中任一項所定義的帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒或疏水微粒，并從該生物流體 中回收該生物分子。
[0086] 19.根據項目18所述的方法，進一步包括:b)允許所述微粒形成絮凝物；C)從所述 生物流體中去除該絮凝物；W及d)解吸該生物分子。
[0087] 20.根據項目19所述的方法，其中所述生物流體是細胞懸浮液、發酵液、培養液、細 胞勻漿或發酵上清液。
[0088] 21.根據項目18至20中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括經步驟a)和/ 或步驟d)后攬拌所述生物流體。
[0089] 22.根據項目18至21中任一項所述的方法，其中步驟C)通過分離技術如離屯、或過 濾來進行。
[0090] 23.根據項目18至22中任一項所述的方法，其中所述陽離子交換樹脂為弱酸性或 強酸性。
[0091] 24.根據項目18至22中任一項所述的方法，其中所述陰離子交換樹脂為弱堿性或 強堿性。
[0092] 25.根據項目18至22中任一項所述的方法，其中所述陽離子交換樹脂和/或所述陰 離子交換樹脂為馨合樹脂。
[0093] 26.根據項目18至25中任一項所述的方法，其中所述陰離子交換樹脂和所述陽離 子交換樹脂為聚苯乙締基的、甲基丙締酸徑乙醋化EMA)基的、甲基丙締酸二甲氨基乙醋 (DMAEMA)基的、聚甲基丙締酸二甲氨基乙醋(pDMAEMA)基的、聚丙締酷胺基的、甲基丙締酸 (MAA)基的。
[0094] 27.根據項目18至26中任一項所述的方法，其中所述陽離子交換樹脂和陰離子交 換樹脂為W二乙締基苯交聯的聚苯乙締。
[00M] 28.根據項目18至28中任一項所述的方法，其中所述微粒的平均粒徑低于約如m。
[0096] 29.根據項目18至28中任一項所述的方法，其中所述帶正電荷的微粒或帶負電荷 的微粒通過研磨聚合的陰離子交換樹脂和/或陽離子交換樹脂可獲得。
[0097] 30.根據項目18至29中任一項所述的方法，其中所述陰離子交換樹脂為Amberlite IRA-400、Ambe;rlite IRA-485、Dowex lX2-100、Dowex l-8-100、Marathon A2或DIAI0N SA 20A。
[0098] 31.根據項目18至30中任一項所述的方法，其中所述陽離子交換樹脂為Amberlite IRC-748、Dowex 50WX2-100、Dowex 50WX8-100'Marathon MSC或DIAI0N SK 110。
[0099] 32.根據項目18至31中任一項所述的方法，其中所述樹脂無孔。
[0100] 33.根據項目18至32中任一項所述的方法，其中所述細胞為真核細胞或原核細胞。
[0101] 34.根據項目18至33中任一項所述的方法，其中所述細胞選自腸桿菌科、假單胞菌 科、乳酸菌科或芽抱桿菌科。
[0102] 35.根據項目34所述的方法，其中所述細胞為大腸桿菌。
[0103] 36.根據項目18至35中任一項所述的方法，其中所述生物分子為蛋白質或多核巧 酸。
[0104] 37.-種用于破壞細胞的方法，包括向細胞懸浮液中加入帶正電荷的微粒和/或帶 負電荷的微粒或疏水微粒。
[0105] 38.項目37所述的方法，進一步包括從所述細胞中釋放生物分子。
[0106] 39.項目37或38所述的方法，其中所述生物分子為多膚或多核巧酸。
[0107] 40.-種生物流體，包括帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒或疏水微粒，其中 所述帶正電荷的微粒包括磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，W及其中所述帶負電荷的微粒包 括磨碎的聚合的陽離子交換樹脂。
[0108] 41.根據項目40所述的流體，還包括絮凝物。
[0109] 42.帶正電荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述帶正電荷的微粒包括磨 碎的聚合的陰離子交換樹脂，其中所述生物分子為酸性或堿性。
[0110] 43.項目42所述的用途用于從細胞裂解液或細胞勻漿中回收生物分子。
[0111] 44.項目42所述的用途用于從細胞懸浮液中回收生物分子。
[0112] 45.帶負電荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述帶負電荷的微粒包括磨 碎的聚合的陽離子交換樹脂，W及其中所述生物分子為酸性或堿性。
[0113] 46.項目45所述的用途用于從細胞裂解液或細胞勻漿中回收生物分子。
[0114] 47.項目45所述的用途用于從細胞懸浮液中回收生物分子。
[0115] 48.帶正電荷的微粒和帶負電荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述帶正 電荷的微粒包含磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，所述帶負電荷的微粒包含磨碎的聚合的陽 離子交換樹脂，其中所述生物分子為酸性或堿性。
[0116] 49.項目48所述的用途用于從細胞裂解液或細胞勻漿中回收生物分子。
[0117] 50.項目48所述的用途用于從細胞懸浮液中回收生物分子。
[0118] 51.帶正電荷的微粒用于細胞破碎和釋放細胞中的生物分子的用途，其中所述帶 正電荷的微粒包含磨碎的聚合的陰離子交換樹脂，W及其中所述生物分子為酸性或堿性。
[0119] 52.帶負電荷的微粒用于細胞破碎的用途，其中所述帶負電荷的微粒包含磨碎的 聚合的陽離子交換樹脂，W及其中所述生物分子為酸性或堿性。
[0120] 53.-種從生物流體中獲得生物分子的方法，包括:a)向生物流體中加入帶正電荷 的微粒和/或帶負電荷的微粒，W及從該生物流體中回收該生物分子，其中所述生物分子為 酸性或堿性。
[0121 ] 54.根據項目53所述的方法，其中所述生物流體為細胞懸浮液、細胞裂解液或細胞 勻漿。
[0122] 55.-種從細胞獲得生物分子的方法，包括:a)加入帶正電荷的微粒和/或帶負電 荷的微粒來破壞細胞，由此從細胞中釋放該生物分子，W及b)回收該釋放的生物分子。
[0123] 56.根據項目55所述的方法，其中所述生物分子為酸性或堿性。
[0124] 57.根據項目55所述的方法，其中加入所述帶正電荷的微粒。
[0125] 58.根據項目55所述的方法，其中加入所述帶負電荷的微粒。
[01%] 發明詳述
[0127] 本發明提供使用本文所述的帶電荷的微粒或疏水的微粒來回收生物分子和/或破 碎細胞的簡單而快捷的方法。本發明在一定程度上基于驚奇的發現，特別是，所述帶電荷的 微粒能夠破壞細胞，并能夠進一步從所述細胞中釋放和吸附生物分子，因而能夠快速、有效 地回收生物分子。此外，已經發現帶電荷的微粒當被加入生物流體時能快速形成大直徑(例 如至少扣m)絮凝物，如此則所述微粒能夠與細胞相互作用或被吸附至細胞和/或吸附生物 分子，運樣能使被吸附于微粒上的生物分子和/或由微粒和生物分子形成的絮凝物被容易 地分離。運同樣也適用于疏水微粒。
[0128] 本領域技術人員將領會的是，本發明尤其適用于包括本文所述的試驗規模或工業 規模的大規模應用中從生物流體諸如細胞懸浮液中分離蛋白質或質粒。帶電荷的微粒和/ 或疏水微粒能夠有利地用于間歇處理(本文稱為"間歇吸附"）。
[0129] 此外，本文所述的新型方法提供高的回收效率和低的污染水平。本發明能夠有利 地應用于回收生物分子，特別是，當應用常規方法萃取生物分子時，該生物分子對溫度或剪 切敏感并易于變形。
[0。0] 細胞和生物分子
[0131] 正如之前所述，本發明提供從流體如生物流體中回收生物分子的方法。在一些實 施方案中，本發明的方法設及在生物流體中破壞細胞和從細胞中釋放生物分子。所述生物 分子優選為細胞內生物分子，諸如蛋白質或質粒。隨后所釋放的生物分子能夠從生物流體 中被回收。
[0132] 如本文所述，術語"細胞內的"是指細胞內所發現的任何物質。本文所定義的"生物 分子"包括通常在細胞中被發現的或由細胞所合成的任何分子，其包括多膚或多聚核巧酸。 所述生物分子可W是酸性或堿性生物分子。生物分子的實例包括但不限于寡糖、多糖、脂多 糖、寡膚、蛋白質、核巧、類黃酬、寡核巧酸、DNA(多鏈或單鏈DNA)、質粒DNA、RNA(多鏈或單鏈 RNA)、有機金屬化合物、氨基酸、脂肪、喀晚、嚷嶺、碳水化合物、膚類化合物、毒素、類固醇和 酶。
[013；3]當本文使用"細胞"時，其是指能夠產生(表達)生物分子的細胞，優選"宿主細胞'。 該類細胞能夠應用于本發明的方法中。外源核巧酸序列可被引入該細胞用于產生生物分 子。
[0134] 可被用于本發明的方法中的細胞或宿主細胞或者可W是原核細胞或者可W是真 核細胞，或者既有原核細胞又有真核細胞。更優選地，本發明的方法中使用的細胞為包括哺 乳動物、鳥類、兩棲類、魚類細胞和昆蟲細胞的脊椎動物細胞。細胞或宿主細胞還包括真核 細胞。典型地，真核細胞為哺乳動物細胞、鳥類細胞或昆蟲細胞。細胞或宿主細胞還包括酵 母細胞或真菌細胞。然而，該宿主細胞優選為原核細胞，該原核細胞包括來自革蘭氏陰性細 菌的細菌細胞，例如來自腸桿菌科的細胞，例如大腸桿菌，或來自假單胞菌科的細胞，如惡 臭假單胞菌，或來自革蘭氏陽性細菌的細胞，例如來自乳酸細菌或芽抱桿菌的細胞。然而， 該宿主細胞最優選為大腸桿菌。
[0135]
[0136] ??所定義的"帶電荷的"微粒是帶正電荷的微粒和/或帶負電荷的微粒。"帶正電 荷的"微粒具有至少一個基本電荷的質子，更典型地在抑中性時具有多于一個基本電荷的 質子。"帶負電荷的"微粒具有至少一個基本電荷的電子，更典型地在抑中性時具有多于一 個基本電荷的電子。
[0137] 所述微粒可包括磨碎的樹脂。應用于本發明的樹脂是固體、非可溶性聚合物材料， 該聚合物材料能夠相互作用于或依附于各種要素，并允許從混合物中捕獲該類元素。樹脂 通常由惰性化合物組成，其包括但不限于:交聯葡聚糖、聚苯乙締、聚丙締酷胺、聚甲基丙締 酸醋或中性多糖。它們還可包括交聯的天然聚合物如纖維素、葡萄聚糖或瓊脂糖。
[0138] 根據優選實施方案，微粒是由離子交換樹脂、更優選聚合的陰離子交換樹脂和/或 陽離子交換樹脂來制備的。離子交換樹脂是指包含帶電荷聚合物的不溶性載體的固相支持 體，所述帶電荷聚合物攜帶了固定官能團或具有可交換離子的位點。用于制備微粒的適當 的離子交換樹脂的說明性實例包括陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂和混合模式層析樹 月旨，本文有時也稱為混合模式的離子交換樹脂。可交換離子形式通常為化\r、〇!T或cr離 子中的一個或多個，運取決于離子交換樹脂的種類。離子交換樹脂包括弱酸和強酸陽離子 交換樹脂W及弱堿和強堿陰離子交換樹脂。適當的離子交換樹脂還包括馨合樹脂。
[0139] 離子交換樹脂廣泛應用于各種工業領域。離子交換樹脂通常用在例如水處理領 域，用于鍋爐水的去礦化或用于發電廠冷凝處理;食品領域，用于糖溶液的純化;或超純水 領域，用于半導體的制備。
[0140] 本發明的優選實施方案中，微粒由多孔球形離子交換樹脂制備。球形離子交換樹 脂通過懸浮聚合法來制備，其中將包括單官能基加成聚合單體和自由基聚合引發劑的單體 混合物加入水性介質中，隨后攬拌，W制備單體混合物的懸浮液。然后將該懸浮液在聚合溫 度下保持一段時間，W獲得球形交聯共聚物。用于水處理的離子交換樹脂的直徑典型地為 300-600μπι。在其它實施方案中，微粒可由凝膠類型和/或大孔離子交換樹脂制備。
[0141] 離子交換樹脂的聚合物基體可包括聚苯乙締、聚苯乙締和苯乙締共聚物、聚丙締 酸醋、芳基取代乙締基共聚物、聚甲基丙締酸醋、苯酪-甲醒、聚烷基胺及其組合，諸如此類。 在一個優選的實施方案中，所述聚合物基體為聚苯乙締和苯乙締共聚物、聚丙締酸醋或聚 甲基丙締酸醋，而在另一個實施方案中，所述聚合物基體為苯乙締二乙締基苯(DVB)共聚 物。優選地，所述用于制備微粒的離子交換樹脂所使用的樹脂為聚苯乙締基的、甲基丙締酸 徑乙醋化ΕΜΑ)基的、二甲氨基甲基丙締酸乙醋(DMAEMA)基的、聚二甲氨基甲基丙締酸乙醋 (pDMAEMA)、甲基丙締酸(ΜΑΑ)基的。最優選地，所述樹脂由W二乙締基苯(DVB)交聯的聚苯 乙締制成。
[0142] 本文所使用的陽離子交換樹脂可W是弱酸性或強酸性。正如本文所使用的，術語 "弱酸性陽離子交換樹脂"是指運樣一種樹脂，其經常規方法(例如Fisher等人，巧ffect of Cross-1 inking on the Properties of Carboxylic Polymers.I.Apparent Dissociation Constants of Acrylic and Methacrylic Acid Polymers，'J.Phys.Chem.， 60(8)，1030(1956))測量的表觀解離常數或電離常數(pKa)高于約4.5。它可具有作為交換 基團的簇酸基團、酪型徑基團、麟酸基團和腫簇基團。另一方面，術語"強酸性陽離子交換樹 月旨"是指地a小于約1.5的樹脂。強酸性陽離子交換樹脂可具有橫酸基團諸如聚苯乙締橫酸 鋼或聚AMPS。所述橫酸基團（-HS03)是交換基團，其為強酸性表現，在堿性溶液中，甚至在酸 性溶液中會離解成(-S〇3)-和H+。
[0143] 本文所使用的陰離子交換樹脂可W是弱堿性或強堿性。本文使用的術語"弱堿性 陽離子交換樹脂"是指運樣一種樹脂，其經常規方法(例如Fisher等人，Effect of化OSS- linking on the Properties of Carboxylic Polymers. I.Apparent Dissociation Constants of Acrylic and Methacrylic Acid Polymers，'J.Phys.Chem.，60(8)，1030 (1956))測量的表觀解離常數或電離常數(pKa)高于約8.5。該樹脂可具有作為交換基團的 伯氨基、仲氨基和/或叔氨基基團例如聚乙締胺。在另一方面，術語"強堿性陰離子交換樹 月旨"是指地a小于約12的樹脂。強堿性陰離子交換樹脂可具有季氨基基團，例如，作為交換基 團的Ξ甲基胺基團如聚APTAC，或二甲基乙醇胺。
[0144] 本文使用的陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂還包括馨合樹脂，該馨合樹脂包括 能夠與金屬離子形成馨合物(復合物)的官能團。