義為平衡狀態下每ml樹脂所吸附的生物分子的量 (mg)。本文使用的平衡是指吸附率等于解吸率的狀態。所述微粒對預期的生物分子特別是 可溶性多膚或多核巧酸的吸附容量，能夠通過生物分子洗脫之前和之后例如量化上清液中 的多膚或多核巧酸來確定，例如通過巧光性或分光光度法來確定。生物分子量的差被認為 吸附到了微粒上。正如本領域技術人所能理解的是，該吸附容量可取決于各種參數，諸如微 粒的特性、生物分子、pH、溫度、鹽濃度W及其它參數，或其組合。在一些實施方案中，在實施 例3.1.5所列出的條件下，每m 1樹脂的帶正電荷的微粒能夠吸附至少5mg，諸如至少6、7、8、 9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100111邑的6尸口。在其它實施 方案中，在實施例4.1.3所列出的條件下，每ml樹脂的帶正電荷的微粒可吸附至少5mg，諸如 至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100111邑的500。 [01W] 去除絮凝物
[0194]通常，能夠通過過濾、離屯、、沉淀或其它任何適當的方法將所述絮凝物從液體(如 生物流體或緩沖液）中去除。技術人員能夠容易地確定使用何種方法能從流體分離或解吸 該絮凝物。對于中試和工業規模的操作，所述絮凝物懸浮液能夠例如或者是在斗式離屯、機 (實驗室規模）、管式離屯、機、傾析式離屯、機或者是在碟片式離屯、機（disk stack centrifuge)中被處理。同樣地，可能通過過濾或者通過沉淀或萃取來去除絮凝物殘留處的 絮凝物。能夠通過逆流萃取傾析機、混合沉降器或柱式萃取器來完成解吸。其它對去除有用 的方法可W是正切流動過濾、深層過濾、死端過濾或設及使用壓濾機、濾過器的方法。
[01巧]生物分子的解吸
[0196] 能夠利用本領域已知的任何方法進行解吸。例如，能夠通過將絮凝物在緩沖液中 重新懸浮來進行解吸，運允許解吸生物分子如蛋白質(解吸緩沖液）。運能夠通過使用本領 域已知的任何方法來實現，運些方法包括管式(靜態)混合器或其它混合設備例如攬拌槽。 還能夠通過逆流萃取傾析機、混合沉降器或柱式萃取器來進行解吸。
[0197] 然后，使所述懸浮液經歷適合解吸的條件。技術人員能夠容易地確定該類用于解 吸吸附在所述絮凝物上的生物分子的條件。通常，能夠采納用在常規離子交換色譜法中的 解吸方法。例如，能夠通過在低于或高于等電點的pH下洗脫或者通過增加鹽濃度來完成解 吸。
[0198] 所述生物分子能夠通過本領域已知的方法來進一步純化或富集。運些方法包括， 例如，沉淀法、結晶法和/或選自下列的色譜法:疏水作用色譜法、親和色譜法、假親和色譜 法、陰離子或陽離子交換色譜法和/或尺寸排阻色譜法。因此，在一個優選的實施方案中，本 文所述的方法包括通過使用上述沉淀法和/或色譜法來純化和/或富集該（期望的）生物分 子的進一步的步驟，所述生物分子尤其為蛋白質。
[0199] 然而，在一些實施方案中已經發現，所述細胞在沒有吸附至微粒的情況下一旦與 所述微粒相互作用就能夠釋放生物分子。在運種情況下，細胞沒有被吸附至微粒上，將不會 發生絮凝。例如，當帶電荷的微粒被加入至攜帶了相反表面靜電荷的細胞的細胞懸浮液中 時，該細胞不會被吸附至微粒上，將不會觀察到絮凝。細胞的"表面凈電荷"在此被定義為細 胞表面存在的所有的電荷總數，運可取決于周圍溶液的pH。
[0200] 所釋放的生物分子可W或不可W吸附至微粒上。如果所述生物分子沒有吸附至微 粒上，不發生生物分子解吸。在運種情況下，能夠通過將細胞和微粒從流體中分離，例如通 過離屯、或過濾或其它任何方式，將生物分子從上清液中回收。如果生物分子吸附至微粒上， 通過改變微粒的條件例如通過解吸緩沖液來允許洗脫生物分子而使解吸得W實現。由于所 述絮凝物的尺寸，在所述生物分子被解吸緩沖液所解吸后，所形成的絮凝物很容易從解吸 緩沖液中被分離出去。
[0201] 本領域技術人員很容易了解應用何種方法來實現從微粒和/或細胞中分離上清 液。
[0202]
[0203] 明能夠用來從生物流體和/或細胞中回收生物分子。W所有語法形式存在的 回收生物分子可表示為獲得（obtained)、收獲化arvested)、取得（achieved)或得到 (gained)生物分子。生物分子可W是質粒、多聚核巧酸或表達產物諸如膚、蛋白質，包括糖 基化修飾的蛋白質或翻譯后修飾的蛋白質。通過本領域已知的和/或本文所述的手段和方 法，可使生物分子被分離和/或被進一步處理，如被進一步純化。此外，回收還包括運樣的實 施方案，即破壞細胞而從細胞中釋放生物分子，運可能使其從細胞培養液被分離出去。隨后 的步驟中，生物分子能夠被進一步的純化和/或富集。
[0204] 細胞破碎
[0205] 本發明進一步提供通過向細胞懸浮液中加入帶電荷的微粒來破壞細胞的方法。術 語"細胞破碎"或"破壞細胞"在本文中在使細胞滲透到能從細胞中釋放生物分子的程度的 方法或過程中被交替使用。細胞破碎可W或不可W包括細胞死亡。優選地，細胞破碎不包括 細胞結構如細胞壁的完整碎片，運種細胞破碎引致了細胞片段的減少，降低了不需要的污 染物水平，所述污染物包括細胞碎片。本發明的一些實施方案中，通過本文所述的方法破壞 的細胞會釋放生物分子并保持細胞的活力。術語"活力"是指細胞具有在適當的生長條件下 繁殖的能力。
[0206] 所釋放的生物分子可W或不可W吸附至用于破壞細胞的微粒上。通過使用本文所 述的方法或其它已知技術，隨后能夠從生物流體中回收生物分子。因此，本發明提供了新的 W簡單的兩步法工藝用于細胞破碎、生物分子釋放和隨后生物分子的回收的方法。本發明 的微粒可用于打開細胞來釋放生物分子，從而無論生物分子(也就是說，該生物分子可W是 酸性、堿性或中性)的酸度如何，該生物分子能在細胞懸浮液中被回收。
[0207] 選擇性
[0208] 相對于通過細胞破碎常規方法所獲得的生物分子，本發明的方法所提供的生物分 子具有較高的純度。特別是，相對于現有技術中使用的常規方法，本發明的方法具有較高的 選擇性，運是因為所回收的生物分子部分中非祀物質的量較少。所回收的生物分子具有高 純度是有利的，因為它不需要進一步的連續純化步驟。優選地，本發明的方法提供的生物分 子相對于非祀生物分子的相對富集超過30%，諸如超過40%，超過50%，超過60%，超過 70 %，超過80%，超過90 %或直至100 %。相比于非祀生物分子，給定生物分子的純度的評估 方法對本領域技術人員而言是可獲得的。對于多膚，示例性方法為:蛋白質在SDS聚丙締酷 胺凝膠電泳(SDS-Page)上被分離后，經考馬斯藍染色，然后進行定量測量。
[0209] 當應用常規方法進行細胞破碎時，細胞被破壞，核酸、細胞壁成分和其它片段被釋 放。因此，所回收的生物分子必須經過進一步純化來去除污染物。然而，文本所述方法能夠 減少大分子污染物的釋放。該類污染物可包括但不限于dsDNA、RNA、宿主細胞蛋白、宿主細 胞碎片和內毒素。已經令人驚奇地發現，相對于實施例2.2所述的通過標準HPH方案所獲得 的細胞勻漿中的dsDNA含量，本發明的方法顯著減少了高達2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或甚至 更多的dsDNA含量。本領域技術人員能夠通過例如可購買得到的巧光或比色檢測來確定給 定樣品中的dsDNA含量。優選地，當使用本發明的方法時，細胞釋放的dsDNA減少了 5倍，更優 選減少了 10倍，或更少，諸如所釋放的dsDNA減少了 100倍或1000倍。
[0210] 本文所使用的"內毒裏'與脂多糖化PS)交替使用，其是革蘭氏陰性菌的外部細胞 膜的主要成分。一旦細菌外部細胞膜破壞。典型地會釋放內毒素。令人驚訝的是，與如實施 例2.2中所述的通過標準HPH方案獲得的細胞勻漿中的內毒素含量相比，本發明的方法已經 顯示減少了釋放的內毒素的量。優選地，當使用本發明的方法時，細胞所釋放的內毒素減少 了5倍，更優選減少了 10倍，或更少，諸如減少了 100倍、1000倍、104倍、105倍或106倍。本領域 技術人員能夠通過例如使用整變形細胞溶解物(LAL)凝膠檢測、LAL顯色檢測和其它可商購 或本領域已知的顯色檢測而容易地確定內毒素的含量。 腳。培養能產生生物分子的細胞(即"產物"）
[0212]在應用本發明的吸附劑之前，本文所定義和描述的獲得生物分子的方法可任選包 括培養(宿主)細胞的步驟，其會產生例如表達生物分子(所述"產物"），優選表達產物諸如 蛋白質或多核巧酸。在本發明的宿主細胞的描述中，在培養基(或者有血清或者沒有血清） 中，術語"細胞的培養"或"培養細胞"分別是指將細胞接種于培養容器中，在貼壁培養的情 況下細胞在培養基中生長直至形成單分子層，或在懸浮液培養液的情況下，細胞在培養基 中生長直至建立足夠的細胞密度，和/或是一旦形成單分子層時在培養基中維持細胞，或是 在懸浮液中維持細胞。在培養基中，術語"細胞的培養"或"培養細胞"還包括使用無血清培 養基W進行上述所提及的所有步驟，W便在細胞的整體培養過程中，不存在或本質上不存 在動物血清產物。培養細胞可通過指數喂養、或線性、或常數喂養，或其它類型的喂養、補料 分批培養或高密度培養來進行培養。還可選擇的是，上述提及的步驟還可結合包含培養基 的血清進行。
[0213] 核巧酸序列和/或編碼的多膚相對于細胞可W是或可W不是異源的。所謂"異源" 的意思是源自具有不同基因組背景的細胞或生物體，或者相對于（宿主）細胞是同源的，但 是相比于自然發生對應的所述核巧酸序列，其位于不同的基因組環境。運意味著，如果核巧 酸序列相對于宿主是同源的，則它不位于它在所述宿主飛基因組中的天然位置，尤其是它 被不同的基因所包圍。
[0214] 在本發明一個優選的實施方案中，所述表達產物是蛋白質的產物。本文使用的"蛋 白質的"是指任意一組復合有機大分子，其包括碳、氨、氧、氮，通常還包括硫，由一條或多條 氨基酸鏈所組成。優選的蛋白質的表達產物為多膚。因此，術語"蛋白質的"還意為與蛋白質 相關的、由蛋白質組成的、類似蛋白質的或與蛋白質有關的。在本發明一個更優選的實施方 案中，所述產物是所產生的感興趣的多膚。優選地是，所述產物是具有生物活性的。所述蛋 白質產物可W是酸性或堿性。
[0215] 所述表達產物可W是核巧酸序列轉錄和/或翻譯的產物，優選在基因工程的宿主 細胞中通過本領域已知的常規手段和方法被外源添加至細胞的核巧酸序列。所述產物可W 是包括例如質粒、微環DNA、粘粒、BAC、ssDNA或dsDNA序列或RNA序列（核酶、反義RNA、siRNA、 iRNA、miRNA核酸，諸如此類）的核巧酸序列，所有運些能夠在細胞中產生，或者其可W是通 過在細胞中翻譯轉錄RNA的方式產生的膚或多膚。
[0216] 本文使用的"多狀'包括蛋白質、膚、多膚及其片段，所述"多狀'全部優選是有生物 活性的。術語"多膚"和"蛋白質"可交替使用，其是指具有任意長度，通常具有多于約1〇、20 或30個氨基酸的聚合物。運些術語還包括通過包括糖基化、乙酷化和憐酸化反應翻譯后修 飾的蛋白質。所述多膚類可W是融合于用于延長半衰期的融合伴侶的融合多膚，例如作為 親和色譜的親和標記物的Fc融合、白蛋白融合，或者用于提供正確的N-末端或用于增加感 興趣的蛋白的產量的融合伴侶。術語"膚"是指較短的氨基酸，通常少于約30個氨基酸。多膚 可作為激動劑或括抗劑，和/或具有治療或診斷的用途。
[0217] 此外，盡管也能夠生產微生物和酵母產品，但在本發明的細胞中所表達的多膚可 W是哺乳動物起源。
[0218] 哺乳動物多膚或蛋白質的實例包括激素，細胞因子，淋己因子，抗體如抗原結合片 段(Fabs)、納米抗體、單域抗體(dAbs)、單鏈抗體(scFvs)，受體，粘附分子和酶及其片段。所 期望產物的非詳盡的列表包括例如人生長激素、牛生長激素、甲狀旁腺素、促甲狀腺激素， 卵泡刺激素生長，黃體化激素，激素釋放因子，脂蛋白，α1-抗膜蛋白酶，膜島素 A鏈，膜島素 B 鏈，膜島素原，降血巧素，膜高血糖素，分子諸如腎素，凝結因子如Vine因子、IX因子，組織 因子，血管性血友病因子(von Willebrands factor),抗凝血因子如蛋白C，屯、房鋼尿因子， 肺表面活性物質，纖溶酶原激活物如尿激酶、或人尿、或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，鈴 贍膚，凝血酶，造血生長因子，腫瘤壞死因子α和β，腦啡膚酶，RANTES (正常T細胞表達和分泌 的活性調節），人巨隧細胞炎性蛋(MIP-1-α)，血清白蛋白例如人血清清蛋白，副中腎管抑制 物質，松弛素 A或B鏈，前松弛素（prorelaxin)，小鼠促性腺激素相關膚，脫氧核糖核酸 (Dnase)，抑制素，激活素，激素或生長因子受體，整聯蛋白，蛋白A或D，類風濕因子，神經營 養因子如骨源性神經營養因子(抓NF)，神經營養因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT- 6)，包括血管內皮生長因子(VEGF)的生長因子，神經生長因子如NGF-，血小板源性生長因子 (PDGF)，成纖維細胞生長因子如aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5、FGF-6，表皮生長因子巧GF)，轉化 生長因子(TGF)如 TGF-a和 TGF-β，其包括 TGF-P1、TGF-P2、TGF-P3、TGF-p4 或TGF-P5，膜島素 樣生長因子-巧P-II(IGF-巧016。-11)，(163(1-3)-16。-1(腦16。-1)，膜島素樣生長因子結合 蛋白，CD蛋白質如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19,紅細胞生成素，骨誘導因子，免疫毒素，骨形態 發生蛋白（BMP)，干擾素如干擾素 α、β和丫，集落刺激因子(CSF)例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF， 白細胞介素類(IL)例如IL-1至IL-10,超氧化物歧化酶，紅細胞生成素，T-細胞受體，表面膜 蛋白例如肥R2,誘巧加速因子，病毒抗原諸如例如AIDS包膜部分，運輸蛋白，歸巢受體，稟呈 素，調節蛋白，抗體，嵌合蛋白如免疫粘附素，W及上述所列舉任一項多膚的片段。
[0219] 本文優選的多膚和蛋白質是具有治療作用的蛋白質，諸如TGF-i3、TGF-a、PDGF、 EGF、FGF、IGF-I、面ase;纖溶酶原激活劑，如t-PA;凝結因子，如組織因子和VIII因子;激素， 如松弛素和膜島素;細胞因子，如IFN-y;嵌合蛋白，如TNF受體IgG免疫粘附素(TNFr-IgG)， 或抗體如雙特異性抗體、駱駝抗體及其片段、Vhh域抗體、域抗體;免疫球蛋白類，如抗-IgG、 抗-IgA、抗-IgM、抗-I曲或抗-I巧。優選的具有治療作用的蛋白質是人源蛋白質或"人源化" 蛋白質，如本文上述的人源化抗體。
[0220] 如果產物是多膚，該多膚可W優選允許所述多膚分離和/或純化的異源多膚標記， 即融合。所述異源多膚可W例如是組氨酸標簽、Flag-標簽、鏈霉親和素標簽、鏈球菌II標 簽、內含膚、麥芽糖結合蛋白質、IgA或IgG Fc部分、蛋白質A或蛋白質G。
[0221] 如果所述產物是包括核巧酸序列的多核巧酸，該核巧酸序列可與異源核巧酸序列 融合，該異源核巧酸序列允許所述作為核巧酸序列的表達產物分離和/或純化。例如，所述 異源核巧酸序列能夠結合至互補的核巧酸序列，由此允許所述核巧酸序列的分離和/或純 化。當在異源多膚或核巧酸序列的描述中使用"異源"時，其意為多膚或核巧酸序列不同于 所需要產物的多膚或核巧酸序列。
[0222] 作為多核巧酸的實例，如果所述產物為質粒，則所述質粒對于基因治療或DNA疫苗 是有用的，或所述質粒可編碼具有治療作用的蛋白質，例如本文所述的蛋白質。
[0223] 在另一方面，所述細胞可表達病毒，也就是說該宿主細胞作為生產細胞系，其能提 供例如適當的病毒復制和/或被傳播的環境。因此，所述產物可W是病毒。事實上，任何病毒 能夠被本發明的方法回收，例如dsDNA病毒(例如腺病毒、瘤疹病毒，痘病毒類）、ssDNA病毒 (例如細小病毒）、dsRNA病毒(例如呼腸孤）、（+)ssRNA病毒（例如小核糖核酸病毒、披膜病 毒）、（-)ssRNA(例如正粘病毒、彈狀病毒）、ssRNA-RT病毒(例如逆轉錄病毒)和dsDNA-RT病 毒（例如嗜肝病毒）。病毒復制的術語用于描述在祀細胞中的感染和繁殖的過程中形成病 毒。從病毒的角度看，病毒復制的目的是為了允許運種類型的病毒的生產和生存。通過產生 其基因組的豐富副本W及將運些副本包裝到病毒中，該病毒能夠繼續感染新的宿主。本發 明的上下文中，優選地，通過適當宿主細胞產生的病毒不能夠或本質上不能夠退出宿主細 胞，例如通過裂解或萌芽。
[0224] 如前所述，所述產物可W是病毒。"病毒"包括"天然"病毒和"重組"病毒，其中，"天 然"意為從自然中分離但不是通過基因工程(例如臨床分離)得到的病毒，或能夠在自然(也 就是說，自然發生的）中發現的病毒，或典型地建立的病毒株，例如用于免疫目的（例如致弱 病毒）。
[0225] 總而言之，本發明提供的方法快速、高效和成本低，能夠容易地應用于工業規模。 實施例 除]實施例1:由離子交換樹脂制備微顆粒
[0227]用于水處理的樹脂珠購自DOW。表1示出了經測試的樹脂概況。
[022引
[0229] 表 1
[0230] 所有樹脂經預處理為它們的鋼或氯形式分別用于陽離子交換劑(Marathon MSC， Amberlite IRC748)和陰離子交換劑(Marathon A2，Amberlite IRA458)。之后顆粒經去離 子水(< ImS/cm，pH中性)重復清洗。圖1示出了樹脂官能團的概況。
[0231] 微粒在肥TSCH公司WLabstar LSI砂磨機濕磨或使用巧和研鉢手動濕磨。表2示出 了經研磨獲得的平均粒徑分布(PSD)概況。通過光學顯微鏡放大lOOOx來測量粒徑，通過計 算500-50000離散投影來估算平均當量直徑。
[0232]
[0233] 表2:粒徑分布
[0234] 光學投影的磨碎顆粒的形狀被認為是不明確的。懸浮液濃度經離屯、進行調節并在 去離子水中由填充床體積來估計。根據濕樹脂和干樹脂的重量差來計算含水量。
[0端]實施例2:回收祀蛋白 腳引實施例2.1通過CSPE回收祀蛋白
[0237] 將大腸桿菌(HMS174)細胞在37°C(GFPmut3.1)和30°C(S0D)的分批補料中培養。 IPTG誘導重組蛋白表達。通過離屯、來收集細胞。室溫下，對等分樣品進行蛋白質萃取實驗。 最初的細胞體積濃度(濕填充床)大約為10%v/v。運在4000rcf下離屯、50ml的懸浮液10分鐘 來確定。各種細胞和鹽濃度的實驗中，顆粒在各自的緩沖液中經充分混合而懸浮。通過向 50%懸浮液中加入lOx的儲備溶液并使用dd此0稀釋而將最終細胞、顆粒、緩沖液和鹽濃度 調節至工作體積（20ml)。室溫下（~23Γ)于攬拌燒杯(混合)或試管(靜態）中進行多達3小 時的培養。兩者具有相似的高徑比。使用底部的便捷磁力攬拌器將混合強度調整至80化pm。 為了量化釋放蛋白，取1ml等分樣品經各自的緩沖液Wl:2稀釋。隨即樣品于SOOOrcf下經離 屯、多達lOmin(~23°C)，上清液被收集用于進一步研究。 腳引實施例2.2:通過HPH萃取祀蛋白
[0239] 將大腸桿菌(歷S174)細胞在37°C(GFPmut3.1)和30°C(S0D)的分批補料中培養。將 細胞在緩沖液(50mM化is，pH8.0，100mM化Cl)中懸浮至25%v/v并經高壓勻質化(Niro- Soave Panda化，lOOMpa下2x通過）而被破壞。
[0240] 實施例3:利用巧光量化祀蛋白
[0241] 實施例3.1:巧光
[0242] 使用陰離子交換（AIEX CaptoQ)、疏水作用（ButylSepharose)和凝膠過濾 (SuperdexG75制備級）色譜分析連續純化澄清的大腸桿菌勻漿（lOOOOrcf下離屯、60分鐘并 經0.2微孔過濾)來制備GFPmut3.1標準品（>95% )。濃度由280nm(在100°C下8M尿素中變性 10分鐘）處的吸光度確定。當量巧光在酶標儀(Tecan GENios Pro)上485nm(激發）和535/ 20nm(發射)處的標準校正來確定。
[0243] 相對于HPH細胞破碎（如實施例2.2所述，在10019日下2個通道(9日33日肖日3))量化6尸？ 的回收效率(回收率％)。
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