244] 實施例3.1.1:細胞濃度
[0245] 確定來自通過在磨碎的Marathon A2(MA2)上吸附并W化C1洗脫而回收的大腸桿 菌細胞中的GFP的回收率。在體積濃度20%(v/v)、6%(v/v)和l%(v/v)下，細胞經離屯、并懸 浮于50mM，pH 8.0的TRIS而從細胞培養液中被分離。細胞懸浮液與各種體積比率200%、 100 %、50 %和0 %的樹脂混合并靜態培養1小時。通過W2M NaCl W1:2稀釋的等分懸浮液進 行洗脫。水相中的GFP通過巧光被量化。相同條件下使用磨碎的Marathon MSC(匪SC)來與陽 離子樹脂比較。
[0246] 圖2顯示了在細胞濃度為6 % (v/v)時GFP的回收率達到100 %。在細胞濃度為20 % (v/v)時所萃取的蛋白的量減少至50% W下。相反，向20% (v/v)細胞懸浮液中加入較少量 的微粒引致了較高的回收率，高達45%。所回收的GFPW1%的量隨著微粒量成比例減少。在 不加入微粒的情況下，上清液中的GFP低于20%。通過在相同條件下使用磨碎的Marathon MSC(陽離子交換劑)進行培養，沒有觀察到其對蛋白質萃取和細胞破碎產生影響。
[0247] 實施例3.1.2:樹脂:細胞的體積比率
[024引在不同的樹脂：細胞的體積比率下，確定來自通過在磨碎的Marathon A2(MA2)上 吸附并W化Cl洗脫而回收的大腸桿菌細胞中的萃取的GFP的回收率。在10% (v/v)下，細胞 經離屯、而從細胞培養液中被分離并懸浮于50mM，pH 8.0的TRIS中。所述細胞懸浮液與各種 體積比率200 %、100 %、70 %、50 %、30 %和0 %的樹脂混合并靜態培養1小時。通過W 2M NaCl W1:2稀釋的等分懸浮液進行洗脫。水相中的GFP通過巧光被量化。
[0249] 圖3顯示了經過1小時培養后，通過從磨碎的Marathon A2進行解吸，幾乎100%的 GFP被回收。不添加 Marathon A2時從細胞所萃取的總的可溶性GFP少于20%。
[0巧0] 實施例3.1.3 :pH和培養時間
[02引]在不同pH和培養時間下，確定來自通過在磨碎的Marathon A2(MA2)上吸附并W 化C1洗脫而回收的大腸桿菌細胞中的萃取的GFP的回收率。通過加入化0聞尋細胞培養懸浮 液的抑調節至7.5、8.0和8.5。細胞懸浮液與體積比率為100%的樹脂進行混合，靜態培養3 小時。通過W2M NaCl W1:2稀釋的等分懸浮液進行定期（10、60、120、180分鐘)洗脫。水相中 的GFP通過利用巧光被量化。在3小時的最大培養時間后，在抑7.5和8.0下，從細胞培養液中 可W回收總可溶性GFP約40 %和70 %。只有在P冊.5時能回收100 %的GFP。
[0巧。實施例3.1.4:pH、樹脂:細胞體積比率和培養時間
[0253] 進一步研究樹脂:細胞體積比率在1-100%之間的影響。通過加入NaO聞尋細胞培養 懸浮液的pH調節至7.5、8.0和8.5。細胞懸浮液W各種樹脂：細胞體積比率100 %、70 %、 50 %、30 %和0%進行混合，靜態培養3小時。通過W2M化C1W1:2稀釋的等分懸浮液進行定 期（10、60、120、180分鐘)洗脫。水相中的GFP通過利用巧光被量化。
[0254] 圖4顯示了抑對最大回收率具有顯著的影響，而所加入的樹脂的影響微不足道。在 pH 8.5時，樹脂:細胞比率(v/v)為70 %并經2小時靜態培養后，其被認為能有效破壞10 % (v/v)的細胞懸浮液并能直接從細胞培養液中回收GFP。
[0巧引 實施例3.1.5:鹽濃度和GFP吸附容量
[0巧6] 在不同化C1鹽濃度(0-500mM)下，確定來自通過在磨碎的Marathon A2(MA2)上吸 附并W化Cl洗脫而回收的大腸桿菌細胞中的萃取的GFP的回收率。細胞經離屯、而從細胞培 養液中被分離并懸浮于50mM，pH 8.0的TRIS中。使用2M化C1緩沖溶液調節懸浮液的NaCl濃 度。細胞懸浮液W各種樹脂:細胞體積比率100%、70%、50%、30%和0%進行混合，靜態培 養1小時。通過W2M化C1W1:2稀釋的等分懸浮液進行洗脫。水相中的GFP通過利用巧光被 量化。
[0巧7] 圖5顯示了在OmM NaCl下，高達100%的6。?被回收。
[0258] 通過比較解吸前和解吸后（圖6)的水相（上清液）中的濃度來研究結合至微粒的 GFP的量。GFP量的差被認為吸附至樹脂。該趨勢符合標準朗格繆爾方程。
[0259] 實施例3.1.6: W陰離子馨合樹脂萃取
[0260] 還證實了通過使用馨合微粒（圖7)從大腸桿菌細胞培養中來萃取蛋白質。與 Marathon A2的強堿性季基團相反，由Amberlite IRA 748自制的微粒的亞氨基二乙酸基團 是具有對多價陽離子有高親和力的陽離子交換劑。在運種情況下，沒有觀察到懸浮液的絮 凝。 惦61 ] 在50mM TRIS，P冊.0緩沖液中，30 %和70 % v/v體積比率的樹脂:細胞(5 % v/v)中 培養并隨后經1M NaCl進行洗脫后，確定使用馨合(磨碎的Amberlite IRA 748)和陽離子微 粒(磨碎的Marathon A2)而從細胞懸浮液(大腸桿菌)得到的GFP萃取物，與在相同條件下但 不經過鹽洗脫得到的GFP萃取物相比較(圖7a、b)。進一步地，確定在攬拌和靜態培養條件下 得到的GFP萃取物（圖7a、b)。相比于磨碎的M2中的蛋白質經解吸而被回收，GFP沒有被吸附 至馨合微粒上。在所進行的規模下，使用馨合微粒進行培養時使用靜態或攬拌條件似乎并 不影響所產生的蛋白質產量。
[026。實施例3.1.7:洗脫條件對蛋白質萃取的影響 惦63] 在50mM TRIS，p冊.0緩沖液中，30%、70%和100%￥八體積比率的樹脂:細胞(5% v/v)中培養并隨后經1M NaCl進行洗脫后，確定使用馨合(磨碎的Amberlite IRA 748)和陽 離子微粒(磨碎的Marathon A2)而從細胞懸浮液(大腸桿菌)得到的GFP萃取物，與在相同條 件下但不經過鹽洗脫得到的GFP萃取物相比較。通過在pH8.0,50mM TRIS，使用磨碎的 Amberlite IRA 748培養大腸桿菌細胞2小時而獲得的GFP萃取率高達100% (圖8)。隨著被 添加的馨合微粒體積比率的增加，回收GFP的產量增加。
[0264] 實施例3.1.8:細胞濃度對蛋白質萃取的影響
[0265] 攬拌燒杯中，在50111]\1了1?15，口服.0緩沖液中，20%、15%、10%和5%細胞體積濃度 下的70%v/v樹脂：細胞體積比率中培養但不經過鹽洗脫后，確定使用馨合樹脂（磨碎的 Amberlite IRA 748)而從細胞懸浮液(大腸桿菌)得到的蛋白質(GFP)萃取物（圖9)。懸浮液 中較高的細胞濃度有利地影響了馨合微粒的萃取率。確定了設及大腸桿菌的干重(d.m.)的 蛋白質萃取量的GFP萃取動力學(圖10)。
[026引 實施例4:利用SDS化ge量化祀蛋白
[0267]大腸桿菌勻漿中重的固體部分在4000rcf下離屯、15分鐘被分離出。上清液被轉移， 其中輕的部分在4000rcf下離屯、60分鐘被收集。顆粒在去離子水中懸浮，隨后如前述被依次 洗涂兩次。細胞碎片和粗的勻漿的標準樣品W，pH 8.0的10M尿素 Wl:5稀釋并在旋轉振動 篩上培養1小時。
[0%引在1:4SDS樣品緩沖液和0.2M DTT中，所有的樣品在100°C下加熱10分鐘。在200V、 最多為400mA下、MES-SDS電泳緩沖液中，在8-12%聚丙締酷胺凝膠上進行電泳60分鐘。使用 考馬斯亮藍R250和BismarkBraunR(Choi等人，1996)進行染色。利用光學凝膠掃描化pson Perfection Scan V770,600dpi，1化it灰度模式）軟件進行光密度測定，WLumiAnalyst (v3.0Roche Diagnostics)軟件進行評估。
[0%9] 實施例4.1: SOD萃取
[0270] 證明來源于經Amberlite IRA458制得的陽離子微粒所培養的大腸桿菌細胞的蛋 白質萃取物。與Marathon A2的聚苯乙締/二乙締苯(PS/DVB)基質相比，由丙締酸樹脂所獲 得的微粒在相同填充床體積下包含更多的水。使用丙締酸微粒(較大的絮凝物和較快的沉 淀)的絮凝明顯增強，但并沒有進行詳細研究。此外，祀蛋白是超氧化物歧化酶(SOD)而不是 (GFP)o 腳。實施例4.1.1:不同培養條件下的蛋白質產量
[0272] 在試管中，50mM，P冊.0的TRIS緩沖液中【請指出】，50 %、70%和100 % v/V體積比率 的樹脂：細胞（10%v/v)中靜態培養并隨后經化C1進行洗脫后，使用丙締酸樹脂（磨碎的 Amberlite IRA458)而從細胞懸浮液(大腸桿菌)得到的蛋白質（SOD)萃取率被確定。通過密 度法從SDS-化ge上的標準校準來評估蛋白質的量（圖11)。使用丙締酸樹脂靜態培養1小時 后的SOD釋放動力學基本完成。W0.5M和1.0M化C1回收吸附在丙締酸微粒上的SOD至相等 的量。 腳引實施例4.1.2:從大腸桿菌勻漿中回收SOD
[0274] 經過短暫混合和培養(50mM TRIS，p冊.0)并隨后使用船(：1(0.01、0.51、0.1]\〇進行 洗脫后，使用Amberlite IRA 458微粒(樹脂:細胞體積比率100%、70%、50%v/v)培養后， 確定從1 ο % (v/v)細胞懸浮液得到的大腸桿菌勻漿中SOD的回收率。在濃度為ο. 5M和1. OM下 洗脫，被吸附至Amberlite IRA 458微粒上的SOD所被回收的量相等(圖12)。 腳引實施例4.1.3: SOD吸附容量
[0276] 研究結合至微粒上的SOD的量。
[0277] SOD標準(>95%由SDS-Page的考馬斯染色鑒別)通過W下來制備:使用A2微粒從大 腸桿菌細胞萃取和在70%v/v(樹脂/細胞)50mM，pH 8.0TRIS緩沖液中經培養2小時后使用 0.2M化C1解吸并隨后通過凝膠過濾進行純化(GE的S叫erdexG75制備級）。根據在280nm (ΙΟΟΓ下8M尿素變性lOmin)處的吸光度來確定濃度。根據SDS-page上5點刻度處的光密度 來評估樣品濃度。通過相對于標準進行整合，比較經萃取和勻質化所獲得的SOD樣品濃度。
[0別]實施例5:非祀蛋白萃取
[02巧]通過SDS-化ge檢查吸附在經磨碎的Marathon A2上的所萃取的GFP的純度，與勻漿 相比較。HPH后，在40(K)rcf下離屯、分離大腸桿菌勻漿中重的固體部分(包含例如GFP內含體） 15分鐘。在4000rcf離屯、60分鐘后，轉移上清液并收集輕的均漿部分。該輕的勻漿部分包含 細胞碎片和膜蛋白諸如外膜蛋白A(OmpA)，并作為細胞破碎的指示劑。顆粒在去離子水中懸 浮，如前述順序清洗兩次。細胞碎片和粗品勻漿的標準樣品經10M，抑8.0尿素 Wl:5稀釋， 在旋轉振動器上培養1小時。使用W50%v/v磨碎的Marathon A2在50mM，p冊.0TRIS中培養 細胞化而萃取得到的粗勻漿、勻漿上清液和洗脫的蛋白進行SDS-化ge。等分懸浮液在200、 250、300、350、400、450、500和1000111]\1化(：1中^1:2被稀釋。所有樣品在相同稀釋比率下進 行SDS-化ge，考馬斯染色的光密度測定法用于評估蛋白質的量。經清洗的細胞碎片被應用 作為~39kDa(0MP)的主要膜蛋白的參考。
[0280] 萃取后，與粗品的和澄清的勻漿進行比較，在300mM化C1解吸條件下只有15%各 自17%的非祀蛋白被檢測到。相同條件下，在上清液中的輕的勻漿部分中分別發現了 6%和 12%的蛋白質。
[0281] 進一步地，勻漿上清液和洗脫的蛋白分別在靜態條件下混合的70%v/v的磨碎的 Amberlite IRC 748和磨碎的Marathon A2，pH 8.0,50mM TRIS中培養細胞2小時后進行比 較。等分懸浮液在50mM TRIS緩沖液或1M化C1中:2被稀釋。所有樣品的SDS-化ge在相同 稀釋比率下進行，考馬斯染色的光密度測定法用于鑒別蛋白質的量。
[0282] GFP回收率根據SDS-化ge(考馬斯亮藍）的光密度法來評估，并與洗脫的宿主細胞 蛋白特別是膜蛋白（圖13、14、15)進行比較。所萃取的蛋白在50 % v/v磨碎的Marathon A2， pH8.0,50mM TRIS中培養細胞3小時后，進行比較。等分懸浮液在200、250、300、350、400、 450、500和lOOOmM化C1中W1:2被稀釋。所有樣品的SDS-Page在相同稀釋比率下進行，考馬 斯染色的光密度測定法用于鑒別蛋白質的量（圖13)。在300mM化C1下，Marathon A2上清液 中的GFP幾乎被回收了 100%。較高鹽濃度下的解吸使較高量的非祀蛋白和輕質蛋白部分被 回收（圖14)。與上清液高壓勻質相比，使用微粒培養細胞分別萃取了平均15%的輕質蛋白 部分和平均20 %的非祀蛋白。
[0283] 考馬斯染色檢測的蛋白質圖譜顯示了在利用HP冊皮壞的細胞的上清液中的蛋白純 度與使用微粒萃取的蛋白純度不同。圖15示出了勻漿上清液的蛋白質圖譜，W及使用50% v/v磨碎的Marathon A2,在抑8.0,50mM TRIS中培養細胞3小時后使用300mM化C1洗脫后的 蛋白質圖譜。樣品的SDS-Page在相同稀釋比率下進行，考馬斯染色的光密度測定法用于鑒 別蛋白質相對量。勻漿中GFP的相對純度為9.8 %，在300mM NaCl洗脫液中GFP的相對純度為 37.4 %，經過萃取后平均值為33.2 % ± 2.9 %。
[0284] 在另一方法中，使用70%的磨碎的Amberlite 748在抑8.0,50mM TRIS培養細胞2 小時后，確定勻漿上清液和萃取的蛋白質的蛋白質圖譜定。樣品的SDS-Page在相同稀釋比 率下進行，考馬斯染色的光密度測定法用于鑒別蛋白質相對量。勻漿中的GFP的相對純度為 12.4 %，上清液中的GFP的相對純度為38.4 %，經過萃取后的平均相對純度為41.6 % ± 2.7%。
[0285] 在50mM，pH 8.0(1〇%乂八)了315緩沖液中靜態培養細胞，隨后經化(：1洗脫，在使用 陽離子樹脂(Marathon A2)而從細胞懸浮液(大腸桿菌)萃取蛋白質（SOD)動力學過程中，確 認所述非祀蛋白的減少。通過從SDS-Page的光密度測定來估算非祀蛋白的量。從細胞萃取 的SOD純度比使用苯乙締微粒從勻漿中捕獲的SOD純度高出兩倍。
[0巧6] 實施例6: SOD活性
[0287] 使用苯乙締陽離子微粒Marathon A2(MA2)在50mM，pH 8.0TRIS緩沖液，70%v/v體 積比率樹脂:細胞（10%v/v)中靜態培養細胞并隨后經0.5M NaCl洗脫后，從細胞懸浮液(大 腸桿菌）和勻漿中進行萃取后，確定了使用苯乙締陽離子微粒Marathon A2(MA2)而從細胞 萃取的SOD的酶活性。上清液經離屯、（1ml，30min，23 °C和leOOOrcf)、過濾(PVDF膜，0.2皿)和 經各自的緩沖液W1:10逐步稀釋至有效測量范圍。SOD活性由購自Sigma的19160S0D測定試 劑盒來確定。使用(MA2)微粒從細胞萃取的SOD的酶活性比從勻漿捕獲的SOD的酶活性平均 增大了一個單位。
[0巧引實施例7:污染物
[0289] 使用購自英杰公司的Quant-iTT" PicoGreen液dsDNA檢測試劑盒量化DNA。使用購 自Lonza公司的巧roGene?重組因子C檢測系統量化內毒素。所有的上清液樣品經離屯、（1ml， 30min，23°C和160(K)rcf)、過濾(PVDF膜，0.2皿)和經各自的緩沖液Wl:10逐步稀釋至有效 測量范圍，根據酶標儀(GE化OS Pro或Infinite 200M，來自Tecan)上各自的試劑盒指示說 明進行測量。
[0 巧 0]實施例 7.1:dsDNA
[0巧1 ] 使用丙締酸樹脂（Amber 1 ite IRA458)和陽離子樹脂（MarathonA2)在50mM， p冊.OTRIS緩沖液，50、70、100 % v/v體積比率樹脂:細胞（10 % v/v)中靜態培養細胞并隨后 經化C1洗脫后，確定了在從細胞懸浮液（大腸桿菌）萃取蛋白質（SOD)的過程中dsDNA減少 了。如上述量化DNA。使用微粒培養細胞所釋放的dsDNA減少了高達102。蛋白質洗脫條件 (0.5M NaCl)下，上清液中的dsDNA減少量在102和103之間（圖16)。
[0巧。實施例7.2:內毒素
[0巧3] 在50mM，pH 8.0(l〇%v/v)TRIS緩沖液中靜態培養細胞，隨后經化C1洗脫后，在使 用陽離子樹脂(Marathon A2)從細胞懸浮液(大腸桿菌)萃取蛋白質（SOD)動力學過程中，確 定內毒素減少。如前所述量化內毒素的量。
[0294]在洗脫條件下被釋放至上清液的內毒素比從勻漿所吸附的內毒素減少103(圖 17)。在0.5M NaQ和1.0M NaCl中內毒素減少了約10倍。
[0巧引實施例8:顯微技術
[0巧引實施例8.1:原子力顯微鏡(AFM)
[0297] 使用薦糖（50mM)溶液、去離子水和微粒稀釋懸浮液依次處理帶正電荷的顯微切 片。經每一個步驟后，65°C下干燥24小時。在BOKU(Dr.Gerhard Sekhot)公司的納米生物技 術部口進行測量。
[0298] 開源軟件Gwyddion(v2.60)用于AFM數據的可視化。由于原珠機械磨損的結果，明 顯產生了邊緣表面形貌。磨碎的顆粒具有類似的表面形貌(圖18)。
[0299] 使用磨碎的Marathon A2進行培養前和培養后，利用大腸桿菌的AFM(圖19)所產生 的圖像表明蛋白質不經過細胞破碎而被萃取。
[0300] 實施例8.2:光學顯微技術
[0301] 在維也納生物技術研究所(VIBT)，在萊卡"活細胞"寬視野顯微鏡上進行共聚焦顯 微技術和巧光顯微技術。樣品在各自緩沖液中被稀釋至~l%v/v的固體濃度，1000倍放大 (萊卡HCX PL AP0 lOOx 1.4油）下能夠可見。
[0302] 1000倍放大下進行明視野(BF)、微分干設對比（DIC)和巧光顯微技術。在默認的 GFP的激發和發射波長下，細胞是移動的，有亮巧光。細胞通過被吸附至微粒上而被固定（圖 20)。
[030引實施例9:細胞活性
[0304] 實施例 9.1:BacLite
[0305] 使用MarathonA2微粒(70%樹脂:細胞體積比）靜態培養巧0mMTRIS，pH8.0)2小 時并在生理緩沖液中Wl: 10被稀釋后，大腸桿菌細胞（10% v/v)的存活率。細胞經 巧acLite"(英杰公司）染色。圖21示出了活細胞(綠色)和死細胞(紅色）。
[0306] 實施例9.2:柯赫氏板化och's plates)
[0307] 使用磨碎的Marathon A2和Amberlite IRA 458所獲得的微粒(70%v/v樹脂:細胞 比）在50mM，pH 8.0TRIS中靜態培養大腸桿菌細胞（10%v/v)3小時后，確定細胞活性。細胞 (大腸桿菌GFP)和細胞/樹脂懸浮液(1ml等分)被漸進化稀釋，并在無菌的0.9%w/w NaCl中 Wl: 10充分混合。蒸汽壓力罐中，默克公司的用于微生物的營養瓊脂(ΝΑ) W20g/1存在于 d地2〇中，12rC下被加熱15分鐘。等分（1ml)稀釋緩沖液被傾倒入培養皿中，與55°C下調節 的NA溶液混合。室溫下30分鐘后，認為完全形成凝膠，將該板37°C下過夜培養30小時。
[0308] 使用陽離子微粒培養后，確定了更多的菌落形成單位(CFU)并高達103。在生理緩 沖液中被稀釋1000倍，表明被吸附的細胞不能繁殖后，獲得微粒相關的CFU值。
[0309] 在經10倍稀釋而不使用樹脂的細胞和使用陽離子微粒進行萃取GFP后經1000倍稀 釋的細胞中，利用光學顯微鏡來確定細胞的身份。尺寸、形狀和巧光性與大腸桿菌GFP相符 厶 1=1 〇
[0引0] 實施例10:疏水微粒 [031。 審