的此0中畑4肥〇3啟動反應。使反應在室溫下繼續進行~30-60分鐘，一旦反應完成(通 過MALDI判斷），凍干。凍干后，如上述純化修飾的膚，但是用Gemini C18柱(Phenomenex)取 代Luna C8,并將酸變成0.1%Ξ氣乙酸。合并含有正確TMB-修飾物質的純饋分，凍干并保存 在-20°C下進行儲存。
[0259] 除非另有注明，所有氨基酸構型使用。
[0260] 從隧菌體選擇直接鑒定的雙環膚，通常在N/C端含有兩個恒定的丙氨酸。為了膚在 血漿穩定性和藥代動力學研究中的追蹤，如所示的再合成膚，如所示的缺失末端氨基酸，且 N端乙酷化。
[0261] 用于在實施例4中藥代動力學研究的膚在lOmM肥1的水中凍干3次，W形成鹽酸鹽 的化合物。溶液Wlmg/mL在50mM胎pes pH 7.0、5%丙Ξ醇、1.9%DMS0,對于兩種化合物 (Ac-(06-550)Aze3 HA巧5 Sar3-(D-Arg2))和（06-259-02)-Sar3-(D-A巧2))W5mg/kg通過 靜脈推注給藥至Spraguely Dawely大鼠。在所示時間點，采集連續血液樣本（~0.2mL)至 抓TA管，并且通過離屯、分離血漿，并且在-20C冷凍用于分析。采用標準的生物分析技術，然 后使用Waters，Xevo TQS LC-MS分析血漿樣本并且對母體剩余化合物定量。使用來自 Summit Research Services的軟件包PK Solutions 2.0確定PK參數。
[0262] 用于實施例5和加開究的膚獲得自純的(>95 % )饋分，所述饋分收集自存在0.5 %乙 酸的反相純化運行，其在凍干后，得到膚的乙酸鹽。
[026；3] 酶試驗
[0264] 在lOmM Tris HCl，150mM NaCl，10mM MgCl2，lmM CaCb和Img/mL BSA(均來自 Sigma英國）pH7.4中，在25°C下，在固體黑色96孔板或384孔板上進行功能性酶試驗。簡言 之，26.5pM人血漿激膚釋放酶(購自Stratech，英國）或13.25pM大鼠血漿激膚釋放酶(在室 內表達和純化），在不存在或存在濃度遞增的測試膚下解育15分鐘，而后添加產生巧光的底 物Z-曲eArg-AMC化nzo Lifesciences英國）至在4%DMS0中的最終試驗濃度100μΜ。使用 I^eras化r FS(BMG Labtech)，在360nm激發和460nm發射下，測量AMC釋放。在MARS數據分析 軟件中（BMG labtech)計算反應線性相的速率(通常5至45分鐘）。然后在P;rism(GraphPad) 中用該速率計算ICso和Κι。四參數抑制非線性回歸方程用來計算ICso。單一位點擬合(One site-fit化i方程用于計算Ki，對于ISOiiM人酶的底物，和200μΜ的大鼠直系同源物的底物，將 Κι限制至Km。所有Ki/ICso值是至少兩個(并且對于Κι值低于InM的膚至少；個)獨立實驗的平 均值。對于兔激膚釋放酶，Κ50μΜ Km的33ιχΜ的底物，使用7至14pM的酶。
[0265] 膚作為TFA鹽W其粉末形式溶解，存儲溶液通常在水中制備。離屯、并過濾（20WI1注 射器過濾器)所有的溶液，而后在280nm測量吸光度。根據膚和TMB的化p/Tyr含量計算消光 系數(TMB核屯、，當包含在膚中時，具有~300M^cnfi的消光系數）。
[026引血漿穩定性譜
[0267] 方法#1:
[0268] 開發了一種快速的血漿穩定性譜試驗，其應用母體質量的質譜檢測(MALDI-T0F， Voyager DE,Applied Biosystems)，直至母體膚的質量再也觀察不到時。特別地，在35%大 鼠或人血漿(血清實驗室，使用巧樣酸作為抗凝劑)存在時、在37 °C下解育200ιχΜ膚，其中補 充了 1X PBS(來自1 Οχ PBS存儲液，Sigma)。在不同的時間點（即，t = 0、3、24小時，而后是每 天，直至第10天），將化L樣本加入到1祉L 1:1的乙臘:此0混合物中30mM碳酸氨錠中。在-80 °C樣本冷凍直至分析的時候。對于質譜分析，確定該膚的大約的檢測窗口，將給定時間點的 乙臘:出0稀釋的樣本在MALDI板上直接點樣(0.7化）。基質(α-氯基肉桂酸，Sigma,制備成含 有0.1 氣乙酸的1:1乙臘:水中的飽和溶液)蓋在樣本（1化)上。可在相似的激光強度設 定下，在MALDI TOF上，隨后確定時間，直到不再檢測到母體膚。應當指出，運是一個定性試 驗，用于檢測血漿穩定性的相對變化。
[02~]方法甘2:
[0270]為了更快地獲得穩定性的數據，還在95%血漿中評估了膚。在此，省去PBS，將1- 5mM膚存儲液(DMS0中）直接稀釋于血漿（即，2.化L存儲液至47.5化血漿中），指定最終濃度 為50μΜ。在適當的時間點取化L樣本，冷凍于-80°C。為了分析，將樣本解凍，與25化的3:3:1 乙臘：甲醇:水混合，在Uk離屯、5分鐘。吸取扣L含膚的上清，并與乙臘:此0的1:1混合液中的 30mM碳酸氨錠混合。然后將化L該混合物點樣在MALDI板上，如上所述進行分析。如上所述， 應當指出，運是一個用于檢測血漿穩定性的相對變化的定性測量。 腳1] 方法#3:
[0272] 為了定量獲得血漿穩定性，膚存儲液(DMS0中ImM)運送到Biofocus，英國，其進行 該分析。將膚用水稀釋到100μΜ，:20在血漿中稀釋(5ιχΜ最終濃度，血漿為95% )，適時地 取樣，如上述沉淀，使用Waters Xevo TQ-MS通過LC-MS定量。
[0273] 實施例1:鑒定具有有利的同系物選擇性和物種交叉反應性的結合激膚釋放酶的 雙環膚
[0274] (a)鑒定新的、有效的、人和大鼠交叉反應的前導序列
[0275] 對于任意給定的治療性雙環膚，其藥效學和藥代動力學特性需要在臨床前動物物 種中評估。常見的臨床前的物種包括:大鼠、小鼠、兔、狗、小型豬和食蟹雜猴。
[0276] -般地，由于雙環膚的高選擇性(在某種程度上得益于其與祀標蛋白大的接觸面 積），對人祀標蛋白的高親和性雙環膚可能不與衍生自給定的臨床前物種的相同祀標蛋白 交叉反應，使得臨床前難W評估該前導。一個示例包括ΡΚ15(如W0 2009/098450中公開的）， 其是有效的雙環膚(6x6環大小），具有對人激膚釋放酶~1.化Μ的Κι。對大鼠激膚釋放酶的 效能顯著地降低，在~500ηΜ的Ki，使得該前導不適合用于臨床前評估。
[0277] 為了鑒定具有對人激膚釋放酶高效能的5巧和6x6前導雙環膚，同時對大鼠激膚釋 放酶保留相當的效能，進行了隧菌體選擇，其中在每次選擇循環期間，大鼠和人激膚釋放酶 被交替作為誘巧。通過在選擇循環期間調整誘巧的濃度，可W鑒定出不同的交叉反應性前 導序列。W結合人激膚釋放酶篩選每次選擇輸出的樣本，并隨后測序。
[0278] 特別地，在祀標濃度范圍3至ΙΟΟηΜ,Κ人激膚釋放酶進行前兩次選擇循環，隨后W 30ηΜ的祀標濃度，使用大鼠激膚釋放酶進行兩次選擇循環。
[0279] 在同質篩選試驗中，對于激膚釋放酶結合的個體隧菌體克隆的篩選顯示，若干獨 特的序列相對于背景信號增加高達50倍。運些序列作為合成膚被制備，并評估其對人、大 鼠、和兔激膚釋放酶的抑制(表1)。
[0280] 表1:新的、交叉反應的雙環前導的總結
[0281]
[0282] 恒定的半脫氨酸W灰色表示，且每個前導的保守殘基W下劃線表示。
[0283] 一些前導在大鼠和人激膚釋放酶間顯示良好的交叉反應性:06-254、06-255、06- 258、和06-261(表1)。通過對每個前導家族評估序列輸出，可鑒定出半保守的殘基，并且W 下劃線表示(表1)。
[0284] 06-254和06-255分享幾乎一致的第一環，但是其第二環不同。06-258是唯一的交 叉反應性前導序列，其被鑒定在環1和環2中均含有5個氨基酸(5巧）。
[0285] (b)大鼠-人激膚釋放酶交叉反應的雙環膚序列的親和性成熟。
[0286] 所選擇的雙環膚候選物(表1)被選擇用于進行親和性成熟。從初始選擇輸出推測 一致性殘基。根據在表2中的信息，對于親和性成熟，呈現在一致性區域W外的殘基進行隨 機化。
[0287] 表2:每個結合激膚釋放酶的雙環膚前導的親和性成熟文庫
[028引
[0289] 序列ID編號：06-254母體（SEQ ID N0:23)、文庫（SEQ ID N0:64);06-256母體（SEQ ID N0:49)、文庫（沈Q ID N0:65);06-258母體（SEQ ID N0:52)，文庫（SEQ ID N0:66);06- 259母體（569 10^:10)，文庫（569 10^:67);06-261母體（569 10^:54)，文庫（569 10 NO:99)。
[0290] 較保守的結合基序W外的殘基被隨機化（?'）。在06-261的情況中，其06-34-18- 樣FPFR基序(SEQ ID NO: 100)被隨機化，然而周圍的殘基被固定。
[0291 ] W兩個示例06-254和06-259顯示親和性成熟的文庫的序列輸出：
[0巧。06-254序列輸出:
[0293] 表3顯示通過篩選試驗鑒定的最有效的06-254變體。
[0294] 表3:06-254親和性成熟文庫的序列輸出
[0295]
[0296]
[0297] S:B指信號：背景。通過同質篩選試驗鑒定有效的結合物，并且與其母體序列（06- 254)和6x6激膚釋放酶結合物PK15 (W0 2009/098450)相比較。
[0298] 選擇最有效的候選物(06-254-01、06-254-02和06-254-03)用于膚合成，并且評估 對于大鼠和人激膚釋放酶的抑制。
[0巧9] 06-259序列輸出
[0300] 表4顯示通過篩選試驗鑒定的最有效的06-259變體。
[0301] 表4:06-259親和性成熟文庫的序列輸出
[0302]
[0303] S:B指信號：背景。通過同質篩選試驗鑒定有效的結合物，并且與其母體序列（06- 259)和6x6激膚釋放酶結合物PK15 (W0 2009/098450)相比較。
[0304] 選擇最有效的候選物(06-259-01、06-259-02、06-259-03 和 06-259-04)用于膚合 成，W及進行對大鼠和人激膚釋放酶的親和性測量。
[0305] 合成膚在體外的效能和交叉反應性總結在表5中。
[0306] 表5:對人、大鼠和兔激膚釋放酶的抑制常數化1)的總結
[0307]
[0308] 對人/大鼠激膚釋放酶的解離率分別低于10/20nM的雙環膚前導W粗體表示。
[0309] 總之，存在一些候選物顯示高效能且在大鼠和人激膚釋放酶間良好的交叉反應 性，例如 06-254-01'06-254-02、06-254-03、06-255、06-258、06-259-01、06-259-02、06- 259-03、06-259-04和06-261(粗體，參見表 5)。
[0310] 實施例2:結合激膚釋放酶的雙環膚的血漿穩定性篩選掲示有前景的前導候選物
[0311] 在實施例1中，鑒定了一些新的雙環前導序列，其具有高的人和大鼠效能。選擇每 個家族最有效的成員用于大鼠和人血漿穩定性的比較。它們是06-254-02、06-255、06-259- 02和06-261。使用方法#1的初始篩選表明06-255和06-259-02相比余下的雙環膚是更穩定 的，正如運兩個膚的較長的檢測窗口所判斷的（長達10天，數據未顯示）。余下的膚在2-3天 后不能再檢測到，顯示如未經修飾的序列06-34-18相似的低穩定性。06-255和06-259-02均 具有差的溶解性譜，并且因此W增溶C端延伸重合成(Sar3-(D-Arg)2(SEQ ID N0:98))。在 此，肌氨酸3(Sar3)充當分子間隔物，然而由于D-精氨酸在生理抑時的強離子、水絡合性質， 其給予分子更高的水溶性。
[0312] 如表6中表明的，增溶延伸沒有顯著阻礙酶抑制常數。
[0313] 表6:具有增溶延伸的對人、大鼠和兔激膚釋放酶的抑制常數化1)的總結
[0314]
[0315] 在方法#2中描述的條件下，在人和大鼠血漿中對膚進行試驗。對比06-34-18評估 穩定性，06-%-18具有在大鼠血漿中2.3小時和在人血漿中2小時的定量*1/2(胖0 2013/ 050616)。圖1和2證實了雙環膚前導06-259-02具有特別有利的血漿穩定性譜，其中相比06- 255和06-34-18,雙環膚前導06-259-02對人和大鼠血漿顯著的更穩定。
[0316] 實施例3:不同的雙環膚前導間的接枝(Grafting)膚環生成具有有利的特性的新 的嵌合結構
[0317] 先前公開的06-34-18序列（W0 2013/050616，序列：CSWPAR化HQDLC(SEQ ID NO: 86) )的第一環與文中鑒定的06-261膚(序列：CNNFPFRCVYYPDIC(沈Q ID N0:54))共享相似 的FPFR基序（SEQ ID NO: 100,下劃線）。然而06-34-18被描述為含有兩個蛋白酶解識別位 點，使得膚對血漿蛋白酶不穩定，并因此不適合作為激膚釋放酶抑制治療。運些位點包含 06-34-18的殘基A巧5和His7(CSWPASCL|iQDLC(沈Q ID NO: 86):下劃線和粗體）。在本公開 中的06-261序列(實施例1)，等價于環2中組氨酸的蛋白酶解識別位點是不存在的。
[031引 由于在06-261的第二環(序列:VYYPDI(SEQ ID N0:87))中化s7的缺失，本發明的 發明人W06-261的第二環取代了 06-34-18蛋白酶解不穩定的、含有組氨酸的第二環，希望 產出在環2中具有增強蛋白酶解穩定性的、完全有效的嵌合膚。特別地，該序列包含06-34- 18 的第一環(序列：SFPYR(SEQ ID N0:88))，和 06-261 的第二環（序列:VYYPDI(SEQ ID NO: 87) )，產出嵌合體全序列CSFPYRCVYYPDIC(SEQ ID NO : 55 )(或者WPAR等價物，即 CSWPARCVYYPDIC(沈Q ID N0:89))。該嵌合膚命名為06-550,并且在環1中具有5個殘基，且 在環2中具有6個殘基。
[0319] 先前已經公開了（WO 2013/050616)在06-34-18中Ar巧誘導的蛋白酶解不穩定性 可W通過Ν-α甲基精氨酸(醒e-A巧)或高精氨酸化Arg)取代Ar巧而去除或降低。另外，在位 置3可W同時引入心氮雜環下燒簇酸(Aze)的增強親和性置換，取代原始脯氨酸3。
[0320] 由于嵌合雙環膚06-550保留了06-34-18的第一環，在Ar巧/Pro3實施相同的修飾 至HA巧5/Aze3，并且該膚命名為06-550Aze3HA巧5。
[0321] 由于在序列中不存在溶解性增強組氨酸7,然而與06-34-18相比，06-550(或06- 550Aze3HArg5)顯示顯著降低的水溶性。為增強運些分子的水溶性，合成含有C端延伸的衍 生物，所述C端延伸包含肌氨酸3-間隔物其后具有兩個D-精氨酸。包含D-精氨酸導致了運些 膚的更有利的水溶性。
[0322] 運些膚的激膚釋放酶抑制常數總結在表7中。
[0323] 表7:06-550膚對人、大鼠和兔激膚釋放酶的抑制常數
[0324]
[0325] 從數據明顯看出：Aze3-HAr巧修飾是良好耐受的，因為對人和大鼠親和性均是高 的。N-甲基修飾是較不合適的。同樣地，San-化-A巧2)(SEQ ID NO: 98)增溶延伸是良好耐受 的，與缺乏該延伸的膚相比，效能保持不變。
[。扣引 06-550衍生物的相對血漿穩定性譜
[0327] 根據方法#2,評估雙環膚"Ac-(06-550)-Sar3-化Arg2)Aze3HArg5"的穩定性（表7) 在人和大鼠血漿中的相對穩定性(圖3)，并與不穩定的06-34-18比較(圖1和2)。
[0328] 在來自兩物種的血漿中，膚顯示高穩定性，因為觀察到很少的降解產物。相比之 下，在同樣的時間進程，不穩定的06-34-18母體質量很大程度上消失了（數據在實施例2中 顯示）。因此，衍生自獨立的母體序列（06-261和06-34-18)的組合環的概念產出新的、嵌合 的、有效的且蛋白酶解穩定的分子。
[0329] 實施例4:選擇的抑制激膚釋放酶的雙環膚的體內藥代動力學行為
[0330] 選擇膚Ac-(06-550)-Sar3-(D-Arg)2Aze3HArg5(其含有穩定的和親和性增強性的 修飾Aze3和HA巧5, W及增溶C端延伸Sar3-(D-Arg)2)(沈Q ID N0:98WPAc-(06-259-02)- Sar3-(D-Arg)2在大鼠中進行藥代動力學評估。膚WImg/mL在緩沖溶液中，W5mg/kg靜脈注 射至Sprague Dawl巧大鼠，并且在注射后若干時間點采樣血液和分析膚濃度。
[0331] 兩個膚顯示17(06-550)至7ml/min/kg(06-259-02)的清除(表8,圖4)，其接近公開 的在大鼠中的腎濾過率(~8-9mL/min/kg)[Jobin J,Bonjour 肝，（1985)Am J 曲ysiol.; 248(5Pt 2):F734-8]。
[0332] 運突出了 Ac-(06-550)-Sar3-(D-Arg)2Aze3HAr巧增強的蛋白酶解穩定性，其含有 兩種穩定修飾Aze3和HArg5，并且含有在環二中固有的蛋白酶解穩定序列。
[033；3] Ac-(06-259-02)-Sar3-(D-Arg)2的情況中，天然的序列在大鼠中是足夠蛋白酶解 穩定的，從而其清除主要通過腎排泄驅動。
[0334] 表8:在大鼠中 Ac-(06-550)-Sar3-(D-Arg)2Aze3HAr 巧和 Ac-(06-259-02)-Sar3- (D-Arg)2的藥代動力學參數
[0335]
[0336] 實施例5:玻璃體內注射選擇的抑制激膚釋放酶的雙環膚后體內藥代動力學分析
[0337] 在該分析中，對比膚Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ilC此NH)6(在本 研究中指雙環2,并且其在PCT/EP2014/057440的表26b和圖22中公開），評估膚Ac-(06- 550)-Sar3-(D-Arg)2Aze3 HA巧5(在本研究中指雙環1，且其含有穩定的和親和性增強修飾 Aze3和HArg5，W及增溶C端延伸Sar3-(D-Arg)2(SEQ ID N0:98);參見文中實施例3和4)。麻 醉新西蘭白兔(2-3kg)，并且根據表9中描述的方案通過玻璃體內注射(lOOyg/眼)施用兩種 膚。
[0338] 表9:用于玻璃體內注射的施用方法
[0339]
[0340]
[0；341] 〇S =左眼；〇D =右眼；
[0；342] Min =分鐘;h =小時。
[0%3]載體=lOmM醋酸鋼緩沖溶液，P冊.0，在含2.5%丙Ξ醇的水中。
[0344] 在合適的時間之后，兔被安樂死，并且取玻璃狀液、房水、視網膜和血漿樣本。通過 LC-MS分析樣本W確定膚的濃度。該研究的結果在表5中顯示，其中可W觀察到兩種膚均從 玻璃狀液中被緩慢地清除，具有20-30小時的清除半衰期。運相比例如抗生素環丙沙星(報 告的在正常的兔玻璃體中半衰期2.2小時;Pearson等人1993，Retina 13:3