2-C0-)、硫代酷胺鍵（例如-CS-NH-)、氮雜膚鍵（azapeptide bond)、（例如-C0-NH-NR-)、反式締控鍵（例如-R肥= C-)、翻轉鍵(retro-inverso bond)(例 如-NH-C0-) W及尿素替代物鍵(例如-NH-C0-NHR-)。
[0165] 在一個實施方案中，所述經修飾的衍生物包含任何丙氨酸氨基酸殘基的去除。該 實施方案提供了去除可能的蛋白酶解的攻擊位點的優勢。
[0166] 在一個實施方案中，所述經修飾的衍生物包含膚骨架長度修飾。在另一實施方案 中，膚骨架長度修飾包含一個或更多個護氨基酸殘基（例如-NH-CR-C出-C0或-NH-C出- CHR-C0-)的使用。
[0167] 在一個實施方案中，所述經修飾的衍生物包含一個或更多個氨基酸殘基在α碳上 的置換。該實施方案提供了限制骨架構象的優勢。在另一實施方案中，所述經修飾的衍生物 包含W2-氨基異下酸(還稱為α-氨基異下酸(ΑΙΒ)、α-甲基丙氨酸或2-甲基丙氨酸）取代一 個或更多個氨基酸殘基。
[0168] 應注意的是，上述修飾中的每一個可W用于有意改善膚對祀標的效能。基于修飾 的進一步效能改善可W通過W下機制實現：
[0169] -引入開拓疏水作用并產生較低的解離率(off rate)的疏水半簇，從而實現較高 的親和性；
[0170] -引入開拓大范圍離子相互作用的帶電基團，產生較快的結合率(on rate)和較高 的親和性（參見例如Schreiber等人Rapid,elec1:;ros1:atically assisted association of proteins (1996) ,Na1:ure Struct .Biol. 3,427-31); W及
[0171] -引入對膚另外的限制，即通過例如正確地限制氨基酸側鏈，使得與祀標結合時賭 的損失最小，限制骨架的扭轉角，使得與祀標結合時賭的損失最小，W及W同一理由在分子 中引入另外的環化。
[0172] (綜述參見Gentilucci等人Qirr.Pharmaceutical Design, (2010), 16,3185-203, W及化stor等人，Οι??.MedicinalQiem(2009), 16,4399-418)。
[0173] 結合活性
[0174] 在本文中，特異性指配體結合或與其同類(cognate)祀標相互作用、而排除與所述 祀標相似的實體的能力。例如，特異性可W指配體抑制人酶的相互作用、但不抑制來自不同 物種的同源酶的相互作用的能力。使用文中描述的方法，可W調控(即增加或降低)特異性， 從而使配體與預期祀標的同系物或旁系物的相互作用能力更強或更弱。特異性與活性、親 和性或親合力(avidity)并不是同義詞，配體對其祀標的作用的效能（如，例如結合親和性 或抑制水平)并不一定與其特異性相關。
[0175] 如文中使用的結合活性，例如文中所描述的，指來自結合試驗的定量結合測量。因 此，結合活性指在給定祀標濃度下結合的膚配體的量。
[0176] 多特異性是結合兩個或更多個祀標的能力。典型地由于其構象特征，結合膚能結 合單一祀標，如抗體情況中的表位。但是可開發能結合兩個或更多祀標的膚;例如，如W上 提到的本領域中已知的雙特異性抗體。本發明中，膚配體能結合兩個或更多祀標，因此是多 特異性的。合適地，其結合兩個祀標，是雙特異性的。結合可W是獨立的，運意味著在膚上對 祀標的結合位點不被一個或其它祀標所結合而結構性地阻礙。在運樣的情況中，兩個祀標 可獨立地結合。更一般的是，可預期一個祀標的結合將至少部分地阻礙另一個的結合。
[0177] 雙特異性配體和具有包括兩個相關祀標特異性的配體之間存在根本的差異。在第 一種情況中，配體分別對兩個祀標有特異性，W特異的方式與每個祀標相互作用。例如，配 體中的第一環可W結合第一祀標，第二環結合第二祀標。在第二種情況中，因為其不能區分 兩個祀標，所W配體是非特異性的，例如其通過與兩個祀標共同的祀標表位相互作用。
[0178] 在本發明的上下文中，例如，對祀標和直系同源物具有活性的配體有可能是雙特 異性配體。但是，在一個實施方案中，配體不是雙特異性的，但是其特異性的精度較低，從而 其結合祀標和一個或多個直系同源物。一般地，沒有針對祀標和其直系同源物選擇的配體 不太可能是雙特異性的，因為對雙特異性缺乏選擇壓力。雙環膚中的環長度在提供定制結 合表面中是決定性的，從而可W獲得良好的祀標和直系同源物的交叉反應性，然而保持對 不相關的同系物的高選擇性。
[0179] 如果配體確實是雙特異性的，在一個實施方案中，配體祀標特異性的至少一種將 是所選配體中共同的，且可通過文中公開的方法調控該特異性水平。第二或進一步的特異 性沒有必要是共享的，也不需要是文中所示過程的對象。
[0180] 祀標是膚配體結合、或與膚配體相互作用的分子或其部分。盡管結合被看作大多 數活性類型的首要條件，其自身就是一種活性，還可w設想其它活性。因而，本發明不需要 測量直接或間接結合。
[0181] 分子支架是能夠在多個點上連接膚W便給予膚一種或多種結構特性的任何分子。 優選的，分子支架包含至少Ξ個膚附著點，被稱為支架反應基團。運些基團能夠與膚上的半 脫氨酸殘基(Ci、Cii和Ciii)反應，W形成共價鍵。其不僅形成二硫鍵，二硫鍵經受分子的還原 切割伴隨解體，還形成穩定的、共價的硫酸鍵。優選的分子支架的結構如下所述。
[0182] 分子支架
[0183] 分子支架描述于，例如W0 2009/098450中，W及描述于其中引用的文獻，特別是W0 2004/077062和W0 2006/078161 中。
[0184] 如先前的文獻中注意到的，分子支架可W是小分子，如小的有機分子。
[0185] 在一個實施方案中，分子支架可W是(或者可W是基于)天然單體，如核巧、糖或醬 體。例如，分子支架可W包含運樣的實體的短聚合物，如二聚物或=聚物。
[0186] 在一個實施方案中，分子支架是毒性已知的化合物，例如，低毒性的化合物。合適 的化合物的示例包括膽固醇、核巧酸、醬體或現有的藥物，如徑基安定(tamazepam)。
[0187] 在一個實施方案中，分子支架可W是大分子。在一個實施方案中，分子支架是由氨 基酸、核巧酸或碳水化合物組成的大分子。
[0188] 在一個實施方案中，分子支架包含能夠與多膚官能團反應而形成共價鍵的反應基 團。
[0189] 分子支架可W包括化學基團如胺、琉基、醇、酬、醒、臘、簇酸、醋、締控、烘控、疊氮 化物、酸酢、班巧酷亞胺、馬來酷亞胺、烷基面和酷基面。
[0190] 在一個實施方案中，分子支架可W包含、或可W由Ξ(漠甲基)苯組成，特別是1，3， 5-S (漠甲基)苯（叮818")或其衍生物。
[0191] 在一個實施方案中，分子支架是2,4,6-Ξ(漠甲基)Ξ甲基苯。該分子與1，3,5-Ξ (漠甲基)苯類似，但是含有額外的Ξ個附著于苯環的甲基。其優點是額外的甲基可形成與 多膚進一步的接觸，因而增加了額外的結構性限制。
[0192] 本發明的分子支架含有化學基團，該化學基團允許本發明編碼文庫的多膚的官能 團與分子支架形成共價鍵。所述化學基團選自大范圍的官能基，包括胺、琉基、醇、酬、醒、 臘、簇酸、醋、締控、烘控、酸酢、班巧酷亞胺、馬來酷亞胺、疊氮化物、烷基面和酷基面。
[0193] 可用于分子支架上與半脫氨酸的琉基反應的支架反應基團是烷基面（或也稱為面 代控或面代燒）。
[0194] 實例包括漠甲基苯（由ΤΒΜΒ示例的支架反應基團）或艦乙酷胺。用于選擇性地將化 合物偶聯至蛋白中半脫氨酸的其它支架反應基團是馬來酷亞胺。可用作本發明中分子支架 的馬來酷亞胺的實例包括:Ξ-(2-馬來酷亞胺乙基)胺、Ξ-(2-馬來酷亞胺乙基)苯、Ξ-(馬 來酷亞胺基)苯。砸代半脫氨酸也是天然氨基酸，其具有與半脫氨酸相似的反應性，可用于 相同的反應。因而，除非上下文特別指明，無論在何處提及半脫氨酸，典型地可認為其可取 代砸代半脫氨酸。
[01Μ]效應物和官能團
[0196] 可將效應物和/或官能團附著至，例如，多膚的Ν或C端，或附著至分子支架。
[0197] 合適的效應物基團包括抗體和其部分或片段。例如，效應物基團可包括抗體輕鏈 恒定區（化）、抗體CHI重鏈結構域、抗體CH2重鏈結構域、抗體CH3重鏈結構域、或其任意組 合，另外還包括一個或多個恒定區結構域。效應物基團還可W包括抗體較鏈區(運種區域通 常存在于IgG分子的CH1和C肥結構域之間）。
[0198] 在本發明該方面的其它實施方案中，根據本發明的效應物基團是IgG分子的Fc區 域。有利地，根據本發明的膚配體效應物基團包括或由膚配體Fc融合體(fusion)組成，所述 膚配體Fc融合體具有1天或更長、2天或更長、3天或更長、4天或更長、5天或更長、6天或更 長、或7天或更長的巧半衰期。最有利地，根據本發明的膚配體包含或由具有1天或更長的巧 半衰期的膚配體Fc融合體組成。
[0199] 官能團通常包括結合基團、藥物、用于其它實體附著的反應基團、輔助大環膚攝入 細胞的官能團等等。
[0200] 膚穿透至細胞中的能力將允許膚針對細胞內的祀標起效。可被具有穿透細胞能力 的膚接近的祀標包括轉錄因子、細胞內信號傳導分子如酪氨酸激酶、W及參與調亡通路的 分子。能夠穿透細胞的官能團包括被添加到膚或分子支架的膚或化學基團。如那些衍生自 如VP22、HIV-Tat、果蛹（觸角足）同源盒蛋白的膚，例如，在化en和化;r;rison,Biochemical Society Transactions(2007)35卷，第四部分，p821;Gupta等人在Advanced Drug Discovery Reviews(2004)57卷9637中描述的。已經表明在通過漿膜移位中有效的短膚示 例包括來自果蛹觸角足蛋白的16個氨基酸的穿透膚化erossi等人（1994) J Biol.化em. 269 卷pl0444)，18個氨基酸的"模型兩親性膚"（Oehlke等人（1998)Biochim Biophys Acts 1414卷pl27)和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的區域。非膚的方法包括使用容易附著于生物分 子的小分子模擬物或SM0C(0kuyama等人（2007)化ture Methods 4卷pl53)。向分子添加脈 基的其它化學策略也能增強細胞穿透化Ison-Scwab等人（2007)J Biol Chem 282卷 P13585)。可W將小分子量分子如醬體添加到分子支架W增強細胞的攝入。
[0201] 可附著至膚配體的一類官能團包括抗體和其結合片段，如化b、Fv或單一結構域片 段。特別是，可W使用結合能夠增加膚配體體內半衰期的蛋白的抗體。
[0202] 還可W引入RGD膚，所述RGD膚結合存在于許多細胞上的整合素。
[0203] 在一個實施方案中，根據本發明的膚配體效應物基團具有選自如下的巧半衰期： 12小時或更長、24小時或更長、2天或更長、3天或更長、4天或更長、5天或更長、6天或更長、7 天或更長、8天或更長、9天或更長、10天或更長、11天或更長、12天或更長、13天或更長、14天 或更長、15天或更長或20天或更長。有利地，根據本發明的膚配體效應物基團或組合物具有 12至60小時范圍內的巧半衰期。在另一實施方案中，其具有1天或更長的巧半衰期。在另一 實施方案中，其在12至26小時范圍內。
[0204] 官能團包括藥物，如用于癌癥治療的細胞毒性劑。運些包括燒化劑，如順銷和卡 銷、W及奧沙利銷、氮芥、環憐酷胺、苯下酸氮芥、異環憐酷胺;抗代謝物，包括嚷嶺類似物硫 挫嚷嶺和琉嚷嶺或喀晚類似物;植物生物堿和祗，包括長春花生物堿，如長春新堿、長春堿、 長春瑞濱和長春地辛；足葉草毒素及其衍生物依托泊巧和替尼泊巧；紫杉燒，包括紫杉醇 (paclitaxel)，最初被稱為紫杉醇(Taxol);拓撲異構酶抑制劑，包括喜樹堿:伊立替康和拓 撲替康，W及II型抑制劑，包括安叮晚、依托泊巧、憐酸依托泊巧、和替尼泊巧。其它制劑可 包括抗腫瘤抗生素，其包括免疫抑制劑更生霉素(其用于腎移植）、多柔比星、表柔比星、博 來霉素等。
[0205]可能的效應物基團還包括酶，例如如用于酶/前藥治療中的簇膚酶G2,其中膚配體 取代了 ADEPT中的抗體。
[0206]合成
[0207] 本發明的膚可通過標準技術制備合成，隨后在體外與分子支架反應。當進行時，可 使用標準化學方法。運使得能夠快速大規模地制備可溶性物質，用于進一步的下游實驗或 驗證。該方法可使用傳統的化學方法完成，如在Timmerman等人中公開的（上文）。
[0208] 因而，本發明還設及制備如文中所示選擇的多膚或綴合物，其中制備任選地包括 如下所解釋的其它步驟。在一個實施方案中，運些步驟在化學合成得到的終產物多膚/綴合 物上進行。
[0209] 任選地，制備綴合物或復合物時，感興趣的多膚中的氨基酸殘基可被置換。
[0210] 例如，膚還可從被延伸W引入另一個環，從而引入多特異性。
[0211] 為了延伸膚，可W使用標準固相或溶液相化學方法，使用正交保護的賴氨酸(和類 似物），在其N端或C端或環內簡單地化學延伸。標準蛋白化學方法可用于導入可激活的N或C 端。可替換地，可通過如（Dawson等人 1994. Synthesis of Proteins by 化tive Qiemical Ligation.Science 266:776-779)中描述的片段縮合或天然化學連接、或通過酶進行添加， 例如使用如（化ang等人Proc化tlAcadSciUSA.1994Dec20;91(26):12544-8或者在 Hikari等人Bioorganic&Medicinal 化emistiT Letters 18卷，22期，2008年 11 月 15 日， 6000-6003頁）中描述的副連接酶(subtiligase)。
[0212] 可替換地，可通過二硫鍵的進一步綴合使膚延伸或修飾。其具有另外的優點，即一 旦在細胞的還原環境中時，允許第一和第二膚彼此分離。在運樣的情況中，可在第一膚的化 學合成期間添加分子支架(如TBMB)，從而與Ξ個半脫氨酸基團反應;然后可將另外的半脫 氨酸附加于第一膚的N端，從而該半脫氨酸僅與第二膚的游離半脫氨酸反應。
[0213] 相似的技術可同樣地應用于兩個雙環和雙特異性大環的合成/偶聯，可能產生一 個四特異性分子。
[0214] 此外，可W使用適當的化學方法，在N端或C端偶聯或通過側鏈W相同的方式完成 其它官能團或效應物基團的添加。在一個實施方案中，W運樣的方式進行偶聯，其不阻斷任 一實體的活性。
[0215] 藥物組合物
[0216] 根據本發明的其它方面，提供了一種藥物組合物，其包含如文中定義的膚配體，所 述膚配體與一種或更多種藥學可接受的賦形劑組合。
[0217] -般地，本發明的膚配體將W純化形式與藥理學上合適的賦形劑或載體一起使 用。典型地，運些賦形劑或載體包括水溶液或醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽和/或緩沖 介質。腸胃外載體包括氯化鋼溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鋼和乳酸林格氏液。如果 需要保持懸浮液中的多膚復合物，可W從增稠劑如簇甲基纖維素、聚乙締化咯燒酬、明膠和 藻酸鹽中選擇合適的生理學上可接受的佐劑。
[0218] 靜脈內載體包括液體和營養補充劑和電解質補充劑，如基于林格氏右旋糖的那 些。也可存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、馨合劑和惰性氣體(Ma C k (1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16片反）。
[0219] 本發明的膚配體可作為獨立施用的組合物或與其它試劑聯合施用。其可W包括抗 體、抗體片段和各種免疫治療藥物，例如環抱菌素、甲氨蝶嶺、阿霉素或順銷和免疫毒素。藥 物組合物可包括各種細胞毒性或其它試劑與本發明的蛋白配體相組合的"混合物"，或甚至 具有不同特異性的根據本發明的所選多膚的組合，如使用不同祀標配體所選的多膚，無論 是否在施用之前將其合并到一起。
[0220] 根據本發明的藥物組合物的施用途徑可W是任何本領域普通技術人員通常知道 的那些。對于治療，包括但不局限于免疫治療，本發明的膚配體可W根據標準技術施用給任 何患者。可W通過任何合適的模式施用，包括腸胃外、靜脈內、肌肉內、腹膜內、經皮、經肺途 徑、或也適當地，通過直接的導管輸注。施用的劑量和頻率取決于患者的年齡、性別和狀態、 其它藥物的同時施用、禁忌癥和臨床人員需要考慮的其它參數。
[0221] 應理解的是，當本發明的膚配體被制劑成眼科組合物用于眼科疾病的治療時，典 型地，施用的途徑將是直接在眼科疾病的位置，例如通過眼部途徑施用，例如局部、結膜下、 筋膜下（sub-Tenon)、眼內、眼植入等。在一個實施方案中，施用的途徑是通過眼內注射。在 一個可替換的實施方案中，眼科組合物被局部遞送(例如眼外應用）或系統遞送(例如口服 或其它腸胃外途徑，如例如皮下注射），只要是在位于眼或相鄰的眼中的細胞或組織中足夠 量的膚實現了與眼科疾病位點的接觸。在一個可替換的實施方案中，眼科組合物被腸胃外 地遞送。當根據W02007/104541中描述的常見的一般知識和方法解決待治療的眼科疾病時， 精準的施用途徑對技術人員是立即顯而易見的，W0 2007/104541的內容通過參考并入此 處。
[0222] 本發明的膚配體可被凍干用于保存，并在使用前在適當的載體中重配。表明該技 術是有效的，可W使用本領域公知的凍干和重配技術。本領域技術人員將理解凍干和重配 將導致不同程度的活性損失，可能不得不向上調整水平W補償該活性的損失。
[0223] 可施用包含本發明膚配體或其混合物的組合物用于預防性和/或治療性治療。在 特定治療的應用中，實現所選細胞群的至少部分抑制（inhibi tion)、抑制（suppreSSion)、 調控、殺死、或某些其它可測量參數的足夠的量被定義為"治療有效劑量"。需要實施該劑量 的量將取決于疾病的嚴重性和患者自身免疫系統的一般狀態，但是選擇的膚配體通常范圍 從每千克體重0.005至5. Omg，0.05至2. Omg/kg/劑量的劑量更常使用。為了預防的應用，含 有本發明膚配體或其混合物的組合物還可相似或稍低的劑量施用。
[0224] 含有根據本發明膚配體的組合物可用于預防和治療設置，W輔助改變、失活、殺死 或移除哺乳動物中所選的祀標細胞群。另外，文中描述的膚配體可用于離體或體外選擇性 殺死、消除或有效地從異質細胞集合中移除祀標細胞群。來自哺乳動物的血液可在體外和 選擇的膚配體組合，從而殺死或從血液中移除不想要的細胞，再根據標準技術重輸回哺乳 動物。
[0。引治療用途
[0226] 根據本發明的方法選擇的多膚配體可用于體內治療和預防的應用、體外和體內診 斷應用、體外試驗和試劑應用等。具有選定特異性水平的配體在設及檢測非人動物的應用 中是有用的，其中希望有交叉反應，或在診斷應用中是有用的，其中需要仔細控制與同系物 或旁系物的交叉反應。在某些應用中，例如疫苗應用中，可利用激發對預定范圍抗原的免疫 反應的能力定制特定疾病和病原體的疫苗。
[0227] 優選將至少90至95%同質性的基本上純的膚配體施用于哺乳動物，最優選98至 99%或更高同質性的基本上純的膚配體用于藥學應用，特別是當哺乳動物是人時。一旦純 化、部分純化、或純化至希望的同質性，所選的多膚可用于診斷或治療(包括體外的）或開發 和進行試驗步驟、免疫巧光染色等等(Xefkovite和Pernis ,(1979和1981) Immunological Methods,卷I和II,Academic Press,NY)。
[0228] 本發明的膚配體典型地在預防、抑制或治療炎癥狀態、變應性超敏反應、癌癥、細 菌或病毒感染和自體免疫性疾病(其包括