但不局限于I型糖尿病、多發硬化、類風濕性關節 炎、系統性紅斑狼瘡、克羅恩氏病和重癥肌無力）中是有用的。
[0229] 因此，本發明的其它方面，提供了一種如文中定義的膚配體在預防、抑制或治療炎 癥狀態、變應性超敏反應、癌癥、細菌或病毒感染和自體免疫性疾病中的用途。
[0230] 根據本發明的另一個方面，提供了一種用于預防、抑制或治療炎癥狀態、過敏性超 敏反應、癌癥、細菌或病毒感染、眼科疾病和自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向有需 要的患者施用本文所限定的膚配體。
[0231] 在一個實施方案中，本發明的眼科疾病是設及視網膜血管滲透性和/或完整性受 損的疾病。在另一實施方案中，本發明的眼科疾病是設及視網膜微血管破裂而導致灶性出 血的疾病。在另一實施方案中，本發明的眼科疾病是眼后部的疾病，特別是視網膜疾病。在 另一實施方案中，本發明的眼科疾病是眼前部的疾病。在另一實施方案中，本發明的眼科疾 病是與眼的過度血管通透性和/或水腫相關的疾病。
[0232] 合適的"眼科疾病"的示例(包括滲出性和/或炎癥性眼科疾病，設及視網膜血管滲 透性和/或完整性受損的疾病，設及視網膜微血管破裂而導致灶性出血的疾病，眼后部的疾 病，視網膜疾病和眼前部的疾病)包括但不限于:年齡相關性黃斑變性(ARMD)、滲出性黃斑 變性(也被稱為"濕性"或新生血管性年齡相關的黃斑變性(濕性AMD)、黃斑水腫、老年盤狀 黃斑變性、囊樣黃斑水腫、眼險水腫、視網膜水腫、糖尿病性視網膜病變、急性黃斑視神經視 網膜病變、中屯、性漿液性脈絡膜視網膜病變、脈絡膜視網膜病變、脈絡膜血管新生、新生血 管性黃斑病變、新生血管性青光眼、阻塞性動脈和靜脈視網膜病(例如視網膜靜脈阻塞或視 網膜動脈阻塞）、中央視網膜靜脈阻塞、彌散性血管內凝血病、視網膜分支靜脈阻塞、高血壓 性眼底改變、眼部缺血綜合征、視網膜動脈微動脈瘤、Coat病、旁中屯、凹毛細血管擴張、半側 視網胺靜脈阻塞、視乳頭靜脈炎(papillo曲lebitis)、中央視網胺動脈阻塞、視網胺分支動 脈阻塞、頸動脈病（CAD)、霜樣樹枝狀(frosted branch)脈管炎、鑲狀紅細胞性視網膜病和 其它血紅蛋白病、血管樣條紋、外因 （aetiologies)比如疾病（如糖尿病性黃斑水腫）、眼傷 或眼外科手術所導致的黃斑水腫發作;例如損傷、外傷或腫瘤所導致的視網膜缺血或變性、 葡萄膜炎、虹膜炎、視網膜脈管炎、眼內炎、全眼球炎、轉移性眼炎、脈絡膜炎、視網膜色素上 皮炎、結膜炎、睫狀體炎、鞏膜炎、鞏膜外層炎、視神經炎、球后視神經炎、角膜炎、險炎、滲出 性視網膜脫離、角膜潰瘍、結膜潰瘍、慢性錢幣狀角膜炎、泰格森(thygeson)角膜炎、進行性 蠶蝕性角膜潰瘍，由細菌或病毒感染W及眼科手術所引起的眼炎癥性疾病，由眼的物理損 傷引起的眼炎癥性疾病，眼炎癥性疾病引起的癥狀，包括癢、耀斑、水腫和潰瘍、紅斑、紅斑 滲出性多形性紅斑、結節性紅斑、環形紅斑、硬皮病、皮炎、血管神經性水腫、喉頭水腫、聲口 水腫、聲口下喉炎、支氣管炎、鼻炎、咽炎、鼻竇炎、喉炎或中耳炎。
[0233] 本文設及的"眼后部的疾病"包括影響視網膜、黃斑、眼后部區域中的中央凹 (fovea)中的疾病。合適的"眼后部的疾病"的示例包括但不限于:黃斑水腫，如臨床黃斑水 腫或各種病因（如糖尿病）引起的血管造影囊樣黃斑水腫、滲出性黃斑變性和視網膜的激光 治療引起的黃斑水腫、年齡相關性黃斑變性、早產兒視網膜病變(也稱為晶狀體后纖維組織 增生癥）、視網膜缺血和脈絡膜血管新生、視網膜病(糖尿病性視網膜病變、糖尿病性視網膜 水腫，視網膜脫離、由于視網膜下血管新生導致的老年性黃斑變性、近視性視網膜病變）；炎 癥性疾病；與腫瘤(如視網膜母細胞瘤或假神經膠質瘤)相關的葡萄膜炎;玻璃體切割術后 的血管新生;血管疾病(視網膜缺血、脈絡膜血管功能不全、脈絡膜血栓、頸動脈缺血引起的 視網膜病變）；和視神經的血管新生。
[0234] 本文設及的"眼前部的疾病"指的是主要影響眼的前部組織（如角膜、虹膜、睫狀 體、結膜等）的疾病。合適的"眼前部的疾病"的示例包括但不限于：角膜血管新生（因炎癥、 移植、虹膜發育不全、伴有滲出性或炎癥性成分的角膜疾病或渾濁、由于穿透眼睛或挫傷性 眼損傷導致的血管新生;慢性葡萄膜炎;前葡萄膜炎;外科手術(如LASIK、LASEK、屈光手術、 I化植入術)導致的炎癥性疾病;作為白內障手術并發癥的不可逆角膜水腫；（物理的、化學 的、藥理的等)刺激(insult)或外傷導致的水腫;炎癥;結膜炎(如，持續性過敏、巨乳頭性季 節性間歇性過敏、常年性過敏、細菌、病毒或衣原體感染引起的中毒性結膜炎）；（春季性、特 應性、干燥性）角結膜炎;虹膜睫狀體炎;虹膜炎;鞏膜炎;鞏膜外層炎;感染性角膜炎;淺層 點狀角膜炎；圓錐角膜;后發多形性營養不良；Fuch營養不良（角膜和內皮）；無晶狀體的和 人工晶狀體的大泡性角膜病;角膜水腫;鞏膜疾病;眼部瘤痕性類天瘤瘡;睫狀體扁平部炎； 波斯納睫狀體綜合征；白塞氏病;小柳原田綜合征;過敏反應;眼表疾病;結膜水腫；弓形蟲 病脈絡膜視網膜炎;眼眶炎癥性假瘤;球結膜水腫;結膜靜脈充血;眼眶蜂窩織炎;急性淚囊 炎;非特異性脈管炎;結節病;和巨細胞病毒感染。
[0235] 合適的"與眼的過度血管通透性和/或水腫相關的疾病"的示例，如在視網膜或玻 璃體中，包括但不限于:年齡相關性黃斑變性(AMD)、視網膜水腫、視網膜出血、玻璃體出血、 黃斑水腫(ME)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)和非增生性糖尿 病視網膜病變(DR)、福射性視網膜病變、毛細血管擴張、中屯、性漿液性視網膜病變、W及視 網膜靜脈阻塞。視網膜水腫是流體在視網膜內的空間的積累。糖尿病患者中發生的視網膜 微血管變化導致DME。運種血-視網膜屏障的折衷導致血漿組分泄漏到周圍的視網膜中，造 成視網膜水腫。視網膜的其它疾病包括視網膜靜脈阻塞(例如分支或中央靜脈阻塞）、福射 性視網膜病變、鑲狀細胞性視網膜病變、早產兒視網膜病變、Von Hippe 1 Lindau病、后葡萄 膜炎、慢性視網膜脫離、歐文蓋斯綜合征、Eals病、視網膜炎和/或脈絡膜炎。
[0236] 文中引用的術語"預盼'包括在疾病誘發之前施用保護性組合物。"抑削'指誘導事 件之后，但在疾病的臨床表現出現前施用組合物。"治療"設及疾病的癥狀明顯之后施用保 護性組合物。
[0237] 可用于篩選膚配體保護免受疾病或治療疾病有效性的動物模型系統是可獲得的。 本發明促進了動物模型系統的利用，其允許開發能與人和動物祀標交叉反應的多膚配體， W允許使用動物模型。
[0238] 檢驗易感小鼠中系統性紅斑狼瘡（SLE)的方法是本領域公知的化night等人. (1978)J Exp.Med.，147:1653;Reinersten等人（1978)化W Eng.J:Med. ,299:515)。通過使 用來自另一物種的可溶性AchR蛋白誘導疾病，在SJL/J雌性小鼠中檢測重癥肌無力（MG) (Xindshom等人.（1988)Adv. Immunol. ,42: 233)。通過注射II型膠原蛋白在小鼠易感株中 誘導關節炎（5化曰1'1:等人（1984)4]1]1.1?6￥.11111]111]1〇1.,42:233)。已經描述了通過注射結核分 枝桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中誘導佐劑性關節炎的模型(Van Eden等人（1988)化ture, 331:171)。如所述，通過施用甲狀腺球蛋白在小鼠中誘導甲狀腺炎（Maron等人（1980) J.Exp.Med.，152 :1115)。膜島素依賴型糖尿病（IDDM)是天然發生的或如Kanasawa等人 (1984)01曰66*〇1〇邑1曰，27:113所述的在某些小鼠株中誘導。小鼠和大鼠中的646用作人18的 模型。在該模型中，通過施用髓銷堿性蛋白誘導脫髓銷疾病(參見化terson(1986)Textbook of Immunopathology ,Mischer等人編.，Grune和Stratton ,New York ,pp . 179-213 ; Me 化 rlin 等人（1973)Science, 179:478: W 及 Satoh 等人（1987)J; Immunol. ,138:179)。
[0239] 參照W下實施例進一步描述本發明。
[0240] 實施例 [0241 ]材料和方法
[0242] 隧菌體文庫的克隆
[0243] 根據Heinis等人，Nat Chem Biol 2009,5(7) ,502-7生成隧菌體文庫。
[0244] 隧菌體選擇
[0245] 隧菌體文庫的甘油儲液在500ml 2YT/氯霉素（30mg/ml)培養物中稀釋至0〇6〇〇 = 0.1，在30°C下過夜生產隧菌體α5-16小時）。如Heinis，等人，化tChemBiol2009,5(7)502- 7中描述的，純化和化學修飾隧菌體，生物素化hPK(3mg) (I冊KA，來自人血漿，Innovative Research,Novi ,ΜΙ ,USA)與50ml預先清洗的磁性鏈霉親和素珠(Dynal,來自Invihogen的 M-280,化isley，英國）在室溫下解育10分鐘。清洗珠3次，而后用含1%BSA和0.1%Tween 20 的0.5ml清洗緩沖液（lOmM Tris-Cl，pH 7.4，150mM NaCl，10mM MgCl2，lmM CaCl2)在室溫下 旋轉封閉30分鐘。同時通過加入含有3%BSA和0.3%Tween 20的1ml清洗緩沖液封閉化學修 飾的隧菌體(典型地l〇W-l〇iit.u.溶解于2ml清洗緩沖液）。而后封閉的珠與封閉的化學修 飾的隧菌體混合，在室溫下在旋轉輪上解育30分鐘。用含有0.1 %Tween 20的清洗緩沖液清 洗珠 8次，并用清洗緩沖液清洗2次，而后用100ml 50mM甘氨酸，pH 2.2解育5分鐘。將洗脫的 隧菌體轉移到50ml 1M Tris-Cl，pH 8進行中和，與30ml 0〇6日日=0.4的TG1細胞在37°C下解 育90分鐘，將細胞鋪板于大的2YT/氯霉素板。使用相同的過程進行一或二輪額外的選擇 (panning)。在第二輪選擇中，包被親和素的磁珠被用來防止鏈霉親和素特異性膚的富集。 根據供應商的說明書，通過0.8mg親和素(Pierce,Rockford, IL,USA)與0.5ml甲苯橫酷基激 活的磁珠(Dynal,來自Invitrogen的M-280,F*aisley,英國）反應制備親和素珠。
[0246] 使用5巧和6x6文庫的標準選擇步驟，在循環一和二使用遞減濃度的生物素化的人 激膚釋放酶，隨后在循環Ξ和四使用人或大鼠生物素化的激膚釋放酶。人激膚釋放酶是非 重組的，且因此存在重鏈，大鼠激膚釋放酶是重組的，缺少重鏈，與預期相比可能活性較低 (基于人蛋白質的活性）。由于可能活性較低，大鼠祀標的濃度未降低至像人蛋白質的那樣。
[0247] 人、猴和大鼠 PK的克隆和表達
[0248] 人、猴和大鼠 PK的催化結構域在哺乳動物細胞中作為失活的前體表達，所述失活 的前體具有通過proTEV切割位點使N端連接至催化結構域的前膚。克隆表達載體，并如下所 述表達、激活和純化蛋白。編碼PK信號序列、多組氨酸標簽、proTEV切割位點、PK的成熟催化 結構域和終止密碼子的合成基因購自Geneart(雷根斯堡，德國）（補充材料）。制備含有人、 猴（Macaca mulatta)和大鼠 PK合成基因的質粒DNA，使用限制性酶對趾〇1和Hindlll (Fermentas ,維爾紐斯，拉脫維亞），W及T4DNA連接酶（Fermentas)將基因轉移到pEXPR- IBA42哺乳動物表達載體（IBA Biotechnology，臘ttingen，德國）。將連接的質粒轉化到化-1 藍色電效能細胞(Stratagene,Santa Clara,USA)，鋪板于含氨節西林（lOμg/ml)的2YT瓊脂 板上。生成來自Ξ個表達載體的DNA(命名為mPKjPK和hPK)，通過DNA測序確認正確的序列 (Macrogen,首爾，韓國）。
[0249] 如下在哺乳動物細胞中表達Ξ種直系同源血漿激膚釋放酶。50ml懸浮液配制的 肥K-293細胞在不含血清的ExCell 293介質中（SAFC 81〇3(^611。63,51丄〇1113，]\?))生長，所 述介質中存在4mM谷氨酷胺和組蛋白去乙酷化酶抑制劑丙戊酸(3.75mM)，在100ml燒瓶中在 存在5%C〇2、在37°C下在ISF-4-W培養箱化iihner AG，Birsfelden，瑞±)中 W ISOrpm軌道振 蕩。胚腎化EK-293)細胞在高細胞密度下（20xl06細胞/mlKBackliwal等人Biotechnol Bioeng 2008,99(3) ,721-7)使用線性聚乙締亞胺(PEI,Polysciences,E；ppenheim,德國）轉 染Ξ種質粒(300mg/ml)。在7天的生產相結束時，在4°C、2500rpm離屯、15分鐘，收獲細胞。通 過0.45皿PES膜(Filter-top 250ml低蛋白結合TPP)過濾從介質中除去任何額外的細胞碎 片。使用Ni-NTA樹脂、清洗緩沖液(500mM NaCl，25mM化抽P〇4，pH7.4)和洗脫緩沖液(500mM NaCl，25mM化抽Κ)4，ρΗ 7.4,500mM咪挫)通過Ni親和性色譜純化帶有多組氨酸標簽的蛋白。 用巧0單位)9'〇了6八？'〇111日旨日，1日山3〇11，威斯康星州，1]54)部分激活蛋白，用化親和性色譜和 凝膠過濾(PD10柱，150mM NaCl，0.5mM EDTA，50mM肥陽S，pH 7)額外地純化蛋白。
[0250] 開發具有改進的結合活性的多膚
[0251] 各位置的隨機化
[0252] 文庫構建:為了繪制結合激膚釋放酶的雙環膚中的氨基酸，構建了一套小文庫。對 于含有2個5殘基環的雙環，生成10個獨立的文庫，其中每個文庫在膚序列中特定密碼子上 隨機化。設計各文庫的寡核巧酸，W通過位點定向誘變突變隧菌體基因組DNA。誘變包括感 興趣密碼子的隨機化(變成順S)，從模板基因組序列中移除獨特的Ap化1限制性位點。使用 QIAgen QIAquick PCR純化試劑盒純化誘變產物，其中在超純水中洗脫。使用各文庫，通過 使用BioRad Micropulser儀器化cl程序)和1mm BioRa化k色皿，通過電穿孔分別轉化TG1大 腸桿菌。在37°C下、1ml S0C介質中回收1小時后，文庫轉化體過夜生長在含抗生素的25ml 2TY肉湯中，W選擇性地僅生長文庫轉化體。通過離屯、收獲細菌，使用QIAgen Plasmid Plus Midi試劑盒從大腸桿菌中純化文庫隧菌體DNA，并在蒸饋水中洗脫。New化gland Biolabs 緩沖液4中用ApaLl將純化的DM消化2小時，W除去母體物質。消化后，用QIAgen PCR純化試 劑盒（如上所述)再純化DNA，并將其用于轉化TG1 (電穿孔；如上所述）。在S0C中回收1小時 后，將轉化體鋪板于含選擇性抗生素的LB瓊脂板上，使菌落在37C下過夜生長。
[0253] 個體克隆的結合試驗：隨機挑選文庫轉化體菌落，作為個體培養物在含有選擇性 抗生素的2TY肉湯中生長。使用QIAgen PyroMark Q96 DNA測序儀DNA測序所挑選的菌落，W 掲示在每個克隆中存在的氨基酸取代。分離時，如下所述分析了各獨特取代的克隆的人血 漿激膚釋放酶結合。從培養物中收獲含隧菌體的上清，根據化inis等人(化ture化emical Biology卷5pp 502-507(2009))的方法用Ξ漠甲基苯(TBMB)環化隧菌體。使用基于同質板 的結合試驗，分析該步驟中純化的隧菌體對生物素化人血漿激膚釋放酶的結合；在BMG Labtech Pherastar FS板閱讀器上測量試驗的讀取。來自一式Ξ份試驗樣本的定量結合數 據取平均(平均值），表示為信號：背景(其中背景是沒有祀標物質的試驗樣本）。信號：背景 表示為平行母體樣本的％。誤差條指示平均值的標準偏差。所示的試驗代表至少2個獨立的 實驗。分析數據與膚序列相關。灰色標記的取代是未檢測的（克隆不是分離自隨機文庫取 樣）。平行分析未結合的雙環樣本(任意的），W說明試驗的基線。
[0254] 膚結構域的隨機化
[0255] 文庫構建:根據上述化inis等人在"隧菌體文庫的克隆"中描述的方法生成小的隧 菌體文庫。修飾sficx3ba引物，從而使編碼雙環的部分基于母體5巧或6x6雙環(5巧:兩個5- 殘基的環，6x6:兩個6-殘基的環)DNA序列，其中僅4-6個密碼子隨機化成NNS。隨機化密碼子 是編碼感興趣的膚結構域/基序的那些。
[0256] 個體克隆的結合試驗:挑選文庫轉化體菌落、或選擇輸出的菌落，作為個體培養物 在含有選擇性抗生素的2TY肉湯中生長。使用QIAgen PyroMark Q96 DNA測序儀DNA測序所 挑選的菌落，W掲示在每個克隆中存在的氨基酸取代，如下所述分析了其對人血漿激膚釋 放酶的結合。從培養物中收獲含隧菌體的上清，根據He in is等人（Nature Chemical Biology卷5pp 502-507(2009))的方法用Ξ漠甲基苯(TBMB)環化隧菌體。使用基于同質板 的結合試驗，分析該步驟中純化的隧菌體對生物素化人血漿激膚釋放酶的結合；在BMG Labtech Pherastar FS板閱讀器上測量試驗的讀取。來自一式Ξ份試驗樣本的定量結合數 據取平均(平均值），表示為信號:背景。所示的分析數據代表至少2個獨立的實驗。分析數據 與膚序列相關。
[0巧7] 膚合成
[0258] 膚合成基于Fmoc化學、使用化ptide Ins化uments制造的Symphony膚合成儀進行。 使用標準化〇。氨基酸（Sigma,Merck)，其具有W下的側鏈保護基:Arg(F*bf) ;Asn(T;rt) ;Asp (OtBu);切s(T;rt) ;Glu(0tBu) ;Gln(T;rt) ;His(T;rt) ;Lys(Boc) ;Se;r(tBu) ;Th;r(tBu) ;Trp (Boc) ,Ty;r(tBu) (Sigma)。偶聯試劑是HCTU(Pepceuticals)，二異丙基乙胺（DIPEA,Sigma) 用作堿，用20%DMF中的贓晚(AGTC)實現脫保護。使用0.37mmol/gr i^ioc-Rink酷胺AM樹脂 (AGTC)，在10化摩爾規模上進行合成，W相對于氨基酸而言4倍過量地使用化OC氨基酸，W 及4倍過量地使用堿。氨基酸W0.2M溶解于DMF中，肥TU W0.4M溶解于DMF，DIPEA W1.6M溶解 于N-甲基化咯燒酬(Alfa Aesar)。偶聯時間一般為30分鐘，脫保護時間為2x2.5分鐘。Fmoc- N-甲基甘氨酸(Fmoc-Sar-〇H，Merck)偶聯1小時，隨后殘基的脫保護和偶聯時間分別是20分 鐘和1小時。合成后，用二氯甲燒清洗樹脂，并干燥。使用1 OmL 95: 2.5: 2.5 : 2.5v/v/v/w的 TFA/此O/iPnSiH/二硫蘇糖醇持續3小時有效從支持物上切割側鏈保護基。切割后，通過過 濾除去用過的樹脂，將濾液加入35mL已經在-80°C中冷卻的二乙酸中。離屯、膚沉淀物，棄去 酸上清，用冷卻的乙酸清洗膚沉淀物2次W上。然后將膚再溶解于5-lOmL乙臘-水中，凍干。 取少量樣本用于通過質譜分析粗產品的純度(MALDI-T0F,來自Applied Biosystems的 Voyager DE)。凍干后，將膚粉末溶解于補充有0.5mL 1M二硫蘇糖醇的lOmL出0中的6M鹽酸 脈中，并加樣到CSLuna制備型冊LC柱（Phenomenex)。用0.1 %屯氣下酸酸化溶劑化2〇,乙 臘）。15分鐘內的梯度范圍為30-70%乙臘、則5/2011117分鐘的流速、使用6113〇11制備型冊以： 系統。組合含有純的線性膚物質（如通過MALDI鑒定的）的饋分，并用Ξ漠甲基苯（TBMB， Sigma)修飾。為此，線性膚用此0稀釋到~35mL，加入~50化L lOOmM乙臘中的TBMB，并且用 5血1M