達結合于膜的IL-15和 4-IBB配體（CDI37L)。此類細胞系包括，但不是必須限于K562[ATCC、CCL 243;Lozzio等， Blood 45(3) :321-3：M(1975);Klein等，Int.J.Cancer 18:421-431(1976)]，和Wi 1ms腫瘤 細胞系HFWT，[Fehniger Τ A，Cal igiuri Μ A. Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001) ;Harada H,等，Exp Hematol 32(7) :614-621(2004)]，子宮內膜腫瘤細胞系HHUA、黑 色素瘤細胞系HMV-II型、肝母細胞瘤細胞系化H-6、肺小細胞癌細胞株Lu-130和Lu-134-A、 神經母細胞瘤細胞系NB 19和N1369,來自睪丸肥C 14的胚胎性癌細胞，宮頸癌細胞系TC0-2 W及骨髓轉移神經母細胞瘤細胞系TNB 1陽arada H.，等，Jpn.J.Cancer Res 93:313-319 (2002)]。較佳地，所用的細胞系缺乏MHC I和II分子或表達不佳，如K562和HFWT細胞株。可 采用固體支持物來代替細胞系。較佳地，此類支持物應在其表面附有至少一種分子，該分子 能結合NK細胞和誘導初級活化事件和/或增殖反應或能夠結合具有此類作用的分子，藉此 用作支架。該支持物可在其表面附有CD 137配體蛋白、CD 137抗體、化-15蛋白或IL-15受體 抗體。較佳地，該支持物在其表面結合有IL-15受體抗體和CD 137抗體。
[0084] 本發明的組合療法
[0085] 本發明描述的組合物和方法可與其他種類的癌癥治療方法，如化療、手術、福射、 基因治療等聯用。此類療法可與本發明的免疫療法同時或按順序(按任何順序)實施。
[0086] 當與額外的治療劑聯合給藥，因其相加作用或協同作用可降低各試劑的適宜的有 效治療劑量。
[0087] 本發明的治療可W結合其它免疫調節治療，例如治療性疫苗(包括但不限于GVAX、 DC疫苗等）、檢查點抑制劑（包括但不限于阻斷(：化44、？01、1^\63、1'這3等的試劑）或活化劑 (包括但不限于增強41BB、0X40等試劑）。
[0088] 可與本發明免疫療法聯用的其它治療劑的非限制性例子包括：
[0089] (i)抗血管生成試劑(例如，TNP-470,血小板因子4、血小板反應蛋白-1、金屬蛋白 酶組織抑制劑(TIMP巧日TIMP2)、催乳素（16-Kd片段）、血管抑素(血纖維蛋白溶酶原38-Kd片 段）、內皮抑素、bFGF可溶性受體、轉化生長因子β、干擾素 α、可溶性KDR和FTkl受體、胎盤增 殖蛋白相關的蛋白，W及化rmeliet and化in(2000)中所列舉的那些）；
[0090] (i i) VEG巧吉抗劑或VEGF受體括抗劑，如抗VEGF抗體、VEGF變體、可溶性VEGF受體片 段、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶抑制劑、及其任何 組合；
[0091 ] (i i i)化療化合物，例如，喀晚類似物(5-氣尿喀晚、氣尿巧、卡培他濱、吉西他濱和 阿糖胞巧）、嚷嶺類似物、葉酸括抗劑和相關抑制劑(琉基嚷嶺、硫鳥嚷嶺、噴妥司汀和2-氯 脫氧腺巧(克拉屈濱））；抗增殖/抗有絲分裂劑，包括天然產物，如長春花生物堿(長春花堿、 長春新堿、長春瑞濱），微管干擾素，如紫杉燒(紫杉醇、多西紫杉醇）、長春新堿、長春花堿、 諾考達挫、埃坡霉素和長春瑞濱，表鬼白毒素(日91山9〇(1〇地如1〇扣義山3)(足葉乙武，替尼泊 武）、DNA損傷劑(放線菌素、胺苯叮晚、蔥環霉素、博萊霉素、白消安、喜樹堿、卡銷、苯下酸氮 芥、順銷、環憐酷胺，環憐酷胺(切toxan)，放線菌素 D，柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、六亞甲 基二胺、奧沙利銷、異環憐酷胺、馬法蘭、氮芥(merchlorehtamine)、絲裂霉素、米托蔥釀、亞 硝基脈、普卡霉素(plicamycin)、甲基節阱、紫杉醇、泰索帝、替尼泊武、Ξ亞乙基硫代憐酷 胺和依托泊巧（vpl6));抗生素，如更生霉素(放線菌素 D)、柔紅霉素、阿霉素（亞德里亞霉 素），去甲氧柔紅霉素、蔥環霉素、米托蔥釀、博來霉素、普卡霉素(光神霉素)和絲裂霉素;酶 α-天冬酷胺酶，其系統性代謝心天冬酷胺和剝奪沒有能力合成自身的天冬酷胺的細胞）； 抗血小板藥物;抗增殖/抗有絲分裂烷基化劑，如氮芥（二氯甲基二乙胺、環憐酷胺和類似 物，馬法蘭，苯下酸氮芥）、乙締亞胺和甲基Ξ聚氯胺(六甲基Ξ聚氯胺、嚷替贓）、烷基橫酸 鹽-白消安（卡氮芥（BCNU)和類似物，鏈脈菌素），S嗦一達卡己嗦（trazenes- dacarbazinineKDTIC);抗增殖/抗有絲分裂代謝物，如葉酸類似物（甲氨蝶嶺）；銷配合物 (順銷、卡銷）、甲基節阱、徑基脈、米托坦、氨魯米特;激素、激素類似物(雌激素、Ξ苯氧胺、 戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳香化酶抑制劑(來曲挫，阿那曲挫）；抗凝劑(肝素、合成 肝素鹽和其他凝血酶抑制劑）；纖維蛋白酶溶解劑(如組織纖溶酶原激活劑、鏈激酶和尿激 酶）、阿司匹林、雙喀達莫、嚷氯匹定、氯化格雷、阿昔單抗;抗遷移劑;抗分泌劑(布雷菲德菌 素-breveldin);免疫抑制劑(環抱霉素、他克莫司（FK 506)、西羅莫司（雷帕霉素）、硫挫嚷 嶺、霉酪酸醋）；抗血管生成化合物(如TNP-470、金雀異黃素、貝伐單抗)和生長因子抑制劑 (如，成纖維細胞生長因子(FGF)抑制劑）；血管緊張素受體阻滯劑;一氧化氮供體;反義寡核 巧酸;抗體（曲妥珠單抗）；細胞周期抑制劑和分化誘導劑(維甲酸）;mTOP抑制劑，拓撲異構 酶抑制劑（多柔比星（阿霉素）、胺苯叮晚、喜樹堿、柔紅霉素、更生霉素、替尼泊巧 (eniposide)、表阿霉素、足葉乙武、去甲氧柔紅霉素和米托蔥釀，拓撲替康，伊立替康），糖 皮質激素(可的松、地塞米松，氨化可的松、甲基強的松龍(methylpednisolone)、潑尼松和 氨化波尼松(prenisolone));生長因子信號轉導激酶抑制劑；線粒體功能障礙誘導劑和半 脫天冬酶活化劑;和染色質干擾素。
[0092] 其它的有用試劑示例也可參見《醫師案頭參考》(化ysician's Desk Reference), 第59.版，（2005)，Thomson P D R，蒙特威爾，N.J.;Gennaro等編，《雷明頓藥學科學和實踐》 (Remington's The Science and Practice of Pharmacy)第20版，（2000),利平科特?威 廉斯?威爾金斯出版公司，己爾的摩，馬里蘭州;Braunwald等編.《哈里森內科原理》化arri son's Principles of Internal Medicine),第15版，（2001),麥格勞-希爾集團，紐約； Berkow等編，默克診斷和治療手冊（The Merck Manual of Dia即osis and Therapy)， (1992)，默克研究實驗室，拉威，新澤西州。
[0093] 不作進一步闡述，應相信，基于上述描述，本領域技術人員可在完整的范圍內利用 本發明。因此，W下【具體實施方式】應視為僅僅是說明性的，而非W任何方式限制本發明的其 余部分。出于本文引用的目的或主題，本文所引的所有出版物通過引用納入。 實施例
[0094] 也借助下列實施例描述和說明本發明。然而，利用運些實施例和說明書任意地方 的其他實施例只是說明性的，絕非要限制本發明或任何示例性術語的范圍和意義。同樣地， 本發明不限于任何在此描述的特定優選實施方案。事實上，在閱讀本說明書后，本發明的多 種修飾和變化對本領域技術人員是明顯的，并且可不脫離本發明的實質或范圍來作出此種 變化。
[00巧]材料和方法
[0096] 細胞
[0097] 人B系淋己瘤細胞系化udi和Ramos，Τ細胞急性淋己細胞白血病細胞系化rkat，和 神經母細胞瘤細胞系CHLA-255、NB1691和SK N甜獲自圣朱迪兒童研究醫院（Stjude化i Idren's Research Hospital)。乳腺癌細胞系MCF-7(ATCC HTB-22)，SK-BR-3(ATCC HTB- 30)和骨肉瘤細胞系U-20S(ATCC HTB-96)獲自美國典型培養物保藏中屯、(ATCC;羅克維爾， MD);胃癌細胞系MKN7來自國家生物醫學創新研究所（大阪，日本）。Daud i、畑LA-2 5 5、 NB169USK-N-甜、51(-81?-3、]\〇^-7、1]-205和]\1腳7也用含巧火蟲巧光素酶基因的小鼠干細胞 病毒(MSCV)-內部核糖體進入位點（IRES)-綠色巧光蛋白（GFP)逆轉錄病毒載體轉導（藤崎 等，Cancer Res .，2009; 69(9): 4010-4017)。通過FACSAria細胞分選儀(BD生物科學公司-BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亞州)選擇轉導細胞的綠色巧光蛋白表達情況。來自新診斷 的并未治療的B慢性淋己細胞性白血病(CLL)患者的外周血或骨髓樣本經知情同意和經管 理新加坡國立大學醫院的特定領域倫理委員會批準獲得。
[0098] 外周血樣品來自健康成年獻血者血小板捐獻物的去識別化副產品。單核細胞通過 離屯、富集在Accu-Prep人淋己細胞細胞分離介質上（ACS公司-Accurate化emicalfe Scientific Co巧.，韋斯特伯里，紐約），并用抗-CD3/CD28珠(英杰公司，卡爾斯己德，加利 福尼亞州）在含10%胎牛血清(FBS)、抗生素、100 IU白細胞介素（IL)-2(羅氏，曼海姆，德 國）的RPMI-1640 中培養 3 天。在第4天，用〔014、〔016、〔019、〔036、〔056、〔0123和〔0235曰抗體 和磁珠的混合物作陰性選擇來純化T細胞（全T細胞分離試劑盒Π ;ΜΒ公司-Miltenyi Biotec，貝爾吉施格拉德己赫，德國）（純度>98% )。純化的T細胞保存在上述介質中，每隔一 天加入100IU的IL-2。
[0099] 質粒、病毒產生和基因轉導
[0100] pMSCV-IRES-GFP、祀Q-PAM3 (-E)和P畑F獲自圣朱迪兒童研究醫院載體開發和生產 共享資源（孟菲斯，田納西州KFCRG3A CDNA獲自化igene公司（羅克維爾，馬里蘭州），其 V158F變體使用引物"F"CTTCTGCAGGGGGCTTGTTGGGAGTAAAAATGTGTC(SEQ ID NO. :7)和"R" GACACATTTTTACTCCCAACAAGCCCCCTGCAGAAG(SEQ ID NO. :8)，通過PCR定點誘變生成。編碼 〔08曰較鏈區和跨膜區的多核巧酸(569 10^.:11)，4-188(沈9 10^.:12)和〔03((569 10 ^:13)胞內區從先前制備的抗-〔019-4188-〔03(〔0麻亞克隆得到。參見1111曰1等，1^6111?51111曰 2004; 18 :676-684。運些分子通過PCR重疊延伸而剪接組裝。將構建體（"CD16F-BB-C"和" CD16V-BB-C")和表達盒亞克隆入MSCV-IRES-GFP載體的EcoRI和MLul位點。
[0101] 為了生成RD114-假逆轉錄病毒，利用化GE肥6或X-化emeGE肥9(羅氏，印第安納 波利斯，印第安納州），用3.扣g編碼CD16V-BB-C的CDNA、3.5yg祀Q-PAM3(-E)和化g P畑F轉 染3x10? 293T細胞（Imai等，Leukemia 2004; 18:676-684)。在24小時時用含 10%FBS的 RPMI-1640替換培養基，在48-96小時后得到含有逆轉錄病毒的培養物，并將其加到包被有 Re化oNectin(化kaRa，大津，日本)的聚丙締試管中，在1400g下離屯、10分鐘，在37°C溫育6小 時。在離屯、分離并除去上清液后，將T細胞(IX 105)加到試管中，在37°C下放置24小時。細胞 在含有FBS、抗生素和lOOIU/mL比-2的RPMI-1640中保存直到試驗時間（轉導后7-21天）。
[0102] 通過使用R-藻紅蛋白偶聯的抗人CD16(克隆B73.1，抓BP公司-BD Biosciences Pharmingen，圣地亞哥，加利福尼亞州）的流式細胞儀分析CD16的表面表達。將2x107T細胞 在含有1%蛋白酶抑制劑混合物（西格瑪公司-Sigma)和1%憐酸酶抑制劑混合物2(西格瑪 公司）的Cellytic Μ裂解緩沖液（西格瑪公司，圣路易斯，密蘇里州）中裂解，W用于蛋白質 免疫印跡。離屯、后，在有或沒有還原緩沖液(英杰公司）存在下，裂解上清液用等體積的LDS 緩沖液(英杰公司，卡爾斯己德，加利福尼亞州）煮沸，然后用NuPAGE Novex 12%Bis-化is 凝膠(英杰公司）分離。蛋白質被轉移到聚偏氣乙締(PVDF)膜上，然后用小鼠抗人CD3C(克隆 8D3;抓BP公司-BD eBioscience陸armingen)溫育，然后用山羊抗小鼠 IgG辣根過氧化物酶 偶聯的二抗(細胞信號傳導技術公司Cell Signal ing Technology,丹弗斯，馬薩諸塞州） 溫育。通過使用Amersham E化Prime檢測試劑(GE醫療集團）掲示抗體結合。
[0103] mRNA 電穿孔
[0104] pVAXl載體(英杰公司，卡爾斯己德，加利福尼亞州）被用作體外mRNA轉錄的模板。 將CD16V-BB-CCDNA亞克隆到pVAXl的EcoRI和Xbal位點。利用T7 mScript mRNA生產系統（CS 公司-CellSc;ript，麥迪遜，威斯康星州）在體外轉錄相應的mRNA。參見，例如化imasaki等， Cytotherapy,2012；14(7)：830-40〇
[01化]電穿孔法使用了Amaxa Nucleofector (隆薩公司-Lonza，沃克斯維爾，馬里蘭州）。 用細胞系核轉染試劑盒V(Cell Line Nucleofector Kit V，隆薩公司）混合用200IU/mL 化-2過夜活化的lx ΙΟ7純化的Τ細胞與20化g/mL mRNA,轉入處理室，并采用程序X-001轉 染。電穿孔后立即將細胞從處理室轉入24孔板、然后在含有FBS、抗生素和lOOIU/mL化-2 (羅氏，曼海姆，德國）的RPMI-1640中培養。也參見Siimasaki等，Cytotherapy，2012，l-ll。
[0106] 抗體結合、細胞接合和細胞增殖試驗
[0107] 為了測量嵌合受體的抗體結合能力，4Γ下，將經嵌合受體或只含GFP的載體轉導 的T淋己細胞(5X105)與利妥昔單抗(美羅華，羅氏；O.l-lyg/mL)、曲妥珠單抗(赫賽汀；羅 氏；0.1 -1 yg/mL)和/或純化的人I gG (研發系統公司-R&D SyStems，明尼阿波利斯，明尼蘇達 州；O.l-lyg/mL)溫育30分鐘。憐酸鹽緩沖鹽(PBS)洗涂兩次后，將細胞與山羊抗人IgG-PE (SBA公司-Southern Biotechnology Assoc iates，伯明翰，阿拉己馬州）在室溫下溫育10 分鐘，使用Accuri C6流式細胞儀(抓生物科學公司-BD Biosciences)檢測細胞染色。
[0108] 為了確定與受體結合的抗體是否促進細胞聚集，用CellTrace巧黃綠素紅一澄AM (英杰公司）標記CD20陽性Daudi細胞，然后與利妥昔單抗(O.lyg/mL)在4°C下溫育30分鐘。 PBS洗涂兩次后，細胞與用嵌合受體轉導或模擬轉導的化rkat細胞在37 °C下在96圓底平板 (Costar，康寧，NY)中Wl:lE:T比例溫育60分鐘。用流式細胞儀檢測形成異源細胞聚集體 (巧黃綠素 AM-GFP雙陽性)的細胞比例。
[0109] 為了檢測細胞增殖，將經嵌合受體轉導或模擬轉導的IX 106Τ細胞置于24孔板 (Cos化r，康寧，紐約）的含FBS、抗生素和50IU/mL化-2的RPMI 1640中的孔中。Daudi細胞用 Streck細胞防腐劑（斯特雷克實驗室-Shec