IgG，P< 0.0001)。
[0030]圖5顯示了結合于CD16V-BB-C受體的免疫球蛋白引起T細胞活化，裂解顆粒的胞吐 和細胞增殖。A.經包含GFP(模擬)或包含GFP和CD16V-BB-C的載體轉導的T淋己細胞在包被 利妥昔單抗的微量滴定板中培養48小時，無 IL-2;用流式細胞術檢測CD25的表達。B.A欄所 示測試結果的概要顯示了 GFP+細胞中的CD25表達(來自Ξ個獻血者的Τ細胞實驗的平均值 ±SD);在利妥昔單抗r'Ab")存在下，經CD16V-BB-C轉導的Τ淋己細胞中CD25的表達顯著高 于其他實驗條件(P含0.003)。C.經包含GFP的載體(模擬)和包含GFP和CD 16V-BB-C的載體轉 導的來自四個獻血者的T淋己細胞用A的條件(n = 3)培養4小時或與Daudi細胞(n = 3)培養4 小時；用流式細胞術檢測CD107a染色。各欄顯示了6個實驗的平均值±50;在利妥昔單抗 r'Ab")存在下，經CD 16V-BB-C轉導的T淋己細胞中CD 107a的表達明顯更高于其他實驗條件 (P<0.0001)。0 .在有或沒有Daudi細胞存在下，單獨培養或用利妥昔單抗培養模擬-或 CD16V-BB-C-轉染的T淋己細胞最多四周。符號顯示了與輸入細胞的數量相比的細胞恢復百 分比（來自Ξ個獻血者的T細胞實驗的平均值±SD)。
[0031] 圖6顯示了體外CD16V-BB-CT淋己細胞介導的抗體一依賴細胞毒性。A.在對應抗體 存在下，模擬一或CD16V-BB-C-轉導的T淋己細胞介導的針對癌細胞系的細胞毒性的典型實 施例。每個符號顯示了一式Ξ份培養物的平均值（P<〇. 01，配對t檢測法檢測所有Ξ組比 對）。完整的數據示于圖7"B.在有或沒有利妥昔單抗（"Ab")存在下，模擬-或CD16V-BB-巧專 導的T淋己細胞針對來自慢性淋己細胞白血病(Oi)患者原代細胞的細胞毒性。每欄(每個 患者用不同的陰影)對應于2:化:T比的一式Ξ份4小時實驗檢測到的平均（±SD)細胞毒性。 CD16V-BB-CT細胞和抗體的細胞毒性明顯更高于其他3個條件下測得的細胞毒性（P< 0.0001，t測試）；用模擬轉導T細胞，添加抗體提高細胞毒性(P = 0.016);所有其它比對:P〉 0.05。C.在間充質基質細胞(MSC)存在下，24小時后W1:沈:T的比例針對B中測試的相同化L 樣本的細胞毒性。每欄對應于兩個測試的平均值。CD16V-BB-C和抗體的細胞毒性明顯更高 于單獨使用抗體(P = 〇.0002)或單獨使用細胞的（P<0.0001)，單獨使用抗體的細胞毒性明 顯更高于單獨使用細胞的(P = 〇. 0045)。
[0032] 圖7顯示了 4小時體外細胞毒性試驗的總體結果。模擬-或CD16V-BB-CT淋己細胞與 所示的細胞系和非反應性人免疫球蛋白（"無 Ab")或和相應抗體（"Ab")-起培養。Daudi和 Ramos用利妥昔單抗，MCF-7、SK服-3和MKN-7用曲妥珠單抗，W及CHLA-255，NB1691，SK-N-甜 和U-20S用hul4.18K322A。與沒有T細胞和/或抗體培養的腫瘤細胞相比，顯示了2:1比例 (CHLA-255為4:1)下的細胞毒性。NB1691和SK-BR-3的結果對應于用3個獻血者的T淋己細胞 進行的一式Ξ份試驗的均值（±SD)細胞毒性，其余細胞系的結果對應于1個獻血者的試驗； Daudi的結果是2個獻血者的一式Ξ份試驗的均值(+SD)細胞毒性W及來自另外4個獻血者 的T淋己細胞的單獨試驗。在不存在T細胞時添加利妥昔單抗、曲妥珠單抗或hul4.18K322A 時的均值細胞毒性<10。
[0033] 圖8顯示了CD16V-BB-CT淋己細胞的細胞毒性是強的、特異性的，并且不受未結合 IgG的影響。A.CD16V-BB-CT淋己細胞與神經母細胞瘤細胞系NB169巧日非反應性人免疫球蛋 白（"無 Ab")或hul4.18K322A抗體（"Ab")共培養24小時。結果對應于一式Ξ份實驗的平均 (±SD)細胞毒性。即便在1:86:1'。= 0.0002)下，〔016￥-88-(細胞加扣14.181(3224抗體的細 胞毒性仍顯著高于單獨使用CD16V-BB-CT細胞的。B.在利妥昔單抗或非反應性抗體曲妥珠 單抗或hul4.18K322A存在下，模擬-或CD16V-BB-C轉導的T淋己細胞W2:化:T與B細胞淋己 瘤細胞系Daudi共培養4小時。結果對應于一式立份實驗的平均（±SD)細胞毒性。（"模擬"結 果是每個抗體的一式Ξ份實驗的總和）。利用利妥昔單抗的細胞毒性明顯更高于所有其他 實驗條件(P<〇.0001與所有比較）dC.在各種濃度的免疫治療抗體和競爭性的未結合IgG(同 時加入到抗體)存在下，8:1E:T下，表達CD16V-BB-C的Τ淋己細胞針對腫瘤細胞系的細胞毒 性。符號對應于對每個抗體濃度下至少一式Ξ份測量的平均值（±SD)。不論未結合IgG的存 在量，對于每種細胞系，細胞毒性在統計學上并非不同。
[0034] 圖9顯示了表達CD16V-BB-C受體的T淋己細胞具有體內抗腫瘤活性。對N0D-SCID- IL2RGnull小鼠腹膜內注射3X105標記巧光素酶的化udi細胞。第四天起每周一次腹膜內注 射利妥昔單抗（150yg)，四周。在4只小鼠中，不施加其他治療方法，而在其他5只小鼠中，在 第5和第6天第一次注射利妥昔單抗后再注射表達CD16V-BB-C受體的T淋己細胞（1 X 107腹 膜內；η = 5);其它兩組的4只小鼠每只在接受CD16V-BB-CT淋己細胞之前，腹膜內注射RPMI- 1640而非利妥昔單抗，或僅腹膜內注射RPMI-1640介質（"對照"）dA.腫瘤生長的體內成像結 果。每個符號對應一種生物發光測量值;線條連接一只小鼠中的所有測量值。B.每個實驗條 件下的代表性小鼠（2只每組）。第3天的腹部影像用增強的靈敏度進行了處理，W顯示 CD16V-BB-C+利妥昔單抗組小鼠中腫瘤的存在。當生物發光達5x1〇id光子/秒時對小鼠進行 安樂死。C.不同治療組小鼠的總生存率的比較。
[00巧]圖10證實了表達CD16V-BB-C受體的T淋己細胞在體內具有抗腫瘤活性。對N0D- SCID-IL2RGnull小鼠腹膜內注射3X105的標記巧光素酶的NB1691細胞。第5天起每周一次 地腹膜內注射化14.18K322A抗體(2扣g)，四周。在4只小鼠中不施加其他治療方法，而在其 他4只小鼠中，在第6和第7天第一次注射抗體后再注射表達CD16V-BB-C受體的T淋己細胞（1 X107腹腔;n = 4);其它兩組的4只小鼠每只在接受CD16V-BB-CT淋己細胞之前，腹膜內注射 RPMI-1640而非抗體，或僅腹膜內注射RPMI-1640介質（"對照"）dA.腫瘤生長的體內成像結 果。每個符號對應一種生物發光測量值;線條連接一只小鼠中的所有測量值。B.每個實驗條 件下所有小鼠的成像。當生物發光達lxl〇w光子/秒時對小鼠進行安樂死。C.不同治療組小 鼠的總生存率的比較。
[0036] 圖11顯示了表達CD16V-BB-C受體T淋己細胞和表達CD16F-BB-C受體的T淋己細胞 之間的功能差異。A.流式細胞散點圖顯示了用CD16V-BB-C或CD16F-BB-C轉導的T淋己細胞 中CD 16(用B73.1抗體檢巧U)和綠色巧光蛋白（GFP)的表達。顯示了每個象限中的陽性細胞 百分比。B.在利妥昔單抗、曲妥珠單抗和hul4.18K322A的存在下，CD 16V或CD16F受體轉導 的T淋己細胞分別與Daudi、SK-BR-3或NB1691細胞培養。所有抗體W0.化g/mL使用。符號表 示相比于輸入細胞量的細胞恢復百分比（3個實驗的平均值±50);對于所有3種培養物，配 對t測試顯示1-3周培養的細胞計數顯著不同（Daudi，P = 0.0007;SK-BR-3，P = 0.0164; NB1691，P = 0.022)dC.在不同濃度的利妥昔單抗存在下，表達CD16V-BB-C或CD16F-BB-C受 體的T淋己細胞介導的針對化udi細胞的抗體依賴型細胞毒性。每個符號表示在8:1(左)或 2:1(右化:T下的Ξ種培養物的平均值±SD。含有CD16V-BB-C的T細胞的細胞毒性明顯更高 于那些含有CD16F-BB-C的T細胞的細胞毒性(P<0.001，任一個E: T)。
[0037] 圖12顯示了用于本研究的CD 16嵌合受體的示意圖。
[0038] 圖13顯示了具有不同信號傳導域的CD 16V受體的表達。流式細胞散點圖顯示了活 化的T淋己細胞中，綠色巧光蛋白與CD 16組合的表達（用3G8抗體檢測），該T淋己細胞用單 獨含有綠色巧光蛋白（GFP)(模擬)或不同CD 16V構建物的載體轉導。顯示了每個象限中的 陽性細胞百分比。
[0039] 圖14顯示了與具有不同信號傳導特性的CD 16V受體相比，CD16V-BB-C誘導更高的 τ細胞活化，增殖和細胞毒性。A.與Daudi細胞和利妥昔單抗(ο. lyg/m 1)共培養48小時后， 表達不同嵌合受體的T淋己細胞中通過流式細胞術檢測的CD25平均巧光強度(MFI)對綠色 巧光蛋白（GFP)MFI的圖譜。利用CD16V-BB-C的CD25表達明顯更高于那些沒有信號傳導能力 ("CD16V-截短"）的CD16V-C、CD16V-FceRI 丫或CD 16V所觸發的CD25表達。（P<0.0001 通過線 性回歸分析）dB.在利妥昔單抗、曲妥珠單抗和hul4.18K322A存在下，各種CD16V受體轉導的 T淋己細胞分別與化udi、SK-BR-3或NB1691細胞培養。所有抗體WO.化g/ml使用。符號表示 相比于輸入細胞量的細胞恢復百分比（3個實驗的平均值±50);對于所有3種培養物，配對t 測試顯示利用CD16V-BB-C受體的1-3周培養的細胞計數顯著高于利用其它受體的細胞計數 (P<0.0001) X.分別在利妥昔單抗、曲妥珠單抗和hul4.18K322A存在下，表達各種CD16V受 體的T淋己細胞或模擬轉導的T細胞對化udi、SK-BR-3和NB1691的ADCC。符號為在所示E:T 下，一式Ξ份培養物的平均值±SD。利用CD16V-BB-C受體的細胞毒性明顯高于利用所有其 它受體的細胞毒性(所有對比通過t測試，P<0.0001)，然而模擬轉導或經CD16V-截短受體轉 導的淋己細胞的細胞毒性彼此并非顯著不同（P〉〇.〇5);針對Daudi(P = 0.006)和SK-BR-3(P = 0.019)，利用CD16V-化εΚΙ 丫的細胞毒性明顯更高于利用CD3-C的細胞毒性;表達任一受 體的淋己細胞比模擬轉導或經CD16V-截短(Ρ<0.01，所有比較)轉導的淋己細胞具有更高的 細胞毒性。
[0040] 圖15顯示了mRNA電穿孔測得的CD16V-BB-C受體的表達。Α.用CD16V-BB-CmRNA或無 mRNA(模擬)電穿孔活化T淋己細胞;24小時后用流式細胞術檢測CD16的表達。B.在利妥昔單 抗存在下，測試模擬或CD16V-BB-C電穿孔的T細胞對Ramos細胞系的細胞毒性。符號顯示了 平均值± SD百分比細胞毒性(η = 3; P<0.01所有E:化k例下的比較）。
[004。發明詳述
[0042] 本發明基于構建新型嵌合受體，該受體增強抗癌抗體在癌癥治療中的功效。表達α 機細胞受體的Τ淋己細胞(Τ細胞的絕大多數)缺乏活化Fc 丫 R且不介導抗體依賴細胞毒性。 Nimmerjahn 等，化 t Rev Immunol.2008;8(l) :34-47。本發明顯示了表達由 Fc 丫 R和 T 細胞信 號傳導分子組成的嵌合受體應賦予運些細胞ADCC能力，因此，應該顯著增加單克隆抗體的 抗腫瘤潛力及其他包含Fc部的抗腫瘤分子，例如，一復合分子，由結合腫瘤表面受體的 配體(例如，細胞因子，免疫細胞受體)與免疫球蛋白的Fc-部或包含Fc的DNA或RNA構成），而 無論祀向的腫瘤抗原。本文所描述的是表達此類嵌合受體的T淋己細胞的抗體導向抗腫瘤 活性。
[0043] 本發明提供了一種嵌合受體，其包含：（i)CD16分子的胞外配體結合區，可W是 F158 FCGR3A或高親和力的V158 FCGR3A變體；（ii)CD8a的較鏈區和跨膜區；和（ii)包括CD3 ζ和4-1BB信號傳導區。本發明的嵌合受體是具有顯著增強對多種腫瘤的抗體治療功效潛能 的通用嵌合受體。如在下述實施例部分討論的，當通過逆轉錄病毒轉導在人Τ細胞中表達 時，與另一種含有常見的F158變體的受體相比，本發明的受體對人IgG(包括人源化抗體如 抗-CD20抗體利妥昔單抗)的親和力顯著更高。嵌合受體的接合引起T細胞活化，裂解性顆粒 的胞吐和增殖。在利妥昔單抗存在下，表達CD16V-BB-C的T細胞在較低的效祀比下特異性殺 傷淋己瘤細胞系和原發性慢性淋己細胞白血病(αχ)細胞，即便在骨髓間充質干細胞上進 行化L培養時。抗皿R2抗體曲妥珠單抗觸發嵌合受體介導的抗乳腺癌和胃癌細胞的抗體依 賴細胞毒性(ADCC)，抗GD2抗體hul4.18Κ322Α觸發嵌合受體介導的抗神經母細胞瘤和骨肉 瘤細胞的抗體依賴細胞毒性。在實施例部分進一步掲示了，組合表達嵌合受體和利妥昔單 抗的T細胞根除免疫缺陷小鼠體內的人淋己瘤細胞，而單獨用T細胞或抗體無法做到。為了 加速運項技術的臨床轉化，本文研發了一種基于嵌合受體mRNA電穿孔的方法，使得受體有 效和瞬時地表達，而不使用病毒載體。
[0044] 定義
[0045] 所使用的術語"嵌合受體"被定義為細胞表面受體，包括胞外配體結合區，跨 膜區和細胞質信號傳導區的組合，其不是單個蛋白質上天然發現的。本發明的嵌合受體主 要目的是用于T細胞，但也可用于天然殺傷(NK)細胞。
[0046] 術語"約"或"大約"是指本領域普通技術人員測定的特定值在可接受的錯誤范圍 內，運將部分取決于如何測量或確定該值，即，測量系統的局限性。例如，就本領域的慣例而 言，"約"可指在可接受的標準偏差內。或者，"約"可指給定值的最高±20%，較佳地，最高± 10 %，更佳地，最高± 5 %，更佳地，最高± 1 %的范圍。或者，特別是對于生物體系或工藝，運 個術語可指在某值的一個數量級內，較佳地，在2倍內。在申請文本和權利要求中描述特定 值之處，除非另有說明，否則術語"約"是隱含的，且在運種情況下意味著該特定值在可接受 的錯誤范圍內。
[0047] 在本發明的上下文中，在其設及任一本文所引用病癥的范圍內，術語"治療"、"療 法"等意味著緩解或減輕與此類病癥相關的至少一種癥狀，或減緩或逆轉運種病癥的進展。 在本發明的含義中，術語"治療"還表示抑制、延緩其發作（即，疾病臨床表現之前的時期） 和/或降低疾病發展或惡化的風險。例如，與癌癥相關的術語"治療"可W指消除或減少病人 的腫瘤負荷，或預防、延遲或抑制轉移等。
[0048] 如本文所用，應用于劑量或用量的術語"治療有效的"是指給予有此需要的個體 后，化合物或藥物組合物(例如，包含含有本發明嵌合受體的T淋己細胞(和/或NK細胞)的組 合物，和任選還包含腫瘤特異性細胞毒性單克隆抗體或含有Fc部分的另一種抗腫瘤分子 (例如，由結合腫瘤表面受體的配體(例如，細胞因子，免疫細胞受體)與免疫球蛋白的Fc部 分或含有化的DNA或RNA構成的復合分子））的數量足W導致所需活性。在本發明上下文中， 術語"治療有效的"是指化合物或藥物組合物的數量足W延緩表現，抑制進展，緩解或減輕 由本發明方法治療的疾病的至少一種癥狀。注意，當施用活性成分的組合時，該組合的有效 量可W包括或不包括各個成分被單獨施用時有效的量。
[0049] 與本發明的組合物結合使用的短語"藥學上可接受的"是指分子實體和組合物中 的其他成分在生理上是可耐受的且通常當施用給哺乳動物（例如，人）時不會產生不良反 應。優選地，如本文所用，術語"藥學上可接受的"是指由聯邦管理機構或州政府批準或在美 國藥典或其它通常公認的藥典中列出的，用于哺乳動物的，并且更特別地是人。
[0050] 如本文所用，術語"個體"是指任何哺乳動物。在一優選實施方案中，所述個體是 人。