k Laboratories,奧馬哈，內布拉斯加州）處理 來結束增殖，并用利妥昔單抗(0.1 g/mU在4°C下標記30分鐘。將它們在0、7、14和21天W與 T細胞呈1:1的比例加入各孔。培養后存活的T細胞數目η用流式細胞儀檢測。
[0110] CD107脫粒和細胞毒性試驗
[0111] 為了測定CD 16交聯是否引起裂解顆粒胞吐作用，嵌合受體轉導和模擬轉導的Τ細 胞（IX 1〇5)置于利妥昔單抗包被的96孔平底板的每一個孔中并在37Γ下培養4小時。在其 他實驗中，T細胞與經利妥昔單抗預培養的Daudi細胞共同培養。在開始培養時添加藻紅蛋 白偶聯的抗人CD107a抗體(抓生物科學公司），一個小時后加入GolgiStop(0.15yl;抓生物 科學公司）。通過流式細胞儀分析CD 107a陽性T細胞。
[0112] 為了測試細胞毒性，將祀細胞懸浮在含10%FBS的RPMI 1640中，用巧黃綠素 AM(英 杰公司）標記并置于96孔圓底板(Costar)。!'細胞W結果中顯示的不同E:T比例添加，并在有 或沒有抗體利妥昔單抗（美羅華，羅氏公司），曲妥珠單抗（赫賽汀，羅氏公司）或 hul4.18K322A(獲自James Allay博：t，圣朱迪兒童研究醫院GMP，孟斐斯，田納西州；化邑/ mL)存在下與祀細胞共同培養4小時。培養結束時，收集細胞，重懸于相同體積的PBS中，加入 艦化丙晚。存活的祀細胞數目（巧黃綠素 AM-陽性，艦化丙晚陰性）用Accuri C6流式細胞儀 計算（藤崎等，Cancer Res. 2009:69(9):4010-4017)。對貼壁細胞系，細胞毒性用巧光素酶 標記的祀細胞測試。為了檢測對貼壁細胞系NB1691、CHLA-255、SK-BR-3、MCF-7、U-20S和 MKN7的細胞毒性，采用它們的巧光素酶標記衍生物。涂布至少4小時后，如上述描述的，加入 T細胞。共同培養4小時后，將Promega化ight-Glo巧光素酶試劑（普洛邁格公司-Promega， 麥迪遜，威斯康星州）添加到每個孔中；5分鐘后，用板閱讀器Biotek化x800(BioTek，圖森， 亞利桑那州)檢測巧光并用Gen5 2.0數據分析軟件進行分析。
[0113] 異種移植實驗
[0114] 給NOD.Cg-PrkdcScid iL2rgtmiwji/SzJ(N0D/scid IL2RGnull)小鼠（杰克遜實驗室- Jackson Laborato巧，己爾港)腹膜內注射表達巧光素酶的化udi細胞（i.p. ;0.3x 106細胞 每小鼠）。一些小鼠在化udi接種后通過腹膜內接受利妥昔單抗（lOOyg)四天，在第5天和第6 天腹膜內注射或不注射人原代T細胞。T細胞用抗-CD3/CD28珠活化3天，經CD16V-BB-C受體 轉導，重懸于RPMI1640+10%FBS并隨后W每小鼠 lx 107細胞注射。每周重復注射利妥昔單 抗，4周，不進一步注射T淋己細胞。所有的小鼠接受腹膜內注射1000-2000IU的IL-2,每周兩 次，共四周。一組小鼠接受組織培養介質，而非利妥昔單抗或T細胞。
[0115] 利用Xenogen IVIS-200系統（CLS公司-Caliper Life Sciences,霍普金頓，馬薩 諸塞州)現慢腫瘤植入和增長。腹膜內注射D-巧光素鐘鹽(3毫克/小鼠）水溶液5分鐘后開始 成像，表達巧光素酶的細胞發出的光子用Living Image 3.0軟件定量測定。
[0116] ^
[0117] CD16V-BB-C 受體的表達
[0118] FCRG3A(CD16)的V158多態性，在約四分之一的個體中表達，編碼高親和免疫球蛋 白Fc受體并與對抗體療法的良好反應相關(25，26，29-31)。生成FCGR3A基因的VI58變體。其 與CD8a的較鏈區和跨膜區、T細胞刺激分子CD3C和共刺激分子4-1BB組合（圖1A) Jmai等， Leukemia 2004; 18:676-684。用含CD16V-BB-C構建物和GFP的MCSV逆轉錄病毒載體轉導來 自12個獻血者的外周血T淋己細胞:CD3+細胞的中值GFP表達為89.9%(75.3%-97.1%的范 圍）；在相同細胞中，由抗-CD16染色評估的中值嵌合受體表面表達是83.0 % (67.5 % - 91.8%)(圖1B)。經只含GFP的載體轉導的來自相同獻血者的T淋己細胞的中值GFP表達為 90.3%(67.8%-98.7%)，表達的〔0 16卻只有1.0%(0.1%-2.7%)(圖18)。〔04+和〔08巧細 胞之間受體的表達無顯著差異:69.8% ± 10.8%CD4+細胞為經CD16V-BB-C轉導后的CD 16 +，相比之下〔08+細胞為77.6%±9.2%(圖2)。
[0119] 為了保證表達嵌合受體的其他成分，CD3C的表達水平用流式細胞術進行測定。如 圖1B所示，CD16V-BB-C轉導的T淋己細胞中CD3C表達水平遠高于模擬轉導細胞:前者的平均 巧光強度的平均值（±SD)為45,985±16,365，后者為12,547±4,296。= 0.027，經*檢測;11 =3;圖1B)。也通過蛋白印跡法，用抗CD3C抗體探測測定嵌合蛋白的存在。如圖1C所示，除了 1化化的內源性CD3C，CD16V-BB-C-轉導的T淋己細胞在還原條件下還表達約25kDa的嵌合蛋 白。在非還原條件下，CD16V-BB-C蛋白被證明W單體或50kDa的二聚體形式表達。
[0120] V158與F158 CD16受體的抗體結合能力比對
[0121] 為了測試CD16V-BB-C嵌合受體對免疫球蛋白（Ig)的結合力，轉導來自3個獻血者 的外周血T淋己細胞。如圖3A所示，用利妥昔單抗溫育后，用抗體包被表達CD16V-BB-C的T淋 己細胞。用曲妥珠單抗和人IgG得到類似的結果。
[0122] 隨后比較包含FCRG3A(CD16)的高親和V158多態性的CD16V-BB-C受體的Ig-結合能 力與包含F158變體代替（"CD16F-BB-C")的相同受體相比。用任一受體轉導化rkat細胞后， 它們用利妥昔單抗和抗人Ig PE抗體(結合利妥昔單抗)溫育，陽巧光強度與GFP的巧光強度 相關。如圖3B所示，在任何給定的GFP水平，經CD16V-BB-C受體轉導的細胞與經CD16F-BB-C 受體轉導的細胞相比具有較高的PE巧光強度，表明前者有明顯更高的抗體親和力。曲妥珠 單抗和人IgG也與CD16V-BB-C受體W較高的親和力結合(圖4)。
[0123] 為了測定結合于CD16V-BB-C受體的抗體是否可W促進效應子和祀細胞的聚集，將 表達CD 16V-BB-C (和GFP)的化rkat細胞與CD20t)aud i細胞(巧黃綠素 AM紅-澄標記）W1:1的 比例混合60分鐘，添加或不添加利妥昔單抗來檢測GFP-巧黃綠素雙聯體的形成。在3個實驗 中，如果化rkat細胞表達CD16V-BB-C受體且存在利妥昔單抗，共同培養結果39.0% ± 1.9% 為雙聯體（圖3C和D)。相比之下，用人IgG而非利妥昔單抗，或用模擬轉導化rkat細胞(不論 利妥昔單抗是否存在），有巧％雙聯體。
[0124] 將IgG結合于CD16V-BB-C誘導T細胞活化、脫粒和細胞增殖
[0125] 評估了固定化抗體交聯的CD16V-BB-C受體是否能夠誘導T淋己細胞的活化信號。 事實上，當在包被有利妥昔單抗的板上培養時，CD16V-BB-C轉導的T淋己細胞顯著提高了 IL-2受體的表達(CD25)，而不存在抗體時或模擬轉導細胞(不論抗體是否存在）中沒有檢測 到變化(圖5A和B)。
[01 %]除了表達IL-2受體，用CD 107a染色法還檢測到交聯CD16V-BB-C受體觸發T淋己細 胞中裂解顆粒的胞吐。因此，在6個試驗中，其中來自4個獻血者的T淋己細胞要么接種于包 被有利妥昔單抗(n = 3)的微量滴定板上要么在利妥昔單抗(n = 3)存在下與Daudi細胞共同 培養，表達CD16V-BB-C的T淋己細胞成為CD107a陽性（圖5C)。
[0127]最后，確定了是否受體交聯能誘導細胞增殖。如圖加所示，表達CD16V-BB-C的T淋 己細胞在利妥昔單抗和化udi細胞與T淋己細胞1:1的比例)存在下擴增:在3個實驗中， 培養7天后平均T細胞恢復為輸入細胞的632% ( ± 97 % );培養4周后，為6877 % ( ± 1399 % )。 值得注意的是，在沒有祀細胞存在下，未結合的利妥昔單抗即使在很高的濃度（1-1化g/ml) 下，對細胞增殖無顯著影響，且若沒有利妥昔單抗或在模擬轉導T細胞中，不論是否存在抗 體和/或祀細胞，均不發生細胞生長（圖加）。因此，CD16V-BB-C受體交聯誘導導致持續增殖 的信號。
[012引表達CD16V-BB-C的T淋己細胞介導體外和體內的ADCC
[01巧]觀察到CD16V-BB-C交聯引起裂解顆粒的胞吐暗示了 CD16V-BB-CT淋己細胞在特異 性抗體存在時應可W殺傷祀細胞。事實上，在4小時的體外細胞毒性試驗中，CD16V-BB-CT淋 己細胞在利妥昔單抗存在下對B細胞淋己瘤細胞系Daudi和Ramos具有高細胞毒性：超過 50%的祀細胞通常在W2:1E:T比例下共同培養4小時后裂解（圖6和圖7)。相比之下，不存在 抗體時或在模擬轉導的T細胞中，祀細胞殺傷是低的（圖6和圖7)。值得注意的是，運些實驗 使用的效應細胞富含CD3巧淋己細胞(>98%)且和沒有檢出的CD3-CD56+NK細胞。利妥昔單 抗介導的CD16V-BB-CT淋己細胞也明顯對CD20+原發性化L細胞(n = 5)有細胞毒性;如圖6B 所示，在W2:化:T比例下共同培養4小時后細胞毒性通常超過70%。骨髓間充質基質細胞已 被證明發揮免疫抑制作用（Jeff eris,化t. Rev. Drug Discov.2009;8(3) :226-234 ; Clemenceau等，Blood 2006; 107(12): 4669-4677)。為了測試是否運會影響CD16V-BB-CT淋 己細胞的細胞毒能力，將它們與αχ細胞在有骨髓源性間充質基質細胞存在下Wi:2E:T的 比例共同培養24小時。如圖6C所示，間充質細胞并不能減少ADCC介導淋己細胞的殺傷能力。
[0130] 接下來，測定了是否不同的免疫治療抗體可觸發對表達相應抗原的腫瘤細胞的類 似細胞毒性。因此，CD16V-BB-CT淋己細胞對表達皿R2 (乳腺癌細胞系MCF-7和SK-BR-3 W及 胃癌細胞系MKN7)或GD2 (神經母細胞瘤細胞株CHLA-255、NB1691和SK-N-SH，和骨肉瘤細胞 系U2-0S)的實體瘤細胞的細胞毒性進行了測試。曲妥珠單抗被用來祀向HER2和 hul4.18K322A被用來祀向GD2dCD16V-BB-CT淋己細胞在有相應抗體存在下對運些細胞是高 細胞毒性的（圖6和圖7)。在NB1691實驗中，也測試了通過延長培養至24小時是否能W甚至 更低的E:T比例獲得細胞毒性。如圖8所示，在hul4.18K322A存在下Wl:8的比例，細胞毒性 超過50%。為進一步測試〔016￥-88-(介導的細胞殺傷的特異性，培養〔020+0曰11扣細胞與 CD16V-BB-CT淋己細胞和不同特異性的抗體：只有利妥昔單抗介導細胞毒作用，而在曲妥珠 單抗或hul4.18K322A存在時細胞毒性沒有提高（圖8)。最后，檢測了在免疫治療抗體存在 下，CD16V-BB-C介導的細胞殺傷是否可W被未結合的單體IgG抑制。如圖8所示，即使IgGW 比細胞結合的免疫治療抗體濃度高最多1000倍的濃度存在，T細胞細胞毒性是不會受影響。
[0131] 為了測量CD16V-BB-CT淋己細胞體內的抗腫瘤能力，利用移植有巧光素酶標記的 Daudi細胞的NOD/scid IL2RGnull小鼠進行實驗。用接受CD16V-BB-CT淋己細胞和利妥昔單 抗的小鼠活體成像來檢測腫瘤的生長，將它們的結果與單獨接受利妥昔單抗或T淋己細胞 的或不治療的結果比較。如圖9所示，所有小鼠中腫瘤細胞擴增，除了那些先后接受利妥昔 單抗和CD16V-BB-CT淋己細胞的小鼠。接受該組合的全部5只小鼠在腫瘤注射后大于120天 仍然處于消退期，相比之下，未接受治療或單獨接受抗體或細胞治療的12只小鼠中無一處 于消退期。在移植了神經母細胞瘤細胞系NB1691并用hul4.18K322A與CD16V-BB-CT淋己細 胞治療的小鼠中觀察到了很強的抗腫瘤活性(圖10)。
[0132] 比較CD16V-BB-C和其它受體
[0133] 比較了含有CD16V-BB-C或CD16F-BB-C受體的T細胞的功能。與低親和力的CD16F- BB-C受體相比，CD16V-BB-C受體誘導明顯更高的T細胞增殖和ADCC，與它們對IgG更高的親 和力一致(圖11)。
[0134] 接下來，比較了含有CD16V-BB-C的T細胞與表達具有不同信號傳導特性的其它受 體的T細胞的功能。運些包括沒有信號傳導能力的受體rcDiev-截短"），含有CD3C但沒有4- lBBrCD16V-C'）的，W及先前描述的CD16V與FceRI 丫跨膜區和胞漿區結合的受體（"CD16V- FceRI 丫 "）（Jeffe;ris,化t. Rev. Drug Disco V . 2009 ; 8(3) : 226-234 ; Clemenceau等， Blood2006; 107( 12): 4669-4677)(圖12)。逆轉錄病毒轉導后，在活化Τ細胞中所有受體被高 表達（圖13)。如圖14所示，與所有其它構建體相比，CD 16V-B Β-ζ誘導明顯更高的活化、增 殖和特定的細胞毒性。
[0135] 用mRNA電穿孔表達CD16V-BB-C受體
[0136] 在所有上述實驗中，CD16V-BB-C表達通過逆轉錄病毒轉導實施。測試了備選方法， mRNA電穿孔，是否也能賦予T淋己細胞ADCC能力。來自2個獻血者的活化T淋己細胞進行了電 穿孔并獲得了高表達效率：穿孔后24小時，55%和82%的T淋己細胞成為CD16+(圖15A)。在 第二獻血者中，也在第Ξ天測試了受體的表達，為43%，結果與先前的用另一個受體的實驗 結果類似，其中，表達持續72到96小時（藤崎等，Cancer Res. 2009 ;69(9) :4010-4017)。用 CD16V-BB-細RNA作電穿孔的Τ淋己細胞中ADCC被激活:在利妥昔單抗存在下，W2:化:Τ的比 例，4小時后80%的Ramos細胞被殺死，而沒用mRNA作電穿孔的細胞則沒有效果(圖15Β)。
[0137] ^
[0138] 本文描述了開發一嵌合受體，其賦予T淋己細胞發揮ADCC的能力。當CD16V-BB-C受 體與結合腫瘤細胞的抗體接合時，它觸發T細胞的活化、持續的增殖W及對抗體祀向的癌細 胞的特異性細胞毒性。CD16V-BB-CT淋己細胞對廣泛的腫瘤細胞類型具有高度的細胞毒性， 包括B細胞淋己瘤細胞、乳腺癌細胞、胃癌細胞、神經母細胞瘤細胞和骨肉瘤細胞，W及原發 性化L細胞。細胞毒性完全依賴于和祀細胞結合的特異性抗體的存在，未結合的抗體既不激 發非特異性細胞毒性，也不影響細胞結合抗體的細胞毒性。當CD16V-BB-CT細胞在間充質細 胞層培養時，它們也殺傷化L細胞，而不管運些微環境的已知的免疫抑制的影響(Jefferis， 化t.Rev.Drug Discov.2009;8(3):226-234;Clemenceau等，Blood 2006;107(12):4669- 4677)。此外，在利妥昔單抗后注入CD16V-BB-CT淋己細胞根除移植到免疫缺陷小鼠的B細胞 淋己瘤細胞，并在有抗GD2抗體存在下，在移植神經母細胞瘤細胞的小鼠體內具有相當大的 抗腫瘤活性。總之，表達CD16V-BB-C的T細胞在體外和體內實現強烈的ADCC。
[0139] CD 16對免疫球蛋白Fc部分的親和力是ADCC的關鍵決定因素，因此，影響抗體免疫 治療的臨床反應。所W，正在做相當多的努力W進一步提高化片段對化丫 R的親和力，例如 通過糖工程（Nimme;rjahn等.，Nat.