>[0051] 如本說明書和所附權利要求書中所用，單數形式"一"，"一個"和"該"包括復數引 用，除非上下文另有明確說明。
[0052] 按照本發明，可采用本領域常規的分子生物學，微生物學，和重組DNA技術。運些技 術在文獻中有充分解釋。參見，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，分子克隆:實驗室手冊， 第二版（1989)，冷泉港實驗室出版社（Cold Spring化rbor LaboratoiT Press),冷泉港， 紐約（本文中，"Sambrook等，1989") ;DNA克隆：一種實用方法，卷I和II(D.N.Glover編 1985);寡核巧酸合成（Oligonucleotide Synthesis) (MJ.Gait編 1984);核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization) (B.D.化mes&S.J.Higgins編（1985〉〉；轉錄和翻譯（Transcription and Translation) (B. D.化mes&S. J .Higgins ,編（1984〉〉；動物細胞培養（Animal Cell Qilture)(R. I.Rreshney,編（1986〉〉；固定化細胞和酶（Immobilized Cells and Enzymes) (1化出版社，（1986〉〉；B.Pe;rbal,分子克隆實踐指南（A practical Guide To Molecular Cloning)(1984);F.M.Ausubel 等編，分子生物學最新方案（Current Protocols in Molecular Biology)，，約翰韋利父子股份有限公司（John Wi 1 巧&Son, Inc s)(1994)等。
[0053] 本發明的嵌合受體
[0054] 本發明提供了一種嵌合受體，其包含(a)F158 FCGR3A或V158 FCGR3A變體的胞外 配體結合區（例如，SEQIDN0:16或SEQIDN0:2，各自地）；（b)CD8α的較鏈區和跨膜區（例 如，SEQ ID ^:3);和山)包含4-1BB信號傳導區（例如，SEQ ID N0:4)和CD3C信號傳導區（例 如，SEQ ID NO:5)的胞漿區。所述嵌合受體可進一步包含CD8a的信號膚，例如，SEQ ID NO: 6。在一【具體實施方式】中，所述嵌合受體包含如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15所示的氨基酸 序列。在一實施例中，所述嵌合受體為由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列組成的CD16V-BB-C。 在另一實施例中，所述嵌合受體為由SEQ ID ^:15所示氨基酸序列組成的〔016。-88-(。
[0055] 在一實施方式中，本發明所述嵌合受體除了包含本文所描述的兩個信號傳導區， 良P，CD3C和4-1BB/CD137,還包含一個或多個信號傳導區。在一【具體實施方式】中，一些信號傳 導區融合在一起W達到加和或協同作用。有用的其他信號傳導區的非限制性實施例包括來 自于 W下的部分或全部：選自 TCRC鏈、CD28、0X40/CD134、4-lBB/CD137、FceRIy、IC0S/ CD278、ILRB/CD122、比-2RG/CD132 和 CD40 的一個或多個。
[0056] 本發明還提供了編碼W上公開的嵌合受體的多核巧酸。在一【具體實施方式】中，所 述編碼V158FCGR3A變體胞外配體結合區的多核巧酸包含SEQ ID NO: 10所示的核巧酸序列。 或者，所述編碼F158FCGR3A胞外區的多核巧酸包含SEQIDN0:18所示的核巧酸序列。在一
【具體實施方式】中，所述編碼CD8a較鏈區和跨膜區的多核巧酸包含SEQ ID NO: 11所示的核巧 酸序列。在一【具體實施方式】中，所述編碼4-1BB信號傳導區的多核巧酸包含SEQ ID NO: 12所 示核巧酸序列。在一【具體實施方式】中，所述編碼CD3C信號傳導區的多核巧酸包含SEQ ID NO: 13所示的核巧酸序列。在一【具體實施方式】中，所述編碼CD8a信號膚的多核巧酸包含SEQ ID NO: 14所示的核巧酸。
[0化7] 在一實施例中，所述編碼CD16V-BB-C嵌合受體的多核巧酸包含SEQ ID N0:9所示 的核巧酸序列。在另一實施例中，所述編碼CD16F-BB-C嵌合受體的多核巧酸包含SEQ ID NO: 17所示的核巧酸序列。
[0058] 結合所述多核巧酸，本發明還提供了包含此類多核巧酸的載體(包括運樣的載體， 其中，此類多核巧酸可操作地連接于至少一個調控元件，用于表達該嵌合受體）。本發明有 用載體的非限制性實施例包括病毒載體，如逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。
[0059] 在一【具體實施方式】中，此類載體還包括自殺基因。如本文所用，術語"自殺基因"是 指引起表達該自殺基因的細胞死亡的基因。所述自殺基因可W是一種基因，其賦予給予表 達該基因的細胞對某種試劑(例如，藥物）的敏感性，當細胞與該試劑接觸或暴露于該試劑 中時其引起細胞死亡。自殺基因為本領域已知的（參見，例如，自殺基因治療:方法和綜述 (Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews) .Springer,Carol ine J.(癌癥石開究戶/f- 癌癥治療的癌癥研究英國中屯、-Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,薩頓，薩里郡，英國），Humana 出版社，2004)，包 括，例如單純瘤疹病毒化SV)胸巧激酶(TK)基因、胞喀晚脫氨酶山7*〇31110 daminase)、嚷嶺 核巧憐酸化酶、硝基還原酶和脫冬酶，如脫冬酶8。
[0060] 本發明還提供了包含如上公開的嵌合受體的宿主細胞。有用的宿主細胞的非限制 性實施例包括T淋己細胞和NK細胞，它們可W是自體的或異體的（移除了或保留了內源性T 細胞受體）.在一【具體實施方式】中，所述宿主細胞是分離自癌癥患者的自體T淋己細胞。在一
【具體實施方式】中，此類自體T淋己細胞經離體活化或擴增。
[0061] 本發明的嵌合受體可通過本領域已知的任何方法引入該宿主細胞。特別有用的方 法的非限制性實施例包括逆轉錄病毒轉導、慢病毒轉導W及DNA和mRNA電穿孔。如下實施例 所證實的，mRNA電穿孔導致本發明嵌合受體在T淋己細胞中有效表達。描述逆轉錄病毒轉導 的文獻示例包括:Anderson等，美國專利號5,399,346;Mann等，Cell 33:153(1983) ;Temin 等，美國專利號 4,650,764;Temin等，美國專利號4,980,289;Markowitz等，J.Virol.62: 1120( 1988);Temin等，美國專利號5，124，263;國際專利公布號W0 95/07358，公布于1995年 3月16日，Dou曲erty等；W及Kuo等，Blood 82:845(1993)。國際專利公布號W0 95/07358描 述了原代B淋己細胞的高效轉導。可采用的逆轉錄病毒轉導和mRNA電穿孔的具體技術的實 例還可參見W下實施例部分。
[0062] 宿主細胞活化和擴增通常用于將病毒載體整合進基因組并表達編碼本發明嵌合 受體的基因。然而，如果使用了mRNA電穿孔，不需要活化或擴增(雖然電穿孔在活化細胞中 更有效）。作為病毒轉導的結果，宿主細胞(T淋己細胞或NKT細胞)長時間表達本發明的嵌合 受體，從而可能提供比mRNA電穿孔更強的效果，mRNA電穿孔時受體是瞬間表達的（通常3-5 天）。然而，病毒轉導復雜、昂貴且難W實施，而mRNA電穿孔簡單很多且更容易實施。另外，如 果存在潛在的毒性，那瞬間表達是有利的且因可能的副作用其應該在臨床檢測初期有用。 [006引本發明的藥物組合物
[0064] 本發明的另一方面提供了藥物組合物。在一實施方式中，本發明提供了藥物組合 物，其包含(i)編碼本發明的嵌合受體的多核巧酸或包含此類多核巧酸的載體，和（ii)藥學 上可接受的載體或賦形劑。
[0065] 在另一實施方式中，本發明提供了一種藥物組合物，其包含（i)包含本發明嵌合受 體的宿主細胞和（ii)藥學上可接受的載體或賦形劑。在一【具體實施方式】中，該藥物組合物 進一步包含能對癌癥細胞產生細胞毒性的單克隆抗體（如，利妥昔單抗、曲妥珠單抗、 hul4.18K322A等）或另一種包含Fc部分的抗腫瘤分子(例如，由結合腫瘤表面受體的配體 (如細胞因子、免疫細胞受體)與免疫球蛋白的Fc-部分或包含Fc的DNA或RNA構成的復合分 子)。
[0066] 用于本發明藥物組合物的適宜賦形劑可W是本領域技術人員所熟知的，可，例如， 包括組織培養基（例如用于細胞離體存活）或生理鹽水溶液（例如，當將細胞注射給患者 時）。藥學上可接受的賦形劑的透徹討論可在《雷明頓藥學科學HRemington's Pharmaceut i ca 1 Sc i ences)(馬克出版社，新澤西州1991)中獲得。
[0067] 必要時，本發明藥物組合物還可包含一種或多種額外的活性化合物，用于正在接 受治療的適應癥，較佳地，是具有互補作用且不負面影響彼此的活性化合物。可能的額外活 性化合物的非限制例子包括，例如，IL2W及在組合療法的討論中列出的各種試劑。
[00側本發明的治療方法
[0069] 本發明的嵌合受體賦予T淋己細胞抗體依賴性細胞毒性(ADCC)性能并增強NK細胞 中的抗體依賴性細胞毒性。當所述受體與結合于腫瘤細胞的抗體(或另一包含Fc部分的抗 腫瘤分子)接合，它會觸發T細胞活化、持續擴增和該抗體(或包含化部分的此外其它抗腫瘤 分子)所祀向的癌細胞的特異性細胞毒性。如下面實施例部分公開的，包含本發明的受體的 T淋己細胞對廣泛的腫瘤細胞類型具有高細胞毒性，包括B細胞淋己瘤、乳腺癌、胃癌、神經 母細胞瘤和骨肉瘤，W及原發性慢性淋己細胞性白血病(CLL)。細胞毒性完全依賴于結合于 祀細胞的特異性抗體的存在:可溶性抗體不引起裂解顆粒的胞吐并不引起非特異性細胞毒 性。CD 16與Ig的化部分的親和力是ADCC進而對抗體免疫治療的臨床反應的關鍵決定因素。 具有158V多態性的CD 16選為例子;該變體對Ig具有高親和力且介導優越的ADCC。
[0070] 由于一種受體能夠用于多種癌癥細胞類型，本發明的嵌合體受體促進T細胞療法。 它還允許同時祀向多種抗原，考慮到腫瘤利用的免疫逃脫機制，該策略最終可能有利 (Gru卵等，N.Engl. J.Med. 2013;368(16) :1509-1518)。無論何時需要，通過簡單停止施用抗 體，可停止抗體導向的細胞毒性。因為表達本發明嵌合受體的T細胞只被結合于祀細胞的抗 體激活，未結合的免疫球蛋白對注入的T細胞不應有任何刺激。通過使用mRNA電穿孔W瞬時 表達嵌合受體W限制任何潛在的自體免疫反應性，可W進一步提高臨床安全性。
[0071] 下面在實施例部分中披露的結果表明自體T細胞的注入（用本發明嵌合受體作基 因修飾后經離體活化和擴增W及重新注入)應該顯著促進ADCC。因為組合的CD3C/4-1BB信 號傳導也引起T細胞增殖，在腫瘤部位應該有活化T細胞的積累，可能進一步增強它們的活 性。
[0072] 因此，在一實施方式中，本發明提供用于提高有此需要的個體中癌癥的基于抗體 免疫療法的療效的方法，所述個體正在接受抗體的治療，該抗體可W結合于癌細胞并具有 可結合于人CD16的人源化化部分，所述方法包括往所述個體中引入治療有效量的T淋己細 胞或NK細胞，該T淋己細胞或NK細胞包含本發明的嵌合受體。
[0073] 在另一實施方式中，本發明提供了提高個體中T淋己細胞或NK細胞ADCC活性的方 法，包括給所述個體施用T淋己細胞或NK細胞，該T淋己細胞或NK細胞包含本發明的嵌合受 體。在一實施方式中，所述個體患有癌癥。在一【具體實施方式】中，該個體正在接受能結合癌 細胞的抗體治療。
[0074] 在上述方法的一實施方式中，所述T淋己細胞或NK細胞是分離自個體的自體T淋己 細胞或NK細胞。在一特定實施方式中，在重新引入個體之前，所述自體的T淋己細胞或NK細 胞離體活化和/或擴增。在另一實施方式中，T淋己細胞或NK細胞是同種異體T淋己細胞或NK 細胞。在一【具體實施方式】中，T淋己細胞是同種異體T淋己細胞，其中內源性T細胞受體的表 達被抑制或消除。在一【具體實施方式】中，在引入個體之前，同種異體T淋己細胞離體活化和/ 或擴增。T淋己細胞可W用本領域任何已知的方法活化，例如，在抗-CD3/CD28、比-2和/或植 物凝集素存在下。NK細胞可W用本領域任何已知的方法活化，例如，在一個或多個選自下組 的試劑存在下：CD 137配體蛋白、CD 137抗體、化-15蛋白、比-15受體抗體、化-2蛋白、比-12 蛋白、化-21蛋白和K562細胞系。參見，例如，美國專利號7，435，596和8，026，097中描述的擴 增Μ細胞的有用方法。
[0075] 在上述方法的一實施方式中，通過逆轉錄病毒轉導、慢病毒轉導或DNA或RNA電穿 孔將所述嵌合受體引入Τ淋己細胞或ΝΚ細胞(例如，在離體活化和/或擴增后）。
[0076] 在上述方法的一實施方式中，將Τ淋己細胞或ΝΚ細胞引入(或重新引入)個體中，然 后給個體施用治療有效量的IL-2。
[0077] 本發明的嵌合受體可用于治療任何癌癥，包括但不限于，腺癌、淋己瘤、肉瘤、母細 胞瘤和白血病，對于運些疾病，存在或能產生具有與CD16結合的Fc部分的特異性抗體。可W 用本發明的嵌合受體治療的癌癥的具體非限制性例子包括，例如，B細胞來源的癌癥(例如， B系急性淋己細胞性白血病、B細胞慢性淋己細胞性白血病和B細胞非霍奇金淋己瘤）、乳腺 癌、胃癌、神經母細胞瘤、骨肉瘤。
[0078] 可通過本發明方法提高其療效并包含可結合人CD16的抗癌抗體的非限制性例子 包括，例如，利妥昔單抗、曲妥珠單抗、hul4.18K322A、依帕珠單抗、西妥昔單抗和拉貝珠單 抗（Labetuzumab)。
[0079] 所用抗體的適當劑量將取決于要治療的癌癥類型、疾病的嚴重程度和病程、之前 的治療方法、病人的臨床病史及對抗體的反應和主治醫生的判斷。可W-次性或通過一系 列的治療向病人施用所述抗體。可W簡單地通過傳統的技術及試驗監測本發明所述治療的 進展。
[0080] 可W用任何合適的路線施用抗體，包括，全身用藥W及向疾病部位(例如，對原發 性腫瘤)直接施用。
[0081] 本發明所述方法中使用的T淋己細胞最好是病人自己的細胞（即，自體細胞），運些 細胞早先用標準方法從血液樣本中分離且優選經離體活化和擴增(例如，3-5天），例如，抗- CD3/CD28珠、化-2或植物凝集素等。或者，可W使用同種異體T淋己細胞(較佳地，其中內源 性了細胞受體的表達被抑制或消除的同種異體1'淋己細胞）。560 1'〇'11?11等，81〇〇(1，2〇12 119:5697-5705。分離后(和任選的活化和/或擴增），來自病人的T淋己細胞及NK細胞用編碼 本發明嵌合受體的多核巧酸(或包含此類多核巧酸的載體)轉導，從而所述嵌合受體在T細 胞或NK細胞的細胞表面表達。然后被修飾的細胞可施用于患者(例如，治療性抗體注入后1 天)。
[0082] 根據本發明，患者可W通過輸注治療有效劑量(在每公斤體重約105至l〇w的范圍 內或更多的細胞(細胞/千克））的包含本發明嵌合受體的T淋己細胞或NK細胞來治療。只要 患者可W耐受，可W經常或多次重復輸注直至達到所需的反應。病人不同，適宜的輸注劑量 和安排也不同，但可W由主治醫生為特定病人決定。通常情況下，會輸注大約1〇6細胞/Kg的 初始劑量，逐步上升到1〇8或更多細胞/Kg。輸注后可W共同施用IL-2來擴增輸注的細胞。 IL-2的量可為約1-5X 106國際單位每平方米身體表面積。
[0083] 本發明所述方法中使用的NK細胞可通過暴露于細胞優先擴增，該細胞缺乏主要組 織相容性復合物I和/或II分子或表達不佳W及已經被基因修飾W表