專利名稱：一株綠色木霉及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物防治植物病害領域。具體而言，本發明涉及一種能夠高效防治植物土傳病害的綠色木霉及其用途，以及采用該綠色木霉制備的生物防治制劑。
背景技術：
植物土傳病害是一類重要的植物病害，包括根腐病、立枯病、猝倒病、枯萎病等等。真菌、細菌、線蟲、病毒都是引起土傳病害的土傳病原物，它們通常侵染植物根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的經濟損失。對于植物土傳病害的防治，常規采用的方法包括傳統的化學防治、培育抗病品種以及生物防治。化學防治和抗病品種目前只對少數土傳病害有效，對大多數病害防效甚微，且使用化學農藥還會造成農藥殘留，造成環境污染；同時，化學農藥的長期使用，使得病原·菌對其產生抗藥性，導致防效下降甚至失敗。生物防治由于克服了化學防治的上述弊病，且研究和實踐已證明其對部分土傳病害經濟有效，因而成為防治土傳病害研究的熱點，越來越受到人們的重視。木霉(Trichoderma spp.)屬于半知菌類的絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科,是一類廣泛分布于土壤、空氣、枯枝落葉及各種發酵物上的真菌，從植物根圈、葉片及種子、球莖表面均可以分離到。木霉通過產生抗生素、營養競爭、重寄生、細胞壁降解酶以及誘導植物產生抗性等機制，對于多種植物病原菌具有拮抗作用，可抑制多種植物病害，是目前生防菌株中研究最為廣泛的菌株之一。木霉對植物病原菌的生物防治機制是多樣而復雜的，常常是多種機制共同作用的結果，不同的菌株生防機制的側重點不同，其生防作用效果與菌株類型、病原真菌的類型、作物類型和環境條件密切相關。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于高效防治植物土傳病害的新的木霉菌株——綠色木霉。本發明的綠色木霉菌株具有生長速度快、產孢量大、作用譜廣、抗逆性強，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。本發明的另一個目的是提供一種采用該新的綠色木霉制備的能夠高效防治植物土傳病害的生物防治制劑。本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的本發明提供一種綠色木霉，所述綠色木霉的保藏編號為CGMCC No. 5044。本發明所提供的菌株為綠色木霉(Trichoderma viride) LLM-001,是從五蓮縣蘑菇上分離獲得的，已于2011年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. 5044。其具有以下生物學特性在PDA瓊脂培養基上生長快，30°C黑暗條件下培養3d，菌落直徑70_。菌落初期白色稀疏，后期形成黃綠色產孢區。反面無色。菌絲聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝輪廓，分枝末端的小梗束生、對生、互生或單生，瓶形，4. 5-10 X 2. 5-3. 5 Pm。分生孢子橢球形、單個，近無色，聚集時呈淡綠色，壁稍粗糙，
3.5-5 X 3-4 u mD 該菌株的rRNA基因序列測定 結果(ITS-5. 8S-ITS2區)如下 GGGCCCGGGATCTACTGATCGAGGTCACATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAMCTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGGCGGCCCGGTGAGGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGMTACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAMGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAMGTTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAMGGCTCAGAGCAAAAATAAMCAGAGCCGCGACGGGAGCCGCGACGGAGAGAAAAMGAGTTTGGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCMGAGAATCCCGCCGAGGCAACAGATTGGTAACGTTCACATTGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGTT本發明綠色木霉菌(Trichodermaviride)LLM_001 (CGMCC No. 5044)的培養方法或繁殖方法包括 (I)普通培養保存采用PDA培養基，配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL。(2)實驗室液體培養采用PDB培養基，配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水IOOOmLo(3)固體培養基配方固料和無機鹽溶液，按質量比I : I. 8的比例配制。其中所述固料由質量比為60 40的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液包括
3.5%磷酸二氫鉀，0. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。(4 )大量發酵培養基配方同(3 )中固體培養基配方。本發明還提供一種用于防治植物土傳病害的生物防治制劑，所述生物防治制劑包括所述的綠色木霉；優選地，所述生物防治制劑包括所述的綠色木霉發酵原粉。進一步優選地，所述綠色木霉發酵原粉由包括以下步驟的方法進行制備(I)制備所述綠色木霉的種子液；(2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養基中，28°C下恒溫培養；(3)將步驟(2)培養的培養物用無菌水按質量比I : 15的比例混合，過濾，將濾液接種至大量發酵培養基，在室溫28°C、相對濕度85%以上的條件下(例如在室溫28°C、相對濕度85%以上的發酵室中)進行發酵培養。 其中，步驟(2 )中的固體培養基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶液的比例為質量比I : I. 8 ;所述固料由質量比為60 40的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液包含3. 5%磷酸二氫鉀，0. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。并且，步驟(3)中的大量發酵培養基同固體培養基。并且，本發明還提供了一種用于防治植物土傳病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土傳病害的植物施用上述綠色木霉或者上述生物防治制劑。本發明也提供了上述綠色木霉或者上述生物防治制劑在防治植物土傳病害中的用途。
就上述生物防治制劑、生物防治方法以及用途而言，所述植物土傳病害可以選自灰霉病、猝倒病、疫病、根腐病、立枯病、枯萎病、黃萎病、蔓枯病、青枯病、菌核病、白粉病、褐紋病、綿腐病和綿疫病中的一種或多種；優選地，所述植物土傳病害為灰霉病和/或猝倒病。本發明所述的生物防治制劑的制備方法包括以下步驟( I)制備所述綠色木霉的種子液；(2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養基中，28°C下恒溫培養；(3)將步驟(2)培養的培養物用無菌水按質量比I : 15的比例混合，過濾，將濾液接種至大量發酵培養基，在室溫28°C、相對濕度85%以上的條件下(例如在室溫28°C、相對濕度85%以上的發酵室中)進行發酵培養。其中，步驟(2 )中的固體培養基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶液·的比例為質量比I : I. 8 ;所述固料由質量比為60 40的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液包含3. 5%磷酸二氫鉀，0. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。并且，步驟(3)中的大量發酵培養基同固體培養基。在本發明的一個具體實施方案中，所述制備方法包括以下步驟(I)將所述綠色木霉的孢子移到PDB液體培養基中，28°C搖床振蕩培養3飛天得到種子液；(2)將步驟(I)制備的種子液按質量比10%的比例接種到固體培養基中，28°C培養3 5天；(3)將步驟(I)培養的培養物用無菌水按質量比I : 15的比例混合，過濾，將濾液按體積比I : 6的比例接種至大量發酵培養基，在室溫28°C、相對濕度85%以上的條件下(例如在室溫28°C、相對濕度85%以上的發酵室中)發酵培養8、天。其中，步驟(I)中的所述PDB液體培養基包含去皮馬鈴薯0. 2g/mL,葡萄糖0. 02g/mL，剩余為蒸懼水；步驟(2)中的固體培養基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶液的比例為質量比I : I. 8;所述固料由質量比為60 40的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液包含3. 5%磷酸二氫鉀，0. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水；步驟(3)中的大量發酵培養基同步驟(2)的固體培養基。實驗表明，本發明的綠色木霉菌株具有生長速度快、產孢量大、作用譜廣、抗逆性強，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。由該綠色木霉制備的生物防治制劑，不僅能夠高效的防治植物土傳病害，還能有效提高作物產量，是一種極具應用前景的生物防治制劑。該微生物制劑可以作為生物農藥或生物肥料，防治多種土傳植物病害，包括灰霉病、猝倒病、疫病、根腐病、立枯病、枯萎病、黃萎病、蔓枯病、青枯病、菌核病、白粉病、褐紋病、綿腐病、綿疫病等。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例II、綠色木霉菌(Trichoderma viride) LLM-001 (CGMCC No. 5044)的分離與純化本發明的綠色木霉(Trichodermaviride)LLM_001 (CGMCC No. 5044)是從五蓮縣蘑菇上采用平板劃線法分離獲得的，分離方法為⑴木霉菌株的分離取受害嚴重的蘑菇菌包，先用75%的酒精局部處理lmin，再在超凈工作臺上用紫外燈處理20min后，用滅菌刀片切開處理部位，用接種針挑取少量木霉菌孢子，在PDA平板上劃線，定時觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化木霉菌株，轉至PDA試管斜面保存備用。⑵黃瓜灰霉病高效拮抗木霉菌株的篩選
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①初篩采用對峙培養法，制備PDA平板，用打孔器在木霉菌和黃瓜灰霉病菌邊緣打取直徑為5_的菌餅，分別移植在平板相對的兩側中央，25°C恒溫培養，逐日觀察木霉菌對病原菌的抑制作用。②復篩將篩選到的具有高效拮抗活性的木霉菌株進行復篩，主要是經過耐溫性、耐酸堿性、耐藥性試驗，篩選到耐性較好的木霉菌株，進行盆栽防治試驗和田間試驗。本發明人通過大量篩選工作得到一株能夠高效防治植物土傳病害的綠色木霉(Trichoderma viride)LLM_001 (CGMCC No. 5044)。實驗證明，該綠色木霉發酵原粉在防治土傳病害的代表性大棚種植試驗中，對辣椒猝倒病和黃瓜灰霉病都顯示出非常高效的防治效果，使得農作物顯著增產。因而，本發明的綠色木霉是具有廣泛應用前景的綠色木霉新菌株，可以用于制備防治植物土傳病害的生物防治制劑。2、菌株鑒定(I)微生物學特性在PDA瓊脂培養基上生長快，30°C黑暗條件下培養3d，菌落直徑70mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黃綠色產孢區。反面無色。菌絲聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝輪廓，分枝末端的小梗束生、對生、互生或單生，瓶形，4. 5-10X 2. 5-3. 5 Pm。分生孢子橢球形、單個，近無色，聚集時呈淡綠色，壁稍粗糙，
3.5-5 X 3-4 u mD(2)分子生物學特性該菌株的rRNA基因序列測定結果(ITS-5. 8S-ITS2區)如下GGGCCCGGGATCTACTGATCGAGGTCACATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAMCTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGGCGGCCCGGTGAGGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGMTACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAMGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAMGTTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAMGGCTCAGAGCAAAAATAAMCAGAGCCGCGACGGGAGCCGCGACGGAGAGAAAAMGAGTTTGGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCMGAGAATCCCGCCGAGGCAACAGATTGGTAACGTTCACATTGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGTT其中，PDA培養基配方馬鈴薯200g(去皮)，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。實施例2
I、綠色木霉菌發酵過程PDB培養基配方馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。大量固體發酵培養基配方(質量百分含量)固料玉米芯60%，麩皮40%無機鹽溶液磷酸二氫鉀3. 5%，硫酸鎂O. 04%,硫酸銨4%，剩余為水。固液比為I : 1.8 (質量比)綠色木霉(Trichodermaviride) LLM-001 (CGMCC No. 5044)大量固體發酵過程①菌種種子液培養將綠色木霉菌(Trichoderma viride) (LLM-001) CGMCC·No. 5044從試管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液體培養基中，28°C搖床振蕩培養3 5d，此為種子液。②固體生產菌種的培養將種子液按10%的比例接種到固體培養基(500mL三角瓶)中，28°C恒溫培養3飛d，中間多次振蕩。③大量固體發酵將②中固體培養的培養物用無菌水按I : 15比例稀釋，并用滅菌紗布過濾，出去粗渣，即為生產菌液，接種比例按I : 6接種于大量發酵培養基。將接種的原料置于發酵室(28°C和相對濕度85%以上)中發酵培養8、d，將發酵室中的發酵物粉碎即可得到綠色木霉發酵原粉。實施例3本實施例提供了綠色木霉(Trichodermaviride)LLM_001 (CGMCCNo. 5044)(以下簡稱為綠色木霉LLM-001)原粉對黃瓜灰霉病防病增產的相關實驗。I、供試藥劑綠色木霉LLM-001原粉(實施例2中制備)40%咪霉胺可濕性粉劑(山東壽光雙星農藥有限公司生產，市售)。2、供試作物與防治對象供試作物為黃瓜，品種為長春密刺；防治對象為灰霉病。3、試驗地情況試驗地設在山東省壽光黃瓜大棚種植基地,該基地大棚黃瓜灰霉病近幾年發生嚴重，且防治困難，試驗在600平方米(0. 9畝)黃瓜大棚內，土質為輕壤土，有機質含量為I. 09%，pH值為6. 7，所有試驗小區栽培條件及管理措施一致，施藥時黃瓜灰霉病處于發病初期。4、試驗設計及安排本試驗設綠色木霉LLM-001原粉10倍，40%咪霉胺可濕性粉劑600倍液及不施藥清水作對照共3個處理，重復4次，共12個小區，各小區隨機排列，小區面積為20m2。于2011年2月6日、2月13日和20日各噴藥一次，將植株葉片上下噴灑均勻、周到，噴藥時用塑料布遮擋，畝用藥液60kg，噴藥器械為工農-16型噴霧器。5、試驗調查及計算方法(I)氣象條件第I次施藥(2011年2月6日)當日晴，風力3級，最高氣溫為12°C，最低氣溫為5°C，相對濕度為75%。第2次施藥(2011年2月13日)，當日晴漸多云，風力4級，最高氣溫為13°C，最低氣溫為2°C，相對濕度為70%;第3次施藥(2011年2月20日)當日多云，風力3級，最高氣溫為10°C，最低氣溫為IV，相對濕度為80%。因塑料大棚環境條件相對穩定，所以該氣候對藥效沒有影響。(2)藥效及安全性調查藥效調查第I次施藥后第7d和最后一次施藥后14d進行調查。每小區采用4點取樣法，每點查2株，調查全部葉片，調查發病率，記錄病情級數并計算病情指數。安全性調查于第一次施藥后7d和14d觀察黃瓜的安全性，如有藥害發生，詳細描述藥害癥狀并按藥害程度分級標準確定藥害程度。分級方法(以葉片為單位)O級無病斑I級病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級病斑面積占整個葉面積的6%_10% ；5級病斑面積占整個葉面積的11%_25% ；7級病斑面積占整個葉面積的26%_30% ；9級病斑面積占整個葉面積的50%以上；(3)調查時間和次數施藥前調查病情基數，下次施藥前及末次施藥后IOd調查防治結果。(4)藥效計算方法藥效按式(I)、(2)計算
權利要求
1.一種綠色木霉，其特征在于，所述綠色木霉的保藏編號為CGMCCNo. 5044。
2.一種用于防治植物土傳病害的生物防治制劑，其特征在于，所述生物防治制劑包括根據權利要求I所述的綠色木霉； 優選地，所述生物防治制劑包括根據權利要求I所述的綠色木霉發酵原粉。
3.根據權利要求2所述的生物防治制劑，其特征在于，所述綠色木霉發酵原粉由包括以下步驟的方法進行制備 (1)制備所述綠色木霉的種子液； (2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養基中，28°C下恒溫培養； (3)將步驟(2)培養的培養物用無菌水按質量比I: 15的比例混合，過濾，將濾液接種至大量發酵培養基，在室溫28°C、相對濕度85%以上的條件下進行發酵培養； 其中，步驟(2 )中的固體培養基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶液的比例為質量比I : I. 8;所述固料由質量比為60 40的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液包含3. 5%磷酸二氫鉀，O. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水；并且，步驟(3)中的大量發酵培養基同步驟(2)中的固體培養基。
4.根據權利要求3所述的生物防治制劑，其特征在于，所述植物土傳病害選自灰霉病、猝倒病、疫病、根腐病、立枯病、枯萎病、黃萎病、蔓枯病、青枯病、菌核病、白粉病、褐紋病、綿腐病和綿疫病中的一種或多種；優選地，所述植物土傳病害為灰霉病和/或猝倒病。
5.一種用于防治植物土傳病害的生物防治方法，其特征在于，所述生物防治方法包括向具有植物土傳病害的植物施用根據權利要求I所述的綠色木霉或者根據權利要求2至4中任一項所述的生物防治制劑。
6.根據權利要求5所述的生物防治方法，其特征在于，所述植物土傳病害選自灰霉病、猝倒病、疫病、根腐病、立枯病、枯萎病、黃萎病、蔓枯病、青枯病、菌核病、白粉病、褐紋病、綿腐病和綿疫病中的一種或多種；優選地，所述植物土傳病害為灰霉病和/或猝倒病。
7.根據權利要求I所述的綠色木霉或者根據權利要求2至4中任一項所述的生物防治制劑在防治植物土傳病害中的用途； 優選地,所述植物土傳病害選自灰霉病、猝倒病、疫病、根腐病、立枯病、枯萎病、黃萎病、蔓枯病、青枯病、菌核病、白粉病、褐紋病、綿腐病和綿疫病中的一種或多種；優選地，所述植物土傳病害為灰霉病和/或猝倒病。
8.一種根據權利要求2至4中任一項所述的生物防治制劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟 (O制備根據權利要求I所述的綠色木霉的種子液； (2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養基中，28°C下恒溫培養； (3)將步驟(2)培養的培養物用無菌水按質量比I: 15的比例混合，過濾，將濾液接種至大量發酵培養基，在室溫28°C、相對濕度85%以上的條件下進行發酵培養； 其中，所述步驟(2 )中的固體培養基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶液的比例為質量比I : I. 8，所述固料由質量比為60 40的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液包括3. 5%磷酸二氫鉀，O. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水； 步驟(3)中的大量發酵培養基同步驟(2)中的固體培養基。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟(1)將根據權利要求I所述的綠色木霉的孢子移至PDB液體培養基中，28°C搖床振蕩培養3飛天得到種子液； (2)將步驟(I)制備的種子液按質量比10%的比例接種到固體培養基中，28°C培養3 5天; (3)將步驟(I)培養的培養物用無菌水按質量比I: 15的比例混合，過濾，將濾液按體積比I : 6的比例接種至大量發酵培養基，在室溫28°C、相對濕度85%以上的條件下發酵培養8、天。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的PDB液體培養基包含去皮馬鈴薯O. 2g/mL，葡萄糖O. 02g/mL，剩余為蒸餾水； 所述步驟(2)中的固體培養基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶液的比例為質量比I : I. 8;所述固料由質量比為60 40的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液包含3. 5%磷酸二氫鉀，O. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水； 所述步驟(3)中的大量發酵培養基同步驟(2)中的固體培養基。
全文摘要
本發明提供一種綠色木霉及其應用。本發明提供的綠色木霉的保藏編號為CGMCC No.5044，具有生長速度快、產孢量大、作用譜廣、抗逆性強，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，可以用于防治植物土傳病害。由該綠色木霉制備的生防制劑，不僅能夠高效的防治植物土傳病害，還能有效提高作物產量，是一種極具應用前景的生防制劑。
文檔編號A01N63/04GK102787075SQ20121017766
公開日2012年11月21日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者湯潔 申請人:北京雷力農用化學有限公司