專利名稱：一種茶樹菇菌株及制備方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，具體涉及茶樹菇菌株KMFJ-FC及制備方法。
背景技術：
茶樹燕茶樹燕是擔子菌亞門,擔子綱、蘑燕菌目、糞傘科、田頭菇屬，又名柱狀田頭菇、楊樹菇、茶薪菇、柱狀環銹傘、柳松茸等。茶樹菇是一種高蛋白，低脂肪，無污染，無藥害，集營養、保健、理療于一身的純天然食用菌。據國家食品質量監督檢驗中心測定，它富含人體所需的天門冬氨酸、谷氨酸等十七種氨基酸(特別是人體不能合成的八種氨基酸物質)和十多種礦物質微量元素與抗癌多糖，其藥用保健療效高于其他食用菌。它味道鮮美，用作主菜、調味均佳；且有滋陰壯陽、美容保健之功效，對腎虛、尿頻、水腫、風濕有獨特療效，對抗癌、降壓、防衰、小兒低熱、尿床有較理想的輔助治療功能，民間稱之為“神菇”
在茶樹菇栽培技術中，優良菌種的獲得是關鍵技術環節。茶樹菇菌株的獲得通常是利用子實體或孢子進行分離、純化，直接應用于茶樹菇的栽培或菌絲體生產。現有技術的不足在于其生物學特性目前仍處于試驗研究階段，生物轉化率較低，而且還要用熟料栽培，生產工藝及技術要素要求較高，因而制約了茶樹菇商品經濟的發展。另外只能根據菌絲形態及分離物來初步確定是否為茶樹菇純培養物；生產的菌種一般用固體菌種。目前在國內采用液體菌種進行茶樹菇資源的保護應用不廣泛。
發明內容
本發明的主要目的就是克服現有技術不足，利用云南原產地茶樹菇子實體篩選出優良菌株，采用生物技術進行菌種鑒定，制備茶樹菇液體及固體優良菌種，為茶樹菇資源保護提供優良菌種
本發明采用的真菌是茶樹燕aegeri ta KMFJ-FC ;保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期=2012年10月11日；保藏登記入冊的編號CGMCC No. 6706
子實體單生，雙生或叢生，菌蓋直徑5-lOcm，表面平滑，初暗紅褐色，有淺皺紋，菌肉(除表面和菌柄基茶樹菇部之外)白色，有纖維狀條紋，中實。成熟期菌柄變硬，菌柄附暗淡粘狀物，菌環殘留在菌柄上或附于菌蓋邊緣自動脫落。內表面常長滿孢子而呈繡褐色孢子呈橢圓形，淡褐色。菌蓋初生，后逐平展，中淺，褐色，邊緣較淡。菌肉白色、肥厚。菌褶與菌柄成直生或不明顯隔生，初褐色，后淺褐色。菌柄中實，長4 12厘米，淡黃褐色。菌環白色，膜質，上位著生，孢子卵形至橢圓形本發明的技術方案
①采集野生茶樹菇子實體；
②組織分離或孢子分離；
③純化菌株及菌株鑒定；④生物學特性比較及生產性狀比較；
⑤確定優良菌株；
⑥菌種生產及菌種應用；
經過反復篩選，獲得菌絲體產量高、抗污染的茶樹菇液體菌種專用菌株KMFJ-FC
本發明真菌aegeri ta培養方法(以下為重量百分比):
菌種分離純化培養基2%茶樹菇下腳料、O. 001%VB1、2%葡萄糖、2%瓊脂；
茶樹菇菌株分離及鑒定方法
1、將茶樹菇子實體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養基斜面上，于18-24°C下培養5-10天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長 勢良好的菌株，獲得茶樹菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于18-24°C下培養5-7天，獲得茶樹菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的茶樹燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=498/518 (96%), Gaps=7/518 (1%)，分析確定分離得到的純培養物為茶樹菇菌絲體
本發明茶樹燕菌種的制備方法分為液體培養和固體培養兩種
液體菌種制備方法
液體培養基配方為1(Γ20%麩皮、1(Γ20% 土豆、O. 5 1%蔗糖，余下為水，pH自然
1、將茶樹菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，于18-24°C下培養5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為前述液體培養基配方，于20-26°C下搖床培養，轉速為120-160r/min，培養時間5_7天
3、將搖瓶菌種接種到25L自動發酵生產線的發酵罐中，通氣量為1:0. 8ν/(ν ·π η);攪拌轉速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為20-26°C ;通氣培養72-96小時，獲得茶樹菇液體菌種
固體菌種制備方法
固體培養基配方為麥粒88%、木屑10%、碳酸鈣2%、pH自然
1、將茶樹菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，于18-24°C下培養5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為前述液體培養基配方，于20-26°C下搖床培養，轉速為120-160 r/min，培養時間5_7天
2、采用前述固體培養基配方。將培養料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120°C滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26°C培養15-20天，直到菌絲長滿
具體實施例方式 實施例一1、將茶樹菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于18°C下培養10天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得茶樹菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養基斜面上，于18°C下培養7天，獲得茶樹菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的茶樹燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析確定分離得到的純培養物為茶樹菇菌絲體
4、將aegerita KMFJ-FC的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，18°C下培養7天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為10%麩皮、10% 土豆、O. 5%蔗糖，余下為水，pH自然。于20°C下搖床培養，轉速為120rpm，培養時間7天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到25L自動發酵生產線的發酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為22°C ;通氣培養96小時，獲得茶樹菇液體菌種
實施例二
菌種制備的步驟與實施例一相同
1、將茶樹菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于22°C下培養6天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得茶樹菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于22°C下培養6天，獲得茶樹菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的茶樹燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析確定分離得到的純培養物為茶樹菇菌絲體
4、將aegerita KMFJ-FC的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，22°C下培養6天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為15%麩皮、15% 土豆、O. 6%蔗糖，余下為水，pH自然。于22°C下搖床培養，轉速為140rpm，培養時間6天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到25L自動發酵生產線的發酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為24°C ;通氣培養84小時，獲得茶樹菇液體菌種
實施例三
1、將茶樹菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于24°C下培養5天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得茶樹菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平 板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于24°C下培養5天，獲得茶樹菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的茶樹燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析確定分離得到的純培養物為茶樹菇菌絲體
4、將aegeritaKMFJ-VC的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，24°C下培養5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為20%麩皮、20% 土豆、O. 5%蔗糖，余下為水，pH自然。于26°C下搖床培養，轉速為160rpm，培養時間5天，獲得一級液體菌種 將一級液體菌種接種到固體培養基上，培養基配方為麥粒88%、木屑10%、碳酸鈣2%、pH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120°C滅菌60分鐘后，接種后置于26°C培養15天，獲得茶樹菇固體菌種
實施例四
1、將茶樹菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于24°C下培養5天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得茶樹菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養基斜面上，于24°C下培養5天，獲得茶樹菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的茶樹燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析確定分離得到的純培養物為茶樹菇菌絲體
4、將aegeritaKMFJ-VC的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，24°C下培養5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為18%麩皮、10% 土豆、1%蔗糖，余下為水，pH自然。于26°C下搖床培養，轉速為160rpm，培養時間5天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到固體培養基上，培養基配方為麥粒88%、木屑10%、碳酸鈣2%、pH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120°C滅菌60分鐘后，接種后置于20°C培養20天，獲得茶樹菇固體菌種。
權利要求
1.一種茶樹燕菌株，其特征在于所述菌株為(Jgrocybe aegeri ta ) KMFJ-FC,該菌株的保藏號為 CGMCC NO. 6706。
2.根據權利要求1所述的茶樹菇菌株的制備方法，所述菌株是經過常規的液體和固體發酵培養獲得的，其特征在于所述液體和固體發酵培養基配方如下 液體培養基配方為5-10%麩皮、O. 5-1%黃豆粉、O. 5-1%麥芽糖、1-3%玉米粉，余下為水，pH自然; 固體培養基配方為木屑75-90%、麩皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊肚菌生長地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
全文摘要
本發明涉及茶樹菇菌株的篩選及制備方法，屬于微生物技術領域。本發明的菌株AgrocybeaegeritaKMFJ-FC已于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.6706。利用該菌株制備的液體及固體優良菌種，應用于茶樹菇的促繁有著顯著的社會、經濟效益和廣闊的應用前景。
文檔編號A01G1/04GK102986452SQ20121050386
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月2日 優先權日2012年12月2日
發明者郭永紅, 張微思, 羅曉莉, 羅孝坤, 尚陸娥 申請人:中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所, 云南省供銷合作社科學研究所, 昆明菌苑食品有限公司