專利名稱：用于生物合成維吉尼亞霉素m的培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培養基，具體說，涉及一種以綠灰鏈霉菌(&r印tom;;c" vz>gZm^MAFF 10-06014)為菌種，生物合成維吉尼亞霉素M的培養基。
背景技術：
維吉尼亞霉素(Virginiamycin,簡稱VGM)是由維吉尼鏈霉菌產生的 一種內酯環肽，由VGM-M (Ml， M2)和VGM-S (S1 S6)組成，其中 VGM-M1和VGM-S1為主要成分。單獨VGM-M1或VGM-S1的抗菌作用很 弱，但二者存在協同效應，兩者合為一體可以產生強大的殺菌效果。商業 維吉尼亞霉素產品是M1和S1的混合物，比例一般為3: 1，在全球被作為"動 物生長促進劑"廣泛應用于畜禽配合飼料。
維吉尼亞霉素幾乎不被畜禽腸道吸收，用藥后在畜禽體組織中殘留量 很少。可用來防治細菌性下痢和雞壞死性腸炎。它能殺滅有害及多余的腸 內細菌，減少乳酸、氮氣、揮發性脂肪酸等有毒物質產生，減緩腸道蠕動， 延長飼料在腸道內停留時間，增加養分的吸收，令腸壁變薄，增加腸壁滲 透性，促進對氨基酸和磷的吸收，提高飼料利用率。它還能提高雞對飼料 中黃色素的吸收，提高雞肉、蛋的黃色素含量。在質量上有穩定性好等優 點，室溫下保持三年效價不變。
目前，市場上的維吉尼亞霉素為美國史克藥廠畜禽保健公司發酵法生 產，它由70。/。Ml和30。/。Sl混合組成。而在國內，尚未實現大規模生產。 Optimization of agitation and aeration conditions for maximum virginiamycin production. Appl Microbiol Biotechnol. 1999(51).164 169等也曾提到過幾 種生物合成維吉尼亞霉素的培養基，由于其使用的是酵母抽提物等非常用 氮源和甘油等非常用碳源，且產量不高，其中維吉尼亞霉素M產量僅為 400mg/l左右，不適用于大規模生產。因此有必要開發一種成本更為低廉， 產量進一步提高的培養基，以適應工業化生產的需要。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提高綠灰鏈霉菌發酵生物合成維吉尼
亞霉素M的效價。
為此，本發明提供一種以綠灰鏈霉菌為菌種，生物合成維吉尼亞霉素
M的培養基，其包括
氮源 2% 10% 碳源 4% 8% 硫酸鹽 0.0005%~0.005% 碳酸轉 0.1%~1.0%。
該培養基的有機氮源包括但不僅限于豆粕，大豆分離蛋白、玉米漿、 花生粉、棉仔餅粉和黃豆餅粉等，優選為黃豆餅粉。培養基中有機氮源濃 度最優為5%。
本發明中的有機碳源包括但不僅限于淀粉、葡萄糖、糊精和蔗糖，優 選為淀粉。培養基中有機碳源的濃度優選為6.0%。
本發明中的硫酸鹽包括但不僅限于硫酸錳、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸 鋅等，優選硫酸鋅。培養基中硫酸鹽的濃度優選為0.001%。
這里所述的濃度(。/。)為g/100ml。
本發明培養基中還需添加碳酸鈣。碳酸鈣的濃度優選為0.5%。 本發明培養基在發酵初始的pH值控制在4.0 8.0，優選為5.0。 本發明還提供一種生物合成維吉尼亞霉素M的方法，包括將綠灰鏈霉 菌接種于所述的培養基中進行發酵，其中所述方法的發酵時間為35至45小 時，優選38小時。
本發明中，發酵時間控制在35 45h，優選在38h。 本發明還提供一種生物合成維吉尼亞霉素M的方法， 本發明中，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用V. I. Zvenigorodskii, B. V. Tyaglov, and T. A. Voeikova. Isolation of Components of the Peptide Antibiotic Virginiamycin and Breeding of Their Producer, Streptomyces virginiae. Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 37， No. 3, 2001，. 260-266的方法。
本發明方法中的培養基中有機碳源及氮源的廉價，大大降低了成本，同時提高了發酵單位，有利于放大進行規模化生產。
本發明方法發酵合成維吉尼亞霉素M的發酵水平通常可穩定地達到 lg/L以上，最高發酵單位可達1.5g/L。
具體實施例方式
本發明所使用主要培養基成份(黃豆餅粉，豆粕，花生粉及棉仔餅粉) 均購自福建浦城綠康生化有限公司。
實施例l
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10M),得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28"C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.5g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例2
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、80g黃豆餅粉(濃度2%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10W)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28。C，培養38小時，取樣分析，結果得到0.9g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例3
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、400g黃豆餅粉(濃度10%)、 240g淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸 調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上 述文獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通 氣量lv/v及培養溫度28"，培養38小時，取樣分析，結果得到1.0g/l的維吉尼亞霉素M。 實施例4
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 160g 淀粉(濃度4%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%),綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28。C，培養38小時，取樣分析，結果得到l.lg/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例5
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 320g 淀粉(濃度8%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10y。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28t:，培養38小時，取樣分析，結果得到0.9g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例6
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5Q/。) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.02g硫酸鋅(濃度0.0005%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0,加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28。C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.4g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例7
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.2g硫酸鋅(濃度0.005%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28。C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.4g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例8
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣4g (濃度0.1%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文獻 的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量lv/v 及培養溫度28-C，培養38小時，取樣分析，結果得到l.lg/l的維吉尼亞霉素 M。
實施例9
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%),用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣40g (濃度1.0%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28。C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.2g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例IO
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為4.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28X:，培養38小時，取樣分析，結果得到1.4g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例ll
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為8.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28'C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.3g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例12
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g豆粕(濃度5%) 、 240g淀 粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%),用氫氧化鈉或鹽酸調pH為 5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文獻 的方法，用量為0.4L(10M)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量lv/v 及培養溫度28'C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.2g/l的維吉尼亞霉素 M。
實施例13
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g大豆分離蛋白(濃度5%)、 240g淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸 調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上 述文獻的方法，用量為0.4L(10n/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通 氣量lv/v及培養溫度28。C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.3g/l的維吉 尼亞霉素M。
實施例14
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g玉米槳(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10y。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28'C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.2g/l的維吉尼亞 霉素M。實施例15
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g花生粉(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28X:，培養38小時，取樣分析，結果得到1.4g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例16
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g棉仔餅粉(濃度5%) 、 240g 淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28"C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.3g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例17
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 葡萄糖(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調 pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述 文獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣 量lv/v及培養溫度28。C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.3g/l的維吉尼 亞霉素M。
實施例18
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 糊精(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28t:，培養38小時，取樣分析，結果得到1.4g/l的維吉尼亞霉素M。
實施例19
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%) 、 240g 蔗粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH 為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%),綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文 獻的方法，用量為0.4L(10。/。)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量 lv/v及培養溫度28t:，培養38小時，取樣分析，結果得到1.4g/l的維吉尼亞 霉素M。
實施例20
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%)、 240g淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸錳(濃度0,001%)，用氫氧化鈉或鹽 酸調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使 用上述文獻的方法，用量為0.4L(10%)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、 通氣量lv/v及培養溫度28°C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.3g/l 的維吉尼亞霉素M。
實施例21
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%)、 240g淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鎂(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽 酸調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使 用上述文獻的方法，用量為0.4L(10%)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、 通氣量lv/v及培養溫度28°C，培養38小時，取樣分析，結果得到1.2g/l 的維吉尼亞霉素M。
實施例22
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%)、 240g淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸亞鐵(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或 鹽酸調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文獻的方法，用量為0.4L(10%)，得到4L反應液。攪拌速度 500rpm、通氣量lv/v及培養溫度28°C ，培養38小時，取樣分析，結果得 到1.4g/l的維吉尼亞霉素M。
對比例1
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%)、 240g淀粉(濃度6%)，用氫氧化鈉或鹽酸調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃 度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使用上述文獻的方法，用量為 0.4L(10%)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、通氣量lv/v及培養溫度 28°C，培養38小時，取樣分析，結果得到0.7g/l的維吉尼亞霉素M。
對比例2
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、40g黃豆餅粉(濃度1%)、 240g淀粉(濃度6%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽 酸調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使 用上述文獻的方法，用量為0.4L(10%)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、 通氣量lv/v及培養溫度28-C，培養38小時，取樣分析，結果得到0.3g/1 的維吉尼亞霉素M。
對比例3
在7.0L的發酵罐中，加入3.6L自來水、200g黃豆餅粉(濃度5%)、 400g淀粉(濃度10%) 、 0.04g硫酸鋅(濃度0.001%)，用氫氧化鈉或鹽 酸調pH為5.0，加碳酸鈣20g (濃度0.5%)，綠灰鏈霉菌濕菌體的培養使 用上述文獻的方法，用量為0.4L(10%)，得到4L反應液。攪拌速度500rpm、 通氣量W/v及培養溫度28"C，培養38小時，取樣分析，結果得到0.4g/1 的維吉尼亞霉素M。
權利要求
1.一種用于綠灰鏈霉菌生物合成維吉尼亞霉素M的培養基，其包括氮源2％～10％碳源 4％～8％硫酸鹽 0.0005％～0.005％碳酸鈣 0.1％～1.0％。
2. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述氮源為豆粕、大豆 分離蛋白、玉米漿、花生粉、棉仔餅粉或黃豆餅粉。
3. 如權利要求2所述的培養基，其特征在于，所述氮源為黃豆餅粉。
4. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述氮源的濃度為5%。
5. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述碳源為葡萄糖、淀 粉、糊精或蔗糖。
6. 如權利要求5所述的培養基，其特征在于，所述碳源為淀粉。
7. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述碳源的濃度為6%。
8. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述硫酸鹽為硫酸錳、 硫酸鎂、硫酸亞鐵或硫酸鋅。
9. 如權利要求8所述的培養基，其特征在于，所述硫酸鹽為硫酸鋅。
10. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述硫酸鹽的濃度為 0扁％。
11. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，所述碳酸鈣的濃度為 0.5%。
12. 如權利要求l所述的培養基，其特征在于，其在發酵初始的pH值 為4.0 8.0。
13. 如權利要求12所述的培養基，其特征在于，其在發酵初始的pH 值為5.0。
14. 一種生物合成維吉尼亞霉素M的方法，包括將綠灰鏈霉菌接種于 權利要求1至13任一所述的培養基中進行發酵，其中所述方法的發酵時間 為35至45小時。
15. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述發酵時間為38小時。
全文摘要
本發明公開一種以綠灰鏈霉菌為菌種，生物合成維吉尼亞霉素M的培養基，其包括氮源2％～10％、碳源4％～8％、硫酸鹽0.0005％～0.005％和碳酸鈣0.1％～1.0％。使用本發明培養基進行維吉尼亞霉素M的生物合成，其合成水平通常可穩定地達到1g/l以上，最高可達到1.5g/l。由于生物合成水平高，所需要的原料成本低，所以降低了生產成本，具有很高的經濟價值。
文檔編號C12N1/20GK101538539SQ20081003480
公開日2009年9月23日 申請日期2008年3月18日 優先權日2008年3月18日
發明者張兆利, 程晴華, 趙文杰 申請人:上海醫藥工業研究院