專利名稱：小麥應答非生物脅迫抗性基因TaCEO及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及小麥應答非生物脅迫抗性基因fsCH 及其應用。
背景技術：
我國是世界上干旱半干旱地區面積較大的國家，旱地面積占全國總土地面積的 52.5%,其中典型地帶一_黃土高原水土流失區，耕地約占半干旱地區的1/3，坡耕地 占到耕地面積的75%，平均單位(667m0產量低于150kg，不少地方還在100kg以下。但 是目前該地區的灌溉面積僅為20%左右，單位面積產量僅為全國平均值的一半，其中典 型半干旱地區，如黃土高原丘陵溝壑區，灌溉面積不足10%，單產僅為全國平均的三分 之一。與此同時，我國是水資源匱乏的國家之一，人均水資源占有量僅為世界平均數的 1/4，且近20年來，隨著人口的劇增、耕地銳減、環境資源惡化，水資源的匱乏已經成 為制約農業生產可持續發展的最大障礙。而且預計在相當長的時間內這種局面不會有很 大的改善。除了干旱之外，壤鹽漬化嚴重影響農作物生長和產量。隨著經濟的發展，土 壤鹽漬化愈來愈嚴重，已成為一個全球關注的社會問題；特別是我國人口眾多，土壤鹽 漬化己經成為制約我國經濟和社會發展的重要因素。所以，培育耐鹽抗旱農作物新品種 已成為當前一個十分迫切的任務。
除了傳統育種方法外，利用基因工程和細胞工程等新技術可以快速穩定地獲得具有 優良耐鹽抗旱能力的作物新品種。利用轉基因技術將新的耐鹽抗旱功能基因轉入到作物 中，以此高效開發耐鹽抗旱轉基因作物新品種，用于在鹽堿地及干旱地區種植是一項具 有廣闊應用前景的技術。其前提是，必須較系統地了解植物耐鹽抗旱機制，分離高效的 與耐鹽抗旱相關的基因。
多年來，有關植物耐鹽抗旱機制方面的研究已取得了較大的進展，克隆了大量高鹽、 水分脅迫相關基因，為進一步闡明植物耐鹽抗旱的分子機制提供了理論線索和依據。一 些實驗表明，將植物本身以及其他生物中與耐鹽抗旱相關的基因轉入植物中，其異源轉 錄和翻譯產物可以使轉基因植物的耐鹽抗旱能力明顯提高。
目前，已發現了一些能顯著改變植物耐鹽抗旱能力的基因，其中除了耐鹽抗旱調節 相關的轉錄因子相關基因外，還包括一些能夠通過對轉錄因子進行修飾化作用以改變其 調控能力的功能基因。后者可通過調節轉錄因子調控能力及其下游抗旱相關基因的表達 來調控植物的耐鹽抗鹽能力。研究表明，將這些基因轉化到植物中，可以明顯提高植物 的抗旱能力。
CEO蛋白是一類非常重要的蛋白質，參與植物對多種非生物脅迫的響應過程。近年 來已有試驗表明，擬南芥中的CEO蛋白可以提高酵母的抗氧化能力，但有關faCH 基因 在植物抗旱過程中的作用尚未見報道。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種耐鹽抗旱基因——小麥抗非生物脅 迫基因ra6H 及其應用。本發明的技術方案是從小麥中分離得到了 6K 基因一一"Cfft并構建雙子葉植 物表達載體pBI121/7^CfO轉化模式植物擬南芥，以鑒定基因的功能并最終將該基因用
于小麥等重要農作物的轉化，提高農作物的耐鹽抗旱能力。
本發明提供的小麥抗非生物脅迫基因名稱為小麥CEO蛋白基因fa6H 即小麥應答非 生物脅迫(鹽、旱等)抗性基因化CEa其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列 如SEQ ID No. 1所示。
本發明還提供了含上述小麥應答非生物脅迫(鹽、旱等)抗性基因r"c^o的植物
表達載體pBI121/ra(^y。
本發明所述基因raGW及含所述基因7^6H 的植物表達載體pBI121/7^G叨在培育 耐鹽抗旱植物中的應用。其中所述植物優選是普通小麥或擬南芥。
將本發明所述基因導入植物細胞，使其在植物中過量表達就可以使轉基因植物提高 耐鹽抗旱能力。為了便于對轉基因植物或細胞系進行篩選，可以對含有所述基因fa6H 的植物表達載體pBI121/7^7H 進行加工，如可以加入選擇標記(GUS等)或者具有抗 性的抗生素標記物(潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)等。
本發明所述的基因可廣泛用于培育耐鹽抗旱農作物新品種，并可為深入闡明植物耐 鹽抗旱機制提供理論依據。
本發明的有益效果利用現有的植物基因工程技術，本發明首次克隆得到了小麥抗 非生物脅迫基因并通過根瘤農桿菌介導的方法將該基因轉入擬南芥，經過比較 分析證明，轉基因植株的耐鹽抗旱能力明顯增強。據此可通過過表達策略開發和培育耐 鹽抗旱作物新品種。
圖l 7^^堪因全長cDNA序列的擴增結果
M:DNA分子量標準，此處為DL2000 (下同)。 圖2 在多種處理下山融3號中的半定量RT-PCR分析。
P: 18% PEG處理；S: 200mM NaCl處理；C: 4。C低溫處理；A: ABA處理；H: &02處理；M:甲基紫精處理(下同)。
圖3 faCH 轉基因擬南芥植株PCR鑒定。
0E1，2:兩個7^6^啦表達轉基因株系；VC:空載體轉化株系；WT:野生型；25S
Pro: 35S啟動子擴增片段(下同) 圖4 7^G叨轉基因擬南芥植株RT-PCR鑒定。 圖5 7^CH 轉基因擬南芥植株在各種脅迫下種子的萌發率。 圖6 7^CH 轉基因促進擬南芥植株幼苗期根的伸長及側根的發育。 圖7 raCH 轉基因擬南芥植株幼苗期在各種脅迫培養基上的生長情況。 圖8 raCFO轉基因擬南芥植株中脅迫標記基因的半定量RT-PCR結果。
具體實施例方式
實施例l、 raCg"O的克隆 1. 1小麥RNA提取
(1) 將PEG滲透脅迫處理的組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉 末；
(2) 待液氮揮發干，立即轉移到2ml的離心管中，每100mg材料約加入lml Trizol提取液，劇烈振蕩使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；
(3) 4°C， 12000rpm離心15分鐘;
(4) 用移液器小心將上層水相轉移至一個新的L5ml的離心管中，加入200Pi氯仿 (chloroform),劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；
醇(l:l體積)，充分混勻，-20°C,沉淀30min或過夜；
(5) 4°C， 12000rpm離心15分鐘；
(6) 用移液器小心將上層水相轉移至一個新的1. 5ml的離心管中，加入500 u 1的異丙 醇(l:l體積)，充分混勻，-20°€:,沉淀30^11或過夜；
(7) 4°C, 12000rpm離心10min，小心棄去上清液；
(8) RNA沉淀用lml的75。/。乙醇洗滌。4°C, 8000rpm離心10min收集沉淀；
(9) 重復用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀；
(10) 去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適當 體積(30-50y 1)的RNase-free水充分溶解(可放于-80。C長期保存)；
(11) 紫外分光光度計及1% Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量。
注a)用紫外分光光度計檢測RNA的產量，在260nm處的吸光度，10D=40ug/ml。 根據在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的0D26()/0D28。比值應接近 2.0(比值最好在1.9 2. 1之間)。
b)用1% Agrose凝膠電泳檢側RNA的質量及大小。吸取lul RNA加入3 u 1的 RNase-free水，加1 u 1上樣緩沖液6 5。C變性5分鐘。電泳后用EB染色，另取3ul 的lkb DNAMarker作為對照。 1. 2 cDNA 3'和5'末端第一鏈的快速擴增
5 ，和3 ，RACE第 一鏈cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends ， RACE ) 按Clonetech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南進行。 1. 3 5'和3'端克隆
(1 )根據基因芯片的檢測結果，獲得TaCEO的部分序列并按照SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南設計兩對基因特異引物(序列如下) TaCEO -GSP1: 5'GAACCTCCACTGAGAAACATTACC3' TaCEO -GSP2: 5' GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC3'引物序列 TaCEO -NGSP 1(5， RACE巢式引物)5'GTTTCCACTAGCAGGTTCATTCA 3' TaCEO -NGSP2(3' RACE巢式引物)5， AATAACATACTGGAGGAAGGACAG3';
(2) 按照SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南分別擴增TaCEO的5，和3， 末端；
(3) 將5'和3，端序列拼接，分別在起始密碼上游和終止密碼下游設計引物(序列 如下)，以5'或3' RACE產物為模板擴增該基因全長。
引物1: GGT ACC ATG GAA AGG AAG ACT G 引物2: CCA GGT TCA GGA GGT GCT GCT C 1.4 raCH 全長克隆
1. 引物序列見1.3部分。
2. PCR反應體系(20 uL):
10 X buffer 2yl 模板(5'RACE產物) liUd,s (2, 0mM each) 0. 5y 1
Primerl (5 y M) 1 li 1
Primer2(5ii M) 1 p 1
高保真Taq酶(STRATAGEN, Cat No: 600380)0. 5 " 1
ddH20 14iU
3. PCR反應程序為94°C預變性5min; 94。C變性45sec， 57. 5'C復性45sec， 72。C延伸2min30sec，循環35次；72。C延伸7min。
4. 擴增片段的回收后與T載體連接、轉化大腸桿菌、選取陽性克隆測序。結果見圖1。
實施例2、 raCE"O的表達分析
2. 1脅迫下脂A的提取
山融3號種子正常萌發，Hoagland培養液培養至株高約10cm時(約3周時間)開 始進行干旱(18% PEG)、鹽脅迫(200mM NaCl)、冷、ABA、 HA和甲基紫精處理。處 理不同時間后，Trizol法提取幼苗根、葉RNA同上。 2. 2逆轉錄獲得cDNA
逆轉錄產生cDNA，按說明書操作。 2.3 PCR反應及電泳
(1) 以cDNA為模板，進行PCR反應。引物如下
5'端引物ATGGACTCGGAGCACTGGAT 3'端引物TCAGTCGTCTCCAAATAAAGTG
(2) PCR體系
ddH2012. 6u 1
lOXTaq buffer (Mg2+free)1
MgCl2 (25mM)1. 1
Primerl (5iiM)1" 1
Primer2 (5 p M)lu 1
d鮮(2mM each)ly 1
Taq polymerase (5U/n 1)0. 2ix 1
模板(逆轉錄cDNA)lu 1
Total Volume20 y 1
(3) PCR程序
95°C 3min, 25 30 cycles 95°C 30s'60°C 30s' 72°C 60s; 72。C 5min， 根據內參Actin的擴增情況確定PCR的循環數，調整cDNA模板的加入量。
(4) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。
結果表明，上述各種脅迫下，TaCE0在根中均上調表達，相反在葉中有的下調表 達(PEG、冷、HA和甲基紫精處理)，有的先下調表達再恢復到對照水平(NaCl和ABA 處理)(見圖2)。 實施例3、植物表達載體的構建(35S啟動子)
植物表達載體pBI121是含有35S啟動子和NPTII基因的雙元載體，在其多克隆 位點上含有限制性內切酶BamHI的識別位點。據此在目的基因起始密碼上游和終止密碼下游設計含BamHI識別序列的引物，用高保真Taq酶擴增目的基因，體系同1.4。 用限制性內切酶BamHI對載體pBI121和目的基因擴增產物片斷分別進行酶切。
完全酶切的載體在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經膠回收、用CIAP脫磷酸,然后
與酶切的目的基因擴增片段相連。 酶切體系 (1)質粒BamHI單酶切
于37。C恒溫水浴鍋酶切2小時以上。酶切后以O. 5XTBE為電泳緩沖液，將酶切 產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下pBI121大片段和目 的基因條帶，回收。
(2) 回收的載體大片段的脫磷。
(3) 經酶切和脫磷的載體片段和目的基因片段以摩爾比1:4的比例進行16X:連
接過夜。
(4) 連接產物熱激法轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，轉化菌在含Kan 50 tx g/ml 的LB固體平板上37'C培養16小時左右。
(5) 重組子的鑒定
① 載體特異引物的合成
為了鑒定目的基因的插入方向，根據35S啟動子序列設計一個載體特異引物，序 列如下GTT GGG GTT TCT ACA GGA CGT
② 重組質粒的PCR驗證
挑取在kan培養基上的抗性單菌落分別接種于5ml含Kan的LB液體培養基中 37t振蕩培養過夜，堿變性法提取質粒，用載體特異引物和基因的下游引物進行PCR 擴增，體系同2. 3。PCR反應條件如下預變性94。C 3min， 35個循環為94°C 30sec， 55°C 30sec， 72。Clmin，最后，72。C延伸10min。 PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳 鑒定。
②質粒酶切鑒定
提質粒進行BaraHI單酶切，酶切體系同上。0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否含 有預期分子量大小的片段，驗證載體的正確構建。 實施例4、農桿菌感受態的制備與轉化
4. 1農桿菌AGL1/EHA105感受態的制備
(1) 從YEP平板(含50ug/ml利福平)上挑取根癌農桿菌單菌落，接種于含50yg/ml 利福平的YEP液體培養基中，200rpm/min， 28。C培養過夜。
(2) 取2ml過夜培養液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養基中在相同條件下培 養至OD,達0.5。
(3) 菌液冰浴30min， 4。C， 5000rpm離心10min,收集菌體。
(4) 將菌體重懸于冰浴的10ml 0. 15mol/L的NaCl中，離心收集菌體。
(5) 再懸浮于lml 20mmol/L冰預冷的CaC12溶液中，以200 " 1/管將菌液分裝在1. 5ml
10X Buffer
質粒
BamHI
加ddH20至總體積
12 ulE卯e油rf管中，置液氮中速凍lmin， -7(TC保存備用。 4. 2凍融法轉化根癌農桿菌AGL1/EHA105
(1) 在室溫下融化兩管農桿菌感受態細胞，分別加入lyg表達載體質粒DNA和lug空 載體，混勻后冰浴30min。
(2) 置液氮速凍lmin，迅速移至37'C溫浴3min。
(3) 加入無抗生素的YEP 800ul， 28"震蕩培養3hr。
(4) 7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50yg/ml利福平、50yg/ml Kan的YEP平 板上，28。C倒置暗培養2-3天。
4. 3菌體PCR鑒定
菌體PCR方法及程序同上。 實施例5、擬南芥轉化及篩選
5. 1擬南芥種植
取擬南芥(哥倫比亞野生型)種子，置于墊有濾紙的平皿內，用少量蒸餾水潤濕濾紙， 于4'C冰箱進行春化處理，3-5天后播種于育苗盤內，放置于人工氣候箱內(16h光照， 22。C/8h黑暗，18°C)，生長6—8周后，待抽苔開花時用于轉化。 5. 2擬南芥轉化
(1) 轉化前一天，取2ml活化的農桿菌AGL 1加到含相應抗生素的200ml YEP培養基 中，過夜培養至0D,-1.0-1.2。
(2) 離心收集菌體，并重懸于浸染液(5%蔗糖，0.04%Silwet L-77)中，使0D抓產0.8。
(3) 將花序浸入浸染液30秒，其間前后擺動花序，使花序上形成一層膜。
(4) 用保鮮膜覆蓋花序，暗培養一天后揭去保鮮膜，繼續置人工氣候箱使其生長。
(5) 隔5-7天再用相同的方法浸染一次。
(6) 大約一個月后收獲種子。
(7) 空載體的轉化同上
5. 3擬南芥轉化陽性株系篩選
(1) 收獲的TO代種子消毒后(75X乙醇5min，清潔劑洗滌10-15min，無菌水沖洗3 — 5 次)，鋪于含50ug/raL Kan的MS篩選培養基上。
(2) 4'C春化48h，移到培養室(16h光照/8h黑暗，22'C恒溫)生長7-10天。將抗性綠 色小苗移到土中繼續生長。
(3) 等植物絕大多數花苞已經結莢時，用小繩將植物單株綁起，以便單株收獲T1代種 子。
(4) 重復步驟(1) 一 (3)，將單株收獲的T1代種子繼續在含卡那的MS培養基上進行 篩選，挑選抗性比為3:1的單插入獨立株系移栽，并單株收獲種子得到T2，繼續重復步 驟(1) 一 (3)，直至T2代單株種子在卡那抗性培養基上不再分離，至此得到純合的T2 代植株用于后續的進一步研究。空載體純合體的篩選方法同上。
(5) CTAB法提取野生型、空載體對照及不同轉基因株系的基因組DNA，提取相應材料的 總RNA并逆轉錄合成cDNA。
(6) PCR擴增以上述不同材料的基因組DNA為模板，使用基因特異引物、空載體檢測 特異引物(35S啟動子序列)，PCR反應體系和反應條件如前。
(7) RT-PCR驗證表明，rsCM7在轉化植株中正常表達。PCR驗證結果顯示，轉化空載體和轉化rs6X"的轉基因株系均能擴增出35S啟動子片段，
兩個&乙HM表達轉基因株系能擴增出rs6H 片段，表明基因已經成功轉如擬南芥(見圖3)。
RT-PCR驗證結果顯示，兩個raCi5。過表達轉基因株系中7^C^(9能正常表達(見圖4)。 實施例6、轉&C孤擬南芥脅迫抗性分析
6.1萌發率測定
將野生型對照、空載體對照、兩個株系的轉raffi^擬南芥種子經消毒(方法同上) 后，鋪入含有Mannital、 NaCl、 ABA和H202的MS培養基中，25度培養，觀察萌發 情況，肉眼可見白色胚根開始露出時計數，萌發率的=胚根露出的種子數/用于萌發試 驗的種子總數X100X。結果表明，NaCl、 ABA、 H202等脅迫條件下，與野生型相比， 空載體轉基因株系的萌發率沒有變化，兩個raffi^過表達轉基因株系的萌發率明顯提高 (見圖5)。
6. 2植株脅迫抗性分析
U)擬南芥種子消毒、萌發(方法同上)；
(2) 將萌發7天的幼苗轉移到不含任何脅迫成分的MS培養基中垂直培養，觀察幼苗 生長差異。結果表明，與野生型相比，空載體轉基因株系的生長狀況沒有變化，兩個 raCH 過表達轉基因株系的根葉生長速度明顯提高(見圖6)。
(3) 將萌發7天的幼苗轉移至含Mannital、 NaCl、 11202和ABA的MS培養基中垂直 培養，觀察幼苗生長差異。結果表明，與野生型相比，空載體轉基因株系的幼苗表型沒 有顯著變化，兩個raCR 過表達轉基因幼苗在ABA、甘露醇和NaCl脅迫下生長狀態明 顯較好，葉片較大，根長增加，側根增多，在&02脅迫下根沒有明顯變化，但葉生長狀 態更好(見圖7)。
(4) 將土培3周左右的轉基因植株及對照控水10天再澆水使其恢復生長3天，觀察植 株抗旱狀況。結果表明，復水后野生型和空載體轉基因植株恢復生長能力很差，但兩個 raO^過表達轉基因幼苗生長恢復明顯。
6.3轉7^CfO擬南芥幼苗中抗旱相關Marker基因分析
(1) 擬南芥種子消毒、萌發、培養(方法同上)；
(2) 經旱、ABA處理后的對照及轉基因株系，提取植株總RNA，逆轉錄形成cDNA，進 行RT-PCR分析。方法同實施例2，結果表明，在ABA和甘露醇脅迫下，與對照相比， 空載體轉化株系中幾個非生物脅迫標記基因的表達沒有變化，但在兩個raCH 過表達轉 基因株系中表達量明顯提高，表明轉基因株系耐鹽能力增強(見圖8)。<formula>formula see original document page 10</formula>
權利要求
1.一種小麥應答非生物脅迫抗性基因TaCEO，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2. —種含有權利要求1所述基因TaC￡0的植物表達載體pBI121/raCH 。
3. 權利要求1所述基因化C五O在培育抗非生物脅迫植物中的應用。
4. 權利要求2所述植物表達載體pBI121/rsCH 在培育抗非生物脅迫植物中的應用。
5. 如權利要求3或4所述的應用，其特征在于所述植物是普通小麥或擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種應答非生物脅迫(鹽、旱等)抗性基因TaCEO及含有所述基因TaCEO的植物表達載體pBI121/TaCEO；本發明還公開了所述基因TaCEO及含有所述基因TaCEO的植物表達載體在培育抗非生物脅迫(鹽、旱等)中的應用。實驗證明，本發明所述過表達轉基因植株的抗非生物脅迫(鹽、旱等)能力明顯提高。
文檔編號C12N15/29GK101525621SQ20091001964
公開日2009年9月9日 申請日期2009年3月6日 優先權日2009年3月6日
發明者劉栓桃, 夏光敏, 王勐騁, 翔 謝 申請人:山東大學