專利名稱：金針菇(flammulina velutipes)的萎銹靈(carboxin)抗性基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及在抗萎銹靈的金針菇中表達的多核苷酸。具體來說，本發明的多核苷酸是在抗萎銹靈的金針菇中特異性表達的抗萎銹靈基因。
背景技術：
萎銹靈(IUPAC名稱5，6_ 二氫-2-甲基_1，4_氧硫雜環己二烯_3_甲酰苯胺；CAS 名稱5，6_ 二氫-2-甲基-N-苯基-1，4-氧硫雜環己二烯-3-甲酰胺；CAS號52；34-68_4) 是內吸性農業殺真菌劑和種子處理劑。萎銹靈是呼吸系統毒素，其通過抑制三羧酸循環酶琥珀酸鹽脫氫酶(Sdh)而阻止琥珀酸鹽氧化。此酶由兩個亞單元-黃素蛋白和鐵硫蛋白 (Ip)構成，所述亞單元與兩個膜錨定蛋白一起構成琥珀酸鹽-苯醌氧化還原酶。萎銹靈被認為是通過抑制Ip亞單元的高電勢S3中心再氧化而阻止電子自琥珀酸鹽傳遞至泛醌來起作用。此外，已知玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的萎銹靈抗性是由位于連接S3中心的富集Cys的簇中的單一氨基酸來決定。先前報道顯示，將萎銹靈抗性(cbx R)基因插入至玉蜀黍黑粉菌基因組中削弱了真菌對玉蜀黍(Zea mays)(玉米宿主)的致病能力，而且萎銹靈抗性未顯著改變致病性，且因此是適用于玉蜀黍黑粉菌的基因分析的標記(現代微生物學(Current Microbiology)，第 44 卷，期，2002，第 67-70 頁)。對殺真菌劑敏感(缺乏抗性)是市售蘑菇菌株的一個問題。現已制備突變菌株，其通過紫外線輻照、隨后加以選擇自已知親本菌株產生，而且具有遺傳學上穩定的對萎銹靈或麥銹靈(benodanil)不敏感(抗性)的表型。真菌菌生輪枝孢(Verticilliumfungicola) 對蘑菇具有致病性且難以控制。某些殺真菌劑(特別是萎銹靈和麥銹靈)對此病原體具有一定控制能力，但這些殺真菌劑對蘑菇菌絲體具有植物毒性。如果能夠使蘑菇菌株對這些殺真菌劑中的一種較不敏感，則能夠使用殺真菌劑來控制易于感染的真菌性疾病。US 4，608，775提供對殺真菌劑具有抗性的雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌株。此現有參考文獻利用紫外線輻照來選擇抗萎銹靈的雙孢蘑菇菌株，但是未識別出抗萎銹靈基因。入江利禾口 (Toshikazu Irie)等人自可食用的擔子菌綱(basidiomycetous)真菌-平菇(Pleurotus ostreatus)克隆出編碼琥珀酸鹽脫氫酶(EC 1.3.99.1)的鐵硫蛋白(Ip)亞單元的基因組和cDNA片段(生物化學與生物物理學報(Biochimica et BiophysicaActa) 1396 (1998)，27-31)。此外，入江利和等人通過在編碼琥珀酸鹽脫氫酶的鐵硫蛋白(Ip)亞單元的基因中引入點突變研發出用于轉化平菇的選擇標記基因(現代遺傳學(Curr genet)，2000，37 :209-212)。金針菇(異名金錢菌(Collybia velutipes)；俗名金針菇(velvet foot)；冬菇)是可食用的傘菌，其可在早春或晚秋得到，在這些時節能得到的其它蘑菇很少。金針菇通常成簇出現，而且具有粘性光滑的橙色至褐色的帽和柔軟的在成熟時變成黑色的莖和蒼白的菌褶。金針菇是受歡迎的傳統食品，其具有很高的營養價值且可增強免疫功能并抵抗癌細胞。然而，迄今還沒有對特異性地表達于抗萎銹靈的金針菇中的萎銹靈抗性基因進行
3研究。當前仍需要研發特異性地表達于金針菇中的抗萎銹靈的選擇標記基因。
發明內容
本發明提供一種經分離的抗萎銹靈多核苷酸，其編碼在(A)或(B)中所界定的蛋白質(A)具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白質，(B)具有包括1_20個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列SEQ ID NO :2且具有抗萎銹靈活性的蛋白質。本發明提供一種抗萎銹靈蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :2，和其具有抗萎銹靈活性的變體。本發明還提供包含本發明多核苷酸的表達載體。本發明還提供包含本發明表達載體的宿主細胞。
圖1顯示由AMV載體(圖1A)和含有Cbr序列的yT&A載體(圖1A)構建的FvCbrAMV 載體(圖1B)。圖2顯示由mFvCbrAMV載體(圖2A)和含有GPD啟動子(pGPD)的pMush_A載體 (圖 2A)構建的 pMush-A-mFvCbr (圖 2B)。圖3顯示野生型金針菇和金針菇轉化體的潮霉素(hygromycin)基因的電泳圖，其中條帶2、3和4是金針菇轉化體，wt是野生型金針菇，H2O是陰性對照且M是標記。
具體實施例方式本發明研究特異性地表達于金針菇中的抗萎銹靈基因。通過表達此抗萎銹靈基因，金針菇能夠抵抗萎銹靈。定義術語“經分離的”意指物質自其起始環境(例如，如果其為天然存在的則為天然環境)移出。例如，存在于活生物體中的天然存在的多核苷酸或多肽不是經分離的，但與天然系統中的一些或全部共存物質分開的相同多核苷酸或多肽是經分離的。所述多核苷酸可以是載體的一部分和/或所述多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，而且如果所述載體或組合物不是其天然環境的一部分，那么所述多核苷酸或多肽仍然是經分離的。術語“基因”意指介于本發明的抗萎銹靈基因的起始密碼子與終止密碼子之間的所有編碼序列。術語“抗萎銹靈基因”或“抗萎銹靈多核苷酸”是指編碼展示抗萎銹靈活性的多肽的多核苷酸序列。本文所用的術語“抗萎銹靈活性”是指物質(例如多肽)抵抗萎銹靈的能力。“抗萎銹靈多肽”或“抗萎銹靈蛋白”意指具有抗萎銹靈活性的蛋白質。術語“多核苷酸”或“核苷酸”意指包含DNA的多核苷酸。所述實施例的多核苷酸還涵蓋所有序列形式，包括(但不限于)單鏈形式、雙鏈形式、發夾結構、干環結構和其類似物。術語“編碼(encoding或encoded)，，意指多核苷酸或核酸包含將核苷酸序列直接翻譯成指定蛋白質所必需的信息。通過使用密碼子來說明蛋白質的編碼信息。編碼蛋白質的核酸或多核苷酸可在核酸的翻譯區內包含非翻譯序列(例如，內含子)，或可缺乏所述間插非翻譯序列(例如，如在cDNA中)。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，其均指氨基酸殘基的多聚體。 這些術語適用于其中一個(或多個)氨基酸殘基是對應天然存在氨基酸的人工化學類似物的氨基酸多聚體，也適用于天然存在的氨基酸多聚體。術語“變體”意指實質上相似的序列。對于多核苷酸來說，變體包含在本發明多核苷酸內的一或多個內部位點上缺失和/或添加一或多個核苷酸和/或在本發明多核苷酸的一或多個位點上取代一或多個核苷酸。對于多核苷酸來說，保守變體包括那些由于遺傳密碼的簡并性編碼所述實施例的抗萎銹靈多肽之一的氨基酸序列的序列。變體多核苷酸還包括合成得到的編碼所述實施例的抗萎銹靈蛋白的多核苷酸。通常，所述實施例的特定多核苷酸的變體與本發明的特定多核苷酸具有至少約50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 和 99% 或更高的序列一致性。“變體”蛋白質意指通過在本發明蛋白質的一或多個內部位點上缺失或添加一或多個氨基酸和 /或在本發明蛋白質的一或多個位點上取代一或多個氨基酸而自所述蛋白質得到的蛋白質。所述實施例所涵蓋的變體蛋白質具有生物活性，也就是說，其仍然具有本發明蛋白質的期望生物活性，即，本文所述的抗萎銹靈活性。所述實施例的抗萎銹靈多肽的生物活性變體與本發明蛋白質的氨基酸序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和 99%或更高的序列一致性，如通過本文其它地方所描述的序列比對程序和參數所測定。所述實施例的蛋白質的生物活性變體與所述蛋白質可相差少至1-20個氨基酸殘基，少至1-15個或1-10個，例如6-10個；少至5 個、或少至4個、3個、2個或甚至1個氨基酸殘基。術語“嚴格條件”是指形成稱為特異性雜種者而不形成非特異性雜種的條件。在所述條件下，例如，由高度同源的核酸組成的DNA( S卩，由與SEQ ID NO :1中所顯示的核苷酸序列展示約65%或更高、優選地約75%或更高、更優選地約85%或更高且最優選地約95% 或更高的同源性的核苷酸序列組成的DNA)的互補鏈雜交，而具有低于上述水平的同源性的核酸的互補鏈不雜交。更具體條件是由150mM至900mM、優選地600mM至900mM的鈉濃度和60°C至68°C且優選地65°C的溫度構成。術語“高度嚴格”或“高度嚴格條件”意指允許序列高度互補的DNA鏈雜交但排除明顯失配的DNA的雜交的條件。能夠在嚴格條件下與本發明的多核苷酸雜交的多核苷酸序列可以是(例如)所揭示多核苷酸序列的變體(包括等位或剪接變體)，或編碼本發明所揭示多肽的直系同源物或旁系同源物的序列。核酸雜交方法詳細地揭示于鹿島(Kashima) 等人，(1985)，自然(Nature) 313 :402-404 ；薩姆布魯克(Sambrook)等人，(1989)，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，第 2版，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約(N. Y.)(“薩姆布魯克”)和海莫斯(Haymes)等人，“核酸雜交一種實用方法(Nucleic AcidHybridization =A Practical Approach) ”，IRL 出版社，華盛頓(Washington, D. C.) (1985)，所有所述文獻均以引用的方式并入本文中。本發明的抗萎銹靈多核苷酸和抗萎銹靈蛋白本發明提供一種經分離的抗萎銹靈多核苷酸，其編碼在(A)或(B)中所界定的蛋白質㈧具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白質，(B)具有包括1_20個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列SEQ ID NO :2且具有抗萎銹靈活性的蛋白質。根據本發明的一個實施例，所述經分離的抗萎銹靈多核苷酸可在嚴格條件下與和具有SEQ ID NO :1的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列雜交，且其編碼具有抗萎銹靈活性的蛋白質。優選地，所述雜交是在高度嚴格條件下實施。根據本發明的另一實施例，所述經分離的抗萎銹靈多核苷酸具有如SEQ ID NO 1中所顯示的序列。本發明提供一種抗萎銹靈蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :2，和其具有抗萎銹靈活性的變體。優選地，所述變體是具有包括1-20個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列SEQ ID NO :2且具有抗萎銹靈活性的蛋白質。本發明自金針菇克隆編碼琥珀酸鹽脫氫酶的鐵硫蛋白的基因，所述基因稱為金針菇的萎銹靈基因(Cbr)。此基因的序列在下文顯示為SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 3ATGCAGTCCGTCGCCCGTCGTTTCTCTGCCGCCGCCGTGCGCCGTAGCTTTTCTACCACTTCTGTCGCG TTCCAGGCTACACCGCTCGAGAAGCCCGTGCTGAACAAGGAATTCAAGATTTACCGCTGGAATCCTGATGAGCCGGA GAAGAAACCGACGCTACAGAGCTACATAATCGACCTGAACCAGACAGGGCCAATGATTCTGGATGCTCTCATCAAGA TTAAAAACGAAATCGACCCTACGCTTACCTTCAGACGAAGTTGTCGCGAGGGCATTTGCGGATCTTGTGCGAGAAAA ATCGACGGGCAGAACACGTTGGCCTGTCTCTGCAGGATTGATAGGAATGCTGGGAAGGATTCGAAGATCTATCCCTT ACCACACAGTGAGTGTCTCATCTGAGCTCTGCGTATCTGAGTGCTAACTTAG ATTCCAGTGTACATCGTCAAGGAC CTCGTACCGGATCTCACCTACTTCTACAAGCAGTACAAGTCTATCCAACCATACCTTCAGAACGACAACCCACCTGC GTCAGGTCTGTTCATTATTTTGCACCCTCCCCTTTGCTCGGCTTACCGAATCGCTTCTAGGTGAATTCCTCCAAACG CAAGATGACCGCAAGAAGCTCGACGGACTCTACGAGTGTATCCTTTGCGCGTGTTGTTCGACGTCTTGCCCTTCGTA TTGGTGGAACCAAGACGAATACCTTGGACCCGCTACTTTGATGCAAGCATATCGCTGGATCGCCGACTCGAGAGTAC GTTCTGCTCGTCGTATCATGTTTTATCTCATACTGATATACTCTTAGGACTCTTATGCCGCAGAACGCAAGGAAAAG CTCCAAAACGAGATGAGCATGTACCGATGCCACACTATCTTCAACTGCTCGCGGACATGCCCCAAGGGTCTCAACCC CGCTGCCGCCATCGCGAAAATCAAGCTTGAGCTTGCGGCCGAGTAA由上文SEQ ID NO :3所編碼的來自金針菇的琥珀酸鹽脫氫酶的鐵硫蛋白(稱為 “萎銹靈蛋白”)具有如下文SEQ ID NO 4中所顯示的氨基酸序列SEQ ID NO 4MQSVARRFSAAAVRRSFSTTSVAFQATPLEKPVLNKEFKIYRWNPDEPEKKPTLQSYIIDLNQTGPMIL DALIKIKNEIDPTLTFRRSCREGICGSCARKIDGQNTLACLCRIDRNAGKDSKIYPLPHMYIVKDLVPDLTYFYKQY KSIQPYLQNDNPPASGEFLQTQDDRKKLDGLYECILCACCSTSCPSYWWNQDEYLGPATLMQAYRWIADSRDSYAAE RKEKLQNEMSMYRCHTIFNC SRTCPKGLNPAAAIAKIKLELAAE本發明已驚奇地發現，其中SEQ ID NO 4的His238被改變且變成Leu的點突變 (CAC - CTC)使得萎銹靈蛋白具有萎銹靈抗性。具有上述點突變的多核苷酸稱為“抗萎銹靈多核苷酸”，且由所述多核苷酸編碼的蛋白質稱為“抗萎銹靈蛋白”。抗萎銹靈多核苷酸和抗萎銹靈蛋白的序列分別顯示于如下SEQ ID NO :1和2中SEQ ID NOjIATGCAGTCCGTCGCCCGTCGTTTCTCTGCCGCCGCCGTGCGCCGTAGCTTTTCTACCACTTCTGTCGCG TTCCAGGCTACACCGCTCGAGAAGCCCGTGCTGAACAAGGAATTCAAGATTTACCGCTGGAATCCTGATGAGCCGGA GAAGAAACCGACGCTACAGAGCTACATAATCGACCTGAACCAGACAGGGCCAATGATTCTGGATGCTCTCATCAAGATTAAAAACGAAATCGACCCTACGCTTACCTTCAGACGAAGTTGTCGCGAGGGCATTTGCGGATCTTGTGCGAGAAAA ATCGACGGGCAGAACACGTTGGCCTGTCTCTGCAGGATTGATAGGAATGCTGGGAAGGATTCGAAGATCTATCCCTT ACCACACAGTGAGTGTCTCATCTGAGCTCTGCGTATCTGAGTGCTAACTTAGATTCCAGTGTACATCGTCAAGGACC TCGTACCGGATCTCACCTACTTCTACAAGCAGTACAAGTCTATCCAACCATACCTTCAGAACGACAACCCACCTGCG TCAGGTCTGTTCATTATTTTGCACCCTCCCCTTTGCTCGGCTTACCGAATCGCTTCTAGGTGAATTCCTCCAAACGC AAGATGACCGCAAGAAGCTCGACGGACTCTACGAGTGTATCCTTTGCGCGTGTTGTTCGACGTCTTGCCCTTCGTAT TGGTGGAACCAAGAC GAATACCTTGGACCCGCTACTTTGATGCAAGCATATCGCTGGATCGCCGACTCGAGAGTAC GTTCTGCTCGTCGTATCATGTTTTATCTCATACTGATATACTCTTAGGACTCTTATGCCGCAGAACGCAAGGAAAAG CTCCAAAACGAGATGAGCATGTACCGATGCCTCACTATCTTCAACTGCTCGCGGACATGCCCCAAGGGTCTCAACCC CGCTGCCGCCATCGCGAAAATCAAGCTTGAGCTTGCGGCCGAGTAASEQ ID NO 2MQSVARRFSAAAVRRSFSTTSVAFQATPLEKPVLNKEFKIYRWNPDEPEKKPTLQSYIIDLNQTGPMIL DALIKIKNEIDPTLTFRRSCREGICGSCARKIDGQNTLACLCRIDRNAGKDSKIYPLPHMYIVKDLVPDLTYFYKQY KSIQPYLQNDNPPASGEFLQTQDDRKKLDGLYECILCACCSTSCPSYWWNQDEYLGPATLMQAYRWIADSRDSYAAE RKEKLQNEMSMYRCLTIFNC SRTCPKGLNPAAAIAKIKLELAAE根據本發明，可通過所屬領域的技術人員所了解的任一方法來實施點突變。例如， 可通過使用誘變原(例如來自紫外射線、X-射線或極熱的輻射)、化學品(使堿基對錯位或破壞DNA的螺旋形狀的分子)、定點誘變或市售點突變試劑盒來實施點突變。根據本發明的一個優選實施例，定點誘變或點突變試劑盒是實施點突變時的一種可選方案。因此，本發明的經分離的抗萎銹靈多核苷酸包括編碼在(A)或(B)中所界定的蛋白質的多核苷酸(A)具有氨基酸序列SEQ ID NO :2的蛋白質，(B)具有包括1_20個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列SEQ ID NO :2且具有抗萎銹靈活性的蛋白質。本發明還提供包含本發明多核苷酸的表達載體。此外，本發明還提供包含本發明表達載體的宿主細胞。本發明表達載體包含本發明DNA序列的所選DNA以在適宜宿主中表達。所述DNA 在載體中可操作地連接至重組DNA分子中的表達控制序列，由此可表達正常或突變蛋白。 表達控制序列可選自由控制原核或真核細胞和其病毒和其組合的基因表達的序列組成的群組。表達控制序列可選自由下列組成的群組lac系統；trp系統；tac系統；trc系統； λ噬菌體的主要操縱基因和啟動子區域；fd外殼蛋白的控制區域；SV40的早期和晚期啟動子；衍生自多瘤病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒、猿猴病毒的啟動子；3-磷酸甘油酸酯激酶啟動子；酵母酸性磷酸酶啟動子；酵母α -交配因子；和其組合。打算用本發明載體轉染的宿主細胞可以來自選自由酵母、真菌、昆蟲、小鼠或其它動物或植物宿主組成的群組的宿主，或者可以是人類組織細胞。對于突變DNA序列來說，使用相似系統來表達和產生突變蛋白。本發明的抗萎銹靈基因給予金針菇抗萎銹靈的抗性。此外，金針菇的突變的抗萎銹靈基因將提供用于研究轉化載體的潛在有價值的可選標記。實例實例1克隆金針菇的全長萎銹靈(Cbr)基因序列DNA的提取
將金針菇的菌絲體使用50ml含有麥芽提取物的蛋白質液體培養基在25°C下培養三周。使用無菌水洗滌所得菌絲體，并隨后凍干以除去水。將菌絲體在液氮下研磨成粉末。 將50mg干燥菌絲體粉末添加至600 μ 1裂解緩沖液中，并隨后添加600 μ 1 PCI (苯酚氯仿異戊醇=25 24 1)以除去蛋白質和雜質。取出水層，并添加3Μ乙酸鈉和異丙醇， 由此使DNA沉淀。用70%的冰冷的醇將DNA沉淀物洗滌數次。在醇揮發后，在37°C下向DNA 沉淀物中添加100 μ 1 TE緩沖液和RNA酶。反應1小時后，添加100 μ 1氯仿并取出水層。 向所得水層中添加3Μ乙酸鈉和異丙醇以再次使DNA沉淀。將沉淀的DNA溶解于100 μ 1無菌水中，并于低于-20°C的溫度下儲存。克隆金針菇的Cbr使用簡并引物Cbr2F(5' -ggCATTTgCggATCTTgTgCgAgAAA ；SEQ ID NO :5)禾口 Cbr2 R(5' -ACAACACgCgCAAAggATACACTCgTA ；SEQ ID NO :6)來實施簡并 PCR，且 PCR 反應條件如
下
初始變性溫度和時間95°C，2分鐘變性溫度和時間95°C，1分鐘復性溫度和時間40°C，30秒k 35個循環
延伸溫度和時間72°C，1.5分鐘最終延伸溫度72°C，10分鐘通過在瓊脂糖凝膠上實施電泳對擴增的PCR產物進行分析。取400個堿基對(bp) 的條帶并使用凱杰^iagen) PCR純化試劑盒進行純化。通過TA克隆將所得DNA保存于yT&A 載體中，并隨后轉化至大腸桿菌(E.Coli)DH5a中。對所得DNA實施測序以識別部分Cbr 序列。序列的比較和擴增序列的克隆比較所得基因序列并通過生物編輯器(BioEdit)軟件第7. 0. 0版(宜必思治療 (IbisTherapeutics)，卡爾斯巴德(Carlskid)，加利福尼亞(CA))進行分析。利用基因組步移方法來識別全長Cbr序列(核酸研究(Nucleic Acids Research)，2000，第28卷，第 11期，e55)。由上文所述的七種限制酶剪切染色體DNA，并隨后連接具有相同限制酶切位點的銜接子。根據部分Cbr序列，設計基因特異性引物，且使用其與和銜接子序列互補的 MKP24引物的組合通過PCR來靶向未知的片段序列。在模板DNA的制備中使用七種限制酶BamHI、EcoRI, Hindlll、KpnI, PvuII, PstI和)(bal。在模板制備中使用銜接子引物MK P22(5‘ -GCGCTGCAGGCATGCGAGCTCCCAAGCTTGATCG ；SEQ ID NO7)、MKP23(5‘ -AATTCGATCA AGCTTGGGAGCTCGCATGCCTGCAGCGC ；SEQ ID NO 8)和 MKP24(5' -GCGCTGCAGGCATGCGAGCTG ； SEQ ID NO :9)。通過煮沸兩種引物MKP22和MKP23的IOOmM溶液、隨后緩慢冷卻至室溫來實施所述引物的復性以形成雙鏈寡-盒(oligo-cassette)MKDl。引物由GAT哥本哈根Aps (GATCopenhagen Aps)(共生生物(Symbion)，哥本哈根(Copenhagen)，丹麥(Denmark))提供。構建寡-盒文庫時，使經EcoRI消化的染色體DNA以10倍于MKDl寡-盒的摩爾過量連接至MKDl寡-盒，并隨后對連接產物實施柱純化，其中移除未結合的盒DNA(GFXTM PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒，阿默舍姆法瑪西亞生物技術(AmershamPharmacia Biotech)， 赫斯霍爾姆(H0rsholm)，丹麥(Denmark))。合成跨越MKDl上的&icI-PstI區的寡-盒特異性引物MKP24，以對連接至寡-盒的DNA進行擴增。在使用HindIII消化MKDl并使用牛腸磷酸酶去磷酸化后，構建HindIII特異性寡-盒MKD3。以5’至3’方向實施基因組步移以靶向全長Cbr序列。金針菇的Cbr序列的分析通過生物編輯器(BioEdit)第7. 0. 2版實施所得Cbr序列的比對和分析，并使用 NCBI數據庫來測定Cbr序列與其蛋白質之間的相似性。Cbr序列顯示于SEQ ID N0:3中。實例2金針菇的Cbr序列的點突變使用AMV載體來表達Cbr序列，所述AMV載體具有雙孢蘑菇的GPD啟動子且是由本案的申請者研發。使用 CbrFv9FB (5 ‘ -cgggatccGATGCAGTCCGTCGCCCGTC ；SEQ ID NO 10) /C brFvlORs(5' -ggactagtTTTGCTTACTCGGCCGCAAG ；SEQ ID NO 11)引物對來擴增全長Cbr序列，由此Cbr序列具有BamH I和Spe I限制酶切位點。對所得序列進行測序并通過TA克隆予以證實。由BamH I和Spe I剪切保存于yT&A載體(圖1A)中的全長Cbr序列以獲得FvCbr。 在AMV (圖1A)載體也被BamH I和Spe I剪切后，使Cbr序列連接至AMV載體中的對應位點。將包括Cbr序列和GPD啟動子的載體稱為“FvCbrAMV”(圖IB)。使用 CbrFvl IFD (5 ‘ -cgagatgagcatgtaccgatgccTcactatcttc ；SEQ ID NO 12)/C brFvl4Rd(5' -gaagatagtgAggcatcggtacatgctcatctcgttttg ；SEQ ID NO 13)弓丨物對禾口快速變化(QuikChange) 定點誘變試劑盒來實施Cbr序列的點突變。對突變序列進行測序以證實點突變，并將包含突變體Cbr序列的載體(AMV+mCbr)稱為“mFvCbrAMV”。上述突變序列顯示于SEQ ID NO :1中。實例3測試Cbr序列的功能用于表達突變體Cbr序列的載體是含有GPD啟動子(pGPD)和潮霉素抗性(hyg) 標記的pMush-A載體。此pMush-A載體顯示于圖2A中。分別使用BamH I和Spe I來剪切保存于mFvCbrAMV載體(圖1B)和pMush-A載體中的突變體Cbr序列。使用T4DNA連接酶使突變體Cbr序列(mFvCbr)連接至pMush-A載體的對應位點。將所構建的載體稱為 pMush-A-mFvCbr (圖 2B)。將金針菇的菌絲體在PDB培養基中于25°C下培養1-2周。用均質機破壞所得菌絲體，并隨后用含有裂解酶(西格瑪(Sigma)，圣路易斯(M.Louis)，密蘇里州(MO)，美國 (U. S. A.))、甘露醇和磷酸鉀緩沖液的裂解酶溶液進行處理。將所得的菌絲體片段溶解于 100 μ 1電穿孔緩沖溶液中以在電穿孔中用作感受態細胞。將準備充分的感受態細胞添加至自實例2獲得的突變體Cbr DNA溶液中，并隨后置于冰上保持10分鐘。使用電子細胞處理器(Electro Cell Manipulator) ECM 630 電穿孔系統(BTX，圣地亞哥(San Diego)，加利福尼亞(CA)，美國)對所得溶液實施電穿孔以獲得經轉化的菌絲體。將所得的菌絲體溶液鋪板于含有2 μ g/ml萎銹靈和0. 6M甘露醇的PDA板培養基中且在25°C下以進行選擇。選出10株經轉化菌株并在含有2mg/ml萎銹靈的PDA板培養基中培養一周。四株菌株在PDA 板培養基中生長，表明這些菌株具有本發明的突變體Cbr DNA。這些菌株的生長證明本發明的突變體Cbr DNA已成功地轉化和表達。提取所述菌株的基因組DNA并使用Hyg引物進行擴增。使用不含Hyg標記的野生型金針菇作為陰性對照。如圖3的電泳圖中所顯示，出現1320個堿基對的片段，因此所轉化的菌株含有抗-Hyg序列。此結果證明，所述菌株含有p-MUSH-A-mFvCbr序列且已被本發明的Cbr突變體成功地轉化。
權利要求
1.一種經分離的抗萎銹靈(carboxin)多核苷酸，其編碼在(A)或(B)中所界定的蛋白質(A)具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白質，(B)具有包括1_20個氨基酸殘基的取代、 缺失、插入或添加的氨基酸序列SEQ ID NO :2且具有抗萎銹靈活性的蛋白質。
2.如權利要求1所述的經分離的抗萎銹靈多核苷酸，其可在嚴格條件下與和具有SEQ ID NO :1的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列雜交，且其編碼具有抗萎銹靈活性的蛋白質。
3.如權利要求2所述的經分離的抗萎銹靈多核苷酸，其中所述雜交在高度嚴格條件下發生。
4.如權利要求1所述的經分離的抗萎銹靈多核苷酸，其具有如SEQID NO :1中所顯示的序列。
5.一種抗萎銹靈蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :2，和其具有抗萎銹靈活性的變體。
6.如權利要求5所述的抗萎銹靈蛋白，其中所述變體是具有包括1-20個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列SEQ ID NO :2且具有抗萎銹靈活性的蛋白質。
7.如權利要求5所述的抗萎銹靈蛋白，其具有氨基酸序列SEQID NO :2。
8.—種表達載體，其包含如權利要求1所述的多核苷酸。
9.一種宿主細胞，其包含如權利要求8所述的表達載體。
全文摘要
本發明涉及在抗萎銹靈(carboxin)的金針菇(Flammulina velutipes)中表達的多核苷酸序列和由其編碼的蛋白質。本發明還提供包含本發明多核苷酸的表達載體和宿主細胞。
文檔編號C12N15/63GK102212532SQ20101014687
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月1日 優先權日2010年4月1日
發明者謝秀欣 申請人:蘑法生物科技股份有限公司